高脂飼料聯(lián)合結扎冠狀動脈左前降支探討冠心病痰瘀互結證大鼠模型的建立與評價*

王 朔，梁 如，許慧愚，馮 曼，王鵬偉，高樹明，李 琳，高 杉，潘 曄，于春泉

（天津中醫(yī)藥大學，天津 300193）

近年來，冠心病穩(wěn)定型心絞痛發(fā)病率及病死率逐年上升，成為威脅人類健康的主要疾病之一。研究表明，冠心病中醫(yī)證候要素已發(fā)生變化，其中以痰濁、血瘀居多，痰瘀互結的證候類型比例也呈現(xiàn)出逐步增高的趨勢[1-2]。目前尚無公認的冠心病痰瘀互結證大鼠模型制備方法。中醫(yī)藥治療冠心病痰瘀互結證的作用機制尚未明確。本研究根據(jù)中醫(yī)對于冠心病痰瘀互結證的認識，在高脂飼料喂養(yǎng)的基礎上聯(lián)合冠狀動脈左前降支結扎的方法模擬冠心病痰瘀互結證的病機演變過程，建立冠心病痰瘀互結證大鼠模型，對于中藥療效評價和中藥作用機制研究有重要價值。

1 材料

健康SPF級Wistar雄性大鼠115只，體質量（200±20）g，購于北京維通利華動物實驗中心[動物合格證編號：SCXK（京）2016-001]。高脂飼料由江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司提供（MD12017）。

小動物超聲影像系統(tǒng)vevo2100（加拿大），全自動生化分析儀（7020型）、日本數(shù)碼拍攝系統(tǒng)（Olympus DP71）、血小板分析儀（PL-11）、全自動血流變儀（SA-6000），水合氯醛（北京索萊寶科技有限公司）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶-MB型同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）檢測試劑盒（美國Sigma公司）。

2 方法

2.1 實驗分組及造模 實驗大鼠飼養(yǎng)于南開醫(yī)院實驗動物中心，飼養(yǎng)條件：溫度（24±1）℃，濕度（55%±5%）。實驗前適應性喂養(yǎng)1周，實驗期間保持自由飲水和進食。參照隨機數(shù)字表將115只大鼠隨機分為5組，分別為：空白組（15只）、假手術組（20只）、痰濁組（20只）、血瘀組（30只）、痰瘀互結組（30只）?？瞻捉M、假手術組及血瘀組采用普通飼料喂養(yǎng)8周，痰濁組及痰瘀互結組采用高脂飼料喂養(yǎng)8周。于第49天目內眥取血檢測血脂，剔除血脂水平未升高的大鼠。于第54天，對血瘀組和痰瘀互結組行冠狀動脈左前降支結扎術，假手術組行只穿線不結扎術。術后24 h，采用超高分辨率小動物超聲檢測大鼠心功能。其中，假手術組術中死亡2只，痰濁組飼養(yǎng)期間死亡2只，血瘀組術中死亡25只，痰瘀互結組術中死亡18只。剔除死亡及未符合標準的大鼠。術后保持原飼養(yǎng)條件至8周末進行取材。

2.2 檢測方法

2.2.1 一般狀態(tài)觀察 觀察并記錄各組大鼠舌色、活動情況、毛發(fā)光澤、飲食情況、小便顏色、大便性狀等情況。

2.2.2 超聲心動檢測方法 采用異氟烷麻醉，剃去胸部毛發(fā)，選用高頻矩陣探頭，探頭垂直于左胸壁，探查心臟沿二尖瓣口至心尖方向的左心室長軸像及短軸像。超聲檢測主要指標：左心室射血分數(shù)（EF）、左心室短軸縮短率（FS）、收縮末期室間隔厚度（IVSs）、收縮末期左心室后壁厚度（LVPWs）、收縮末期左心室內徑（LVIDs）、收縮末期左心室容積（LV Vols）、左心室質量（LV M）。

2.2.3 血脂變化檢測 第49天各組大鼠目內眥采血 1 mL，離心機離心（3 500 r/min，10 min），取血清，第56天各組大鼠腹主動脈取血（3 500 r/min，10 min），測定 TC、TG、LDL、HDL，具體操作參見試劑盒說明書。

2.2.4 心肌組織蘇木精-伊紅（HE）染色 將心臟組織置于10%中性緩沖福爾馬林固定，依次脫水，包埋，切片（5 μm），并進行HE染色。顯微鏡下對病理切片進行觀察。

2.2.5 心肌酶檢測 采用全自動生化分析儀對各組大鼠血清中心肌酶學指標（LDH、CK、CK-MB）進行檢測。

2.2.6 血液流變學檢測 采用肝素抗凝管取血5 mL，將血樣送往天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科檢測全血黏度、血漿黏度、血小板聚集率和最大血小板聚集率。

2.2.7 TTC染色 將心臟切片在1%的TTC染液中37℃孵育15 min，然后置于10%福爾馬林中固定，觀察TTC染色情況。

2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，進行正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗后，多組間比較使用單因素方差分析法（One-Way ANOVA），以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 一般狀態(tài)觀察 空白組、假手術組和血瘀組大鼠少有脫毛，皮下無異常，飲食規(guī)律?？瞻捉M和假手術組大鼠活動一般，精神較好。血瘀組大鼠結扎后活動度降低精神萎靡。痰濁組和痰瘀互結組大鼠出現(xiàn)明顯的厭食，精神狀態(tài)萎靡，毛發(fā)油膩、發(fā)黃，活動度降低。

空白組和假手術組大鼠唇色和舌色呈淡紅色，痰濁組大鼠唇色和舌色呈淡紫色，舌體胖大，血瘀組和痰瘀互結組大鼠唇色和舌色呈暗紫色，部分痰瘀互結組大鼠有明顯齒痕，見圖1。

圖1 各組大鼠舌色變化Fig.1 Changes in tongue color of rats in each group

3.2 心臟超聲檢測

3.2.1 心臟功能變化 與假手術組比較，痰濁組、血瘀組和痰瘀互結組 EF、FS顯著降低（P＜0.01）；與痰濁組比較，血瘀組和痰瘀互結組EF、FS顯著降低（P＜0.01），見表 1。

表1 各組大鼠心功能變化（±s）Tab.1 Changes in heart function of rats in each group（±s）%

表1 各組大鼠心功能變化（±s）Tab.1 Changes in heart function of rats in each group（±s）%

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與痰濁組比較，##P＜0.01。

組別 動物數(shù) EF FS空白組 15 84.61± 7.66 55.91± 9.38假手術組 18 88.20± 6.73 60.49±10.02痰濁組 18 55.80± 8.79** 29.76± 5.74**血瘀組 5 35.65± 5.93**## 17.21± 2.95**##痰瘀互結組 12 35.65±10.08**## 17.57± 5.31**##

3.2.2 左心室結構變化 與假手術組比較，痰濁組和痰瘀互結組舒張末期的室間隔厚度明顯降低（P＜0.01），痰濁組、血瘀組和痰瘀互結組收縮末期室間隔厚度、收縮末期后壁厚度顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），收縮末期內徑顯著增加（P＜0.01），見表 2。

表2 各組大鼠左心室結構變化（±s）Tab.2 Changes of left ventricle structure of rats in each group mm

表2 各組大鼠左心室結構變化（±s）Tab.2 Changes of left ventricle structure of rats in each group mm

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與痰濁組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與血瘀組比較，△P＜0.05。

組別 動物數(shù) IVSd IVSs LVIDs LVPWs空白組 15 2.11±0.30 3.58±0.39 2.78±0.72 3.25±0.64假手術組 18 2.37±0.47 3.83±0.51 1.99±0.67 3.44±0.29痰濁組 18 1.90±0.40** 2.45±0.32**3.83±0.24** 2.39±0.58**血瘀組 5 2.25±0.39 2.46±0.41**4.38±1.03** 2.77±0.45痰瘀互結組 12 1.74±0.34**△ 2.14±0.53**#4.82±1.08**##2.08±0.42**

3.2.3 左心室容積和質量的變化 與假手術組比較，痰濁組、血瘀組和痰瘀互結組收縮末期容積明顯增加（P＜0.01），痰濁組和痰瘀互結組左心室質量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。與痰濁組比較，痰瘀互結組收縮末期容積明顯增加（P＜0.01），見表3。

表3 各組大鼠左心室容積和質量的變化（±s）Tab.3 Changes in left ventricular volume and mass of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠左心室容積和質量的變化（±s）Tab.3 Changes in left ventricular volume and mass of rats in each group（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與痰濁組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數(shù) LV Vols（μL） LV M（mg）空白組 15 32.05±18.24 712.35±152.97假手術組 18 11.79± 8.00 719.43±176.60痰濁組 18 70.82±23.68** 550.18±135.19**血瘀組 5 92.17±49.09** 678.96±206.46痰瘀互結組 12 115.63±54.69**## 566.73±131.12*

3.3 血脂變化 與假手術組比較，痰濁組和痰瘀互結組大鼠 TC、LDL 均顯著增高（P＜0.01），HDL 顯著性降低（P<0.01）。與痰濁組比較，血瘀組大鼠TC、LDL均顯著降低（P＜0.01），HDL顯著性升高（P＜0.01）。與血瘀組比較，痰瘀互結組大鼠TC、LDL均顯著增高（P＜0.01），HDL 顯著性降低（P＜0.01），見表 4。

3.4 心肌酶變化 與假手術組比較，血瘀組和痰瘀互結組 CK、CK-MB、LDH 顯著升高（P＜0.01）。與痰濁組比較，血瘀組和痰瘀互結組大鼠CK、CK-MB、LDH 顯著升高（P＜0.01），見表 5。

表4 各組大鼠血脂變化（±s）Tab.4 Changes of blood lipid of rats in each group（±s）mmol/L

表4 各組大鼠血脂變化（±s）Tab.4 Changes of blood lipid of rats in each group（±s）mmol/L

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與痰濁組比較，##P＜0.01；與血瘀組比較，△△P＜0.01。

組別 動物數(shù) TC TG LDL HDL空白組 15 3.20± 0.91 0.72±0.13 2.06±0.50 0.73±0.18假手術組 18 3.42± 1.23 0.84±0.27 2.26±0.43 0.79±0.12痰濁組 18 25.68±10.29** 0.83±0.29 11.54±5.62** 0.47±0.26**血瘀組 5 3.40± 0.69## 0.76±0.19 1.98±0.28## 0.72±0.15##痰瘀互結組 12 21.15± 6.83**△△ 0.87±0.32 8.42±2.41**△△ 0.41±0.22**△△

表5 各組大鼠心肌酶變化（±s）Tab.5 Changes of myocardial enzymes of rats in each group（±s）U/L

表5 各組大鼠心肌酶變化（±s）Tab.5 Changes of myocardial enzymes of rats in each group（±s）U/L

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與痰濁組比較，##P＜0.01。

組別 動物數(shù) CK CK-MB LDH空白組 15 775.70±131.17 1 023.00±155.50 1 150.90±315.46假手術組 18 798.15±152.11 1 031.00±206.36 1 182.33±321.19痰濁組 18 964.77±168.33 965.00±223.86 1 138.92±323.91血瘀組 5 1 912.80±323.29**##2 037.00±255.42**##2 597.20±511.39**##痰瘀互結組 12 1 821.55±529.69**##1 943.64±351.93**##2 306.36±481.17**##

3.5 血液流變學變化 與假手術組比較，痰濁組和痰瘀互結組大鼠 BV1/s、BV5/s、BV30/s、BV200/s 和PV 顯著增高（P＜0.05或 P＜0.01），血瘀組大鼠 BV1/s、BV5/s和 BV30/s顯著增高（P＜0.05或 P＜0.01）。與痰濁 組 相 比 ， 血 瘀 組 大 鼠 BV1/s、BV5/s、BV30/s、BV200/s和 PV 明顯降低（P＜0.05或 P＜0.01），痰瘀互結組大鼠BV200/s和PV明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。與血瘀組相比，痰瘀互結組BV1/s和BV30/s明顯升高（P＜0.05或 P＜0.01），見表 6。

3.6 血小板聚集率和最大血小板聚集率變化 與假手術組比較，痰濁組和痰瘀互結組血小板聚集率和最大血小板聚集率明顯升高（P＜0.01）。與痰濁組比較，血瘀組和痰瘀互結組血小板聚集率和最大血小板聚集率明顯降低（P＜0.01）。與血瘀組比較，痰瘀互結組血小板聚集率和最大血小板聚集率明顯升高（P＜0.01），見表 7。

表6 各組大鼠血液流變學變化（±s）Tab.6 Changes in hemorheology of rats in each group（±s）mPa·s

表6 各組大鼠血液流變學變化（±s）Tab.6 Changes in hemorheology of rats in each group（±s）mPa·s

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與痰濁組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與血瘀組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 動物數(shù) BV 1/s BV 5/s BV 30/s BV 200/s PV空白組 15 52.38±7.49 19.43±2.58 9.36±1.12 6.24±0.69 1.20±0.04假手術組 18 50.96±6.55 20.19±2.23 10.26±1.48 7.23±1.43 1.27±0.06痰濁組 18 78.34±7.97** 26.60±2.98** 13.41±1.05** 10.32±2.39** 1.67±0.20**血瘀組 5 64.25±3.95**## 23.64±2.19**# 11.67±0.98*## 8.02±0.66## 1.32±0.02##痰瘀互結組 12 78.31±9.43**△△ 25.87±1.63** 13.04±0.72**△ 8.67±0.62*# 1.45±0.11**##

表7 各組大鼠血小板聚集率和最大血小板聚集率變化（±s）Tab.7 Changes in platelet aggregation and maximal platelet aggregation of ratsin each group（±s）%

表7 各組大鼠血小板聚集率和最大血小板聚集率變化（±s）Tab.7 Changes in platelet aggregation and maximal platelet aggregation of ratsin each group（±s）%

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與痰濁組比較，##P＜0.01；與血瘀組比較，△△P＜0.01。

組別 動物數(shù) PAR MPAR空白組 15 46.33± 1.88 59.02± 1.44假手術組 18 49.59±2.01 60.15±3.08痰濁組 18 78.54± 2.06** 88.49± 1.92**血瘀組 5 53.02± 2.42## 61.60± 2.45##痰瘀互結組 12 63.15±10.27**##△△ 70.62±10.97**##△△

3.7 心肌組織HE染色觀察 空白組大鼠心肌細胞完整，心肌纖維排列整齊、緊密，無明顯炎性細胞浸潤和水腫，無明顯病理異常。假手術組大鼠可見局部區(qū)域心肌細胞輕度水腫，痰濁組大鼠可見局部區(qū)域心肌細胞水腫及輕度脂肪樣變，未見明顯的炎細胞浸潤及壞死的心肌細胞。血瘀組大鼠心肌排列不規(guī)則，結構紊亂，間質水腫，大量炎性浸潤。痰瘀互結組大鼠心肌纖維斷裂，心肌纖維排列不規(guī)則，結構紊亂，肌纖維空隙較寬，間質水腫，大量炎性浸潤、壞死，見圖2。

圖2 各組大鼠心臟病理結構變化的影響（HE，×400）Fig.2 Effects of pathological changes of rats heart in each group(HE,×400)

3.8 TTC染色結果 空白組和假手術組心臟組織呈磚紅色，無明顯梗死，痰濁組、血瘀組和痰瘀互結組可見明顯白色梗死區(qū)域，見圖3。

4 小結

冠心病痰瘀互結證病機復雜，主要經歷由痰致瘀，痰瘀兼化，終致痰瘀互結的病理演變過程[3]。中醫(yī)學多認為“肥人多痰濕”，即恣食肥甘厚膩容易造成體內脂肪堆積，形成“痰濕”體質[4]。明代虞摶也認為：“津液黏稠，以痰為飲，積久滲入脈中，血之為濁（瘀）”，體內脂肪堆積，久之血脂升高，痰濁行于血脈，血液黏稠度增加，導致血流速度減緩，與冠心病痰瘀互結病機演變一致。

圖3 各組大鼠心臟組織TTC染色結果Fig.3 TTC staining results of rats heart tissue in each group

冠心病痰瘀互結證動物模型通過先建立高脂血癥模型，然后再予以冠狀動脈左前降支結扎術的方法，模擬“由痰致瘀，痰瘀兼化”的病理狀態(tài)，使動物同時具有“痰”和“瘀”的癥狀。血脂水平的異常與冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關[5]。膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白是血漿脂質的主要組成部分，也是臨床檢測血脂水平的常用指標。在進行高脂飼料喂養(yǎng)后，大鼠出現(xiàn)血脂異常，心臟HE切片可見細胞水腫及脂肪樣變等脂質沉積改變，可看作是“痰”的表現(xiàn)；心臟超聲、HE切片可見炎細胞浸潤、壞死及心肌纖維形態(tài)改變，可反映“瘀”的病理狀態(tài)。此外，心肌酶變化、TTC染色反映心臟缺血性損傷[6]，血流速度[7]改變、血小板聚集[8]反映血液的高凝狀態(tài)，是血栓形成，血管損傷的重要檢測指標，也是診斷冠心病的重要指征，故也可作為“瘀”的參考指標。

本次實驗研究的結果顯示，與假手術組大鼠比較，血瘀組和痰瘀互結組大鼠出現(xiàn)舌色紫暗，口唇顏色變深的癥狀，超聲結果顯示，兩組大鼠心功能均有明顯損傷，同時，兩組大鼠全血黏度和血漿黏度明顯升高，該類指標與冠心病血瘀證[9]的臨床表現(xiàn)一致，提示“血瘀”模型成功；痰濁組和痰瘀互結組大鼠出現(xiàn)舌體胖大，兩組大鼠活動度降低、嗜睡并伴有納呆表現(xiàn)，符合痰濕證的表現(xiàn)[10]，且檢測血脂發(fā)現(xiàn)兩組大鼠TC和LDL明顯升高，HDL明顯下降，出現(xiàn)血脂異常的脂代謝障礙表現(xiàn)，提示“痰濁”模型成功。痰瘀互結組大鼠心功能損傷明顯，同時伴有脂代謝異常表現(xiàn)，兼具“痰濁”及“血瘀”癥狀，且檢測指標多重于痰濁組及血瘀組，綜上，采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合冠狀動脈左前降支結扎的方法可建立冠心病痰瘀互結證大鼠模型。

然而本研究亦存在一定不足，雖然以高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合冠狀動脈左前降支結扎方法在證候方面表現(xiàn)出“痰濁”與“血瘀”的相關特征，但是相較于臨床上中醫(yī)證候特定的診斷標準仍無法完全對等，如中醫(yī)診斷冠心病[11]（胸痹、心痛）主要依據(jù)“胸脘痞滿”等患者的主觀癥狀，該癥狀在大鼠身上無法直接進行觀測；根據(jù)《痰濕證的臨床診斷標準》[12]，需具有“苔厚膩，脈滑”的表現(xiàn)，而大鼠舌苔，脈象還未能實現(xiàn)客觀化的定量與采集。這些客觀存在的問題還需在以后的研究中，借助多學科領域合作不斷改進與完善，并從多維度多層次對證候模型建立全面完整的評價體系。