自制花椒調味油中11種真菌毒素的研究分析

蔣孟圓，劉曉松，胡琳，馬曉年，歐利華，張秀清，李文廷*

(1.云南民族大學民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室, 昆明 650500；2.昆明市疾病預防控制中心, 昆明 650228)

花椒為蕓香科(Rutaceae)花椒屬(ZanthoxylumL.)植物, 既是一種常用的食品調味料，被譽為“八大調味品”之一，又是一味傳統(tǒng)中藥[1]，含有多種對人體有益的活性成分，具有抑菌[2]、麻醉和興奮[3]、抑制血小板凝集、抗氧化等多種作用[4]，有較好的臨床應用價值和研發(fā)潛力[5-7]。《本草綱目》記載花椒具有“散寒除濕、解郁結、消宿食、通三焦、溫脾胃、補右腎命門、殺蛔蟲、止泄瀉”的作用[8]?！吨腥A人民共和國藥典》記載花椒具有“溫中止痛, 殺蟲止癢”的作用?；ń穼μ烤覘U菌等10 種革蘭氏陽性菌以及大腸桿菌等腸內致病菌均有明顯的抑制作用,在油脂中加入定量的花椒油對人體具有一定的保健作用, 對食品也起到一定的防腐抗菌作用[9]，從而可提高產品的儲藏效果[10,11]。

真菌毒素是由真菌產生的具有毒性的次生代謝物[12]，可引起動物急性、亞急性和慢性中毒，其中某些真菌毒素具有致畸、致癌、致突變特性的嚴重影響[13]，其在食品中的污染問題，已經成為世界各國及有關國際組織關注的重點[14]。目前, 國內外對花椒的化學成分[15,16]、藥理作用以及提取工藝有較深入的研究，而對其穩(wěn)定性的研究甚少，由于花椒及其油檢測標準的不合理性，導致了重金屬、農藥殘留和黃曲霉毒素等項目的監(jiān)測不足[17]。在抑菌活性測試中，花椒油在4 μL/mL時仍有桔青霉菌生長[18]，花椒中黑曲霉的檢出率達到40%[19]，花椒在收獲、加工以及儲運過程中容易受到多種真菌以及真菌毒素的污染，在日常生活中，自制花椒油中也經常會出現霉變現象。為此，本研究主要對花椒油在存儲及食用過程中是否產生真菌毒素進行研究分析。

近年來，在谷物、蔬菜、水果、畜牧產品以及中藥材中均發(fā)現了真菌毒素的存在。檢測真菌毒素的方法主要有薄層色譜法、酶聯免疫吸附法、氣相色譜法、免疫親和柱凈化高效液相色譜法，均檢測單一類的真菌毒素[20-23]。液相色譜-串聯質譜法具有較高的靈敏度和較好的準確度，逐漸成為同時檢測多種真菌毒素的主要方法，本研究將樣品前處理方法便捷化，通過脫氧雪腐鐮刀菌烯醇同位素內標物的內標法和各真菌毒素的外標法結合定量，采取負離子掃描模式，建立超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測自制花椒油中11種真菌毒素的分析方法，為花椒油的健康食用提供安全保障。

1 材料與方法

1.1 儀器

1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀 美國Agilent Technologies公司；串聯QTRAP 4500質譜聯用儀(配有電噴霧離子源) 美國AB SCIEX公司；XS205DU 型分析天平(十萬分之一) 瑞士Mettler Toledo公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Arium Pro D1純水處理終端機 德國Sartorius公司；Pribofast M226 多功能凈化柱 美國Pribolab公司；3H16RI型智能臺式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 試劑

11種標準品: 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、3-乙酰化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-ADON)、15-乙?；撗跹└牭毒┐?15-ADON)、伏馬毒素B1(FB1)、伏馬毒素B2(FB2)、伏馬毒素B3(FB3)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)、玉米赤霉烯酮(ZEN)及13C-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇同位素：均購自美國Pribolab公司; 質控樣：購自美國Romer Labs Diagnostic GmbH公司; 甲醇、乙腈：均購自美國Sigma-Aldrich 公司;實驗中所用水為去離子水。

1.3 實驗材料

花椒油樣品：均為日常生活中食用的自制花椒油?；ń酚偷淖龇ǎ簩①徸赞r貿市場的新鮮或干燥的花椒直接放入70 ℃的植物油內浸泡放置，食用時間最長的花椒油樣品為24個月。

1.4 實驗方法

1.4.1 標準溶液的配制

用甲醇分別將11種真菌毒素的單一標準溶液稀釋為1 μg/mL的混合標準儲備液,13C-ADON稀釋為250 μg/L的標準儲備液, 依據11種真菌毒素在質譜MRM模式下響應程度的不同, 將其配制成不同濃度的混標溶液, 使用時用流動相的初始比例溶液配制系列標準工作液, 每個標準工作液中均含有20 μL13C-ADON的內標物質。

1.4.2 樣品溶液的制備

精確稱取花椒油樣品5.0 g,置于50 mL具塞樣品管中,加15 mL 70%甲醇水溶液,超聲提取1 h,離心5 min (10000 r/min),取5 mL上清液通過M226多功能凈化柱凈化。準確量取2 mL凈化后的溶液,用氮吹儀濃縮近干,用流動相初始比例溶液溶解并定容至1 mL,經0.22 μm微孔濾膜過濾,供儀器備用。

1.4.3 液相色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm),柱溫為40 ℃,流動相為乙腈(A)+0.2%氨水溶液(B),流速為0.3 mL/min，進樣體積為5 μL,檢測分析時間為6.0 min。

1.4.4 質譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)，溫度: 550 ℃；離子噴霧電壓(ionspray voltage)：-4500.0 V；氣簾氣(curtain gas):25 psi；霧化氣(gas 1)：55 psi；輔助氣(gas 2)：55 psi；負離子掃描模式；多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式進行檢測。將分別配制成250 μg/L的12種真菌毒素甲醇溶液在流動注射狀態(tài)下，通過Q1 MS全掃描模式得到各真菌毒素的母離子(M1-)m/z，Product Ion Scan(MS2)碎片離子掃描模式得到次級碎片離子信息,采取峰值較高的2個碎片離子作為定量離子和定性離子,對質譜中與檢測化合物相關的參數通過MRM掃描模式進行優(yōu)化，詳細參數見表1。

表1 12種真菌毒素的質譜參數Table 1 Mass spectrum parameters for 12 kinds of mycotoxins

續(xù) 表

注：“*”為定量離子。

2 結果與分析

2.1 流動相種類和比例的選擇

本研究考察了流動相分別為乙腈-水、甲醇-水、甲醇-氨水和乙腈-氨水的實驗, 實驗結果表明：以乙腈(A)-0.2%氨水(B)作為流動相進行梯度洗脫，具有較高的質譜信號響應, 峰形對稱，結果較為理想，梯度洗脫程序為:0～0.5 min，95% B～70% B;0.5～3.0 min，70% B～40% B; 3.0～3.5 min，40% B～5% B; 3.5～4.5 min，5% B; 4.5～5.0 min，5% B～80% B; 6.0 min，95% B。依據最佳優(yōu)化實驗條件下得到11種真菌毒素的MRM色譜圖，總離子圖見圖1，其余各真菌毒素的碎片離子圖見圖2。

圖1 11種真菌毒素的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 11 kinds of mycotoxins

圖2 11種真菌毒素的碎片離子MRM色譜圖Fig.2 MRM fragment ion chromatogram of 11 kinds of mycotoxins

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系考察

依據在質譜MRM模式下響應程度的不同，將11種真菌毒素標準物質配制為不同濃度范圍的混合標準溶液，以定量離子峰的峰面積為縱坐標，以質量濃度(μg/L)為橫坐標繪制標準曲線,線性參數見表2。

表2 11種真菌毒素的線性參數、檢出限及定量限Table 2 Linear parameters, limit of detections and limit of quantifications of 11 kinds of mycotoxins

2.2.2 檢出限及定量限

將真菌毒素混合溶液最低濃度點稀釋進行測定, 以3倍信噪比(S/N)對應的濃度計算檢出限(limit of detection, LOD)，10倍信噪比對應的濃度計算定量限(limit of quantity, LOQ)，具體實驗數據見表2。

2.2.3 加標回收率及精密度實驗

稱取18份5.0 g花椒油樣品，添加低、中、高3個質量濃度1.0，2.0，5.0 μg/kg的混合標準溶液進行加標回收實驗，每個濃度進行6個水平測定，按照1.4.2前處理條件進行處理并測定，并計算相對標準偏差，考察方法的精密度，11種真菌毒素的回收率為68.5%～102.5%，相對標準偏差為0.81%～6.87%，具體結果見表3。

表3 真菌毒素的加標回收率(n=6)Table 3 Recoveries of mycotoxins (n=6) %

2.2.4 穩(wěn)定性實驗

分別進樣5 μL放置0，5，10，24，48 h后的混合標準溶液,由峰面積計算相對標準偏差, 黃曲霉毒素B1為0.79%，黃曲霉毒素B2為0.68%，黃曲霉毒素G1為0.74%，黃曲霉毒素G2為0.81%，玉米赤霉烯酮為1.76%，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為1.89%，3-乙酰化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為2.21%，15-乙?；撗跹└牭毒┐紴?.34%，伏馬毒素B1為3.57%，伏馬毒素B2為3.64%，伏馬毒素B3為4.21%，實驗數據表明各真菌毒素在48 h內處于穩(wěn)定狀態(tài)。

2.2.5 準確度實驗

準確稱取5.0 g不同濃度的真菌毒素質控樣各3份，按照1.4.2前處理條件進行處理質控樣品，各真菌毒素的檢測值均在參考值允許范圍內，實驗數據表明樣品提取效率較高，實驗準確度良好，具體數據見表4。

表4 準確度數據Table 4 Accuracy data μg/kg

2.3 討論

2.3.1 提取液的選擇

本研究選擇甲醇、乙腈以及兩者的不同濃度水溶液作為提取液，通過標準溶液以及加標回收率的檢測實驗分析，結果表明使用70%的甲醇水具有較高的提取率，檢測結果較為理想。

2.3.2 基質效應的影響

采用甲醇溶液配制標準工作液以及采用花椒油樣品作為基質配制標準溶液，通過樣品處理后進行11種真菌毒素的檢測分析，實驗表明花椒油的基質效應對11種真菌毒素的檢測沒有較大影響。

2.3.3 樣品的凈化

本研究進行多功能凈化柱和0.22 μm濾頭直接過濾的凈化對比實驗，實驗結果表明：2種凈化實驗數據并無較大差別，信噪比結果一致，加標回收率結果沒有較大差異。對花椒油中11種真菌毒素的檢測可以選擇0.22 μm濾頭進行凈化操作，從而提高樣品的檢測效率，降低經濟成本。

3 結論

通過對食用不同時長的花椒油樣品進行實驗分析，均未檢測出11種真菌毒素，實驗數據表明：日常食用的自制花椒油在短期儲存內不易滋長已知的真菌毒素，在花椒油中浸泡的花椒雖然出現了白色的霉菌，但亦未檢出11種真菌毒素。花椒油雖然有抑菌作用，也未檢出常見的真菌毒素，但仍然會有其他細菌及真菌毒素如黑曲霉素的產生，因此為了食用的健康安全，要做好花椒油的存儲工作，出現霉變現象最好不要繼續(xù)食用。超高效液相色譜-串聯質譜法測定11種真菌毒素的方法具有較好的加標回收率，較高的準確度，前處理便捷，適用于花椒油中多種真菌毒素的快速檢測。