蚓激酶提取純化工藝的研究進(jìn)展

董翔 王信營

【摘 要】蚓激酶，是一種常見的用于治療心腦血管疾病的藥物。它是從傳統(tǒng)中藥材蚯蚓發(fā)現(xiàn)的具有良好的活血、降血脂、降血粘的抗血栓活性物質(zhì)。它與血栓有特殊的親和力，能夠跟蹤溶栓，有效地溶解微栓，修復(fù)血管內(nèi)皮受損細(xì)胞。蚓激酶具有副作用小、安全性高、療效較顯著的優(yōu)勢，它具有很廣闊的市場前景。目前國內(nèi)對蚓激酶的提取分離工藝的研究很多，因此本文主要對蚓激酶的提取與分離純化工藝進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】蚓激酶；提?。环蛛x純化

蚯蚓，又稱地龍，環(huán)節(jié)動物門（Annelida），毛足綱（Chaetopoda），種類很多，僅在我國境內(nèi)就有200多種。在我國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)中，蚯蚓作為中藥具有解熱、定驚、利尿、降壓等功效，蚯蚓提取物中含有纖溶成分在我國古代醫(yī)藥文獻(xiàn)中早已有記載。

1982年，Mihara等自粉正蚓中提取出一組具有纖溶活性的酶，命名為蚓激酶（lumbrinonase）。此后國內(nèi)外對于蚓激酶的的分離純化、理化性質(zhì)、酶學(xué)活性和臨床藥效進(jìn)行了大量的研究。本文就其研究進(jìn)展作一綜述。

1 理化性質(zhì)

蚓激酶是一組相對分子質(zhì)量為18～42kD、pI3～5，具有纖溶酶活性的絲氨酸蛋白酶。它具有許多相似的特性：①熱穩(wěn)定性：在55℃以下放置1h，酶活力基本不變；超過60℃時，酶活力迅速下降；當(dāng)溫度達(dá)到70℃時，酶完全失活。②酸穩(wěn)定性：其作用的pH范圍較寬。在pH4～11活力變化很小，pH8～9時酶穩(wěn)定性最好，活力較高[1]。

2 粗酶液的提取

2.1蚯蚓的預(yù)處理

稱取蚯蚓，用自來水洗凈至無土塊和糞便，加入蚯蚓與食鹽比例為10：1濃度的食用鹽，觀察到蚯蚓吐出大量的黃色粘液，可除凈蚯蚓消化道的污物，攪拌10分鐘后蚯蚓便被殺死。

2.2粗酶液的提取方法研究進(jìn)展

2.2.1硫酸氨沉淀法

將已殺死的蚯蚓用清水清洗干凈后，經(jīng)組織勻漿機(jī)初勻后，加入等體積的pH7.80.02mol/L的Tris-HCl緩沖溶液（BufferA）于高壓勻漿器中再次勻漿，4℃下抽提過夜。4℃，4000r/min離心60min，棄沉淀。上清液于4℃下繼續(xù)保存直到有沉淀產(chǎn)生，再次4℃，4000r/min離心60min，棄沉淀，上清液經(jīng)30%硫酸銨沉淀后4℃，4000r/min離心60min，取上清液。上清液經(jīng)中空纖維超濾柱（MWCO為10kD）脫鹽、濃縮并將緩沖溶液置換為BufferA，即為粗酶液[2]。

黃訪[6]等采用了分段鹽析的方法進(jìn)行蚓激酶的提取，由于不同的蛋白質(zhì)的溶解度與等電點不同，沉淀時所需的離子強(qiáng)度也不同，改變鹽的濃度與溶液的pH值，可將混合液中的蛋白質(zhì)分批鹽析出來選擇第一次鹽析的最佳濃度為18.5%，35.9%作為第二次鹽析的濃度，進(jìn)而節(jié)省提取成本，提高所提取叫激酶的活性和純度。

2.2.2丙酮沉淀法

取鮮活蚯蚓用水洗凈后，勻漿，加冷丙酮攪勻后濾干制成蚯蚓丙酮粉，用一定量丙酮粉加pH7.8的0.05MTris-HCl緩沖液在5攝氏度下浸泡過夜，以15000r/min離心，得上清提取液[5]。

3 蚓激酶的分離純化研究進(jìn)展

3.1離子交換層析法

離子交換層析（IonExchangeChromatography簡稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。目前離子交換層析仍是生物化學(xué)領(lǐng)域中常用的一種層析方法，廣泛的應(yīng)用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。常用的離子交換劑有：離子交換纖維素、離子交換葡聚糖和離子交換樹脂。

應(yīng)國清[3]等選用DEAE-纖維素為純化蚓激酶的離子交換劑，以0.02mol/L，pH7.8磷酸緩沖液+0.5mol/LNaCI作為洗脫劑，蚓激酶純化效果較好。蚓激酶比活達(dá)3.25μ/mg，比口服用蚓激酶活力提高了3.6倍。

3.2親和柱色譜法

親和色譜也稱為親和層析，是一種利用固定相的結(jié)合特性來分離分子的色譜方法。親和色譜在凝膠過濾色譜柱上連接與待分離的物質(zhì)有一定結(jié)合能力的分子，并且它們的結(jié)合是可逆的，在改變流動相條件時二者還能相互分離。親和色譜可以用來從混合物中純化或濃縮某一分子，也可以用來去除或減少混合物中某一分子的含量。

施媚[4]等研究了酸性和堿性條件下對蚯蚓纖溶酶的純化效果。實驗表明經(jīng)殼聚糖為載體所制備的親和吸附劑對蚓激酶具有較高的分離純化選擇性，并且在酸性條件下提取比在堿性條件下提取所得同工酶要少。

4 展望

蚓激酶目前在臨床上主要是各種膠囊制劑，如普恩復(fù)、百奧、博洛克、溶栓膠囊等，由蚯蚓纖溶酶做成的口服制劑也有很多種，但在如何更好地發(fā)揮藥效方面研究不多，而注射劑還沒問世。蚓激酶作為外源蛋白質(zhì)可能對人體產(chǎn)生免疫原性，而分子量小的組分對人體的免疫原性可能會低些，所以有必要分離純化低分子組分，為注射劑的研制開發(fā)打下基礎(chǔ)。蚯蚓纖溶酶可以直接由腸上皮吸收，是一種具有“穿腸而過”功能的生物大分子。所以，纖溶酶口服制劑宜制成腸溶型。

參考文獻(xiàn)

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[2]周海，王春維，張怡，等.蚓激酶的提取純化及性質(zhì)研究[J].中國生化藥物雜志，2011，3（32）：213-214.

[3]應(yīng)國清，許建議.離子交換層析法分離純化繃激酶的研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998，6（26）：125-126.

[4]施媚，何執(zhí)中.以殼聚糖為基質(zhì)對蚯蚓纖溶酶進(jìn)行親和層析[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，1（30）：65-66.

[5]涂清波，陸冬鶯，林穎，等.正交試驗法優(yōu)選蚓激酶提取工藝研究[J].中國民族民間醫(yī)藥，2017，22（26）：16-17.

[6]黃訪，王紅，李維尊，等.一種蚯蚓中蚓激酶高效提取的方法[P].中國專利：CN105907738A，2016-08-31.

作者簡介：

董翔（1997.3-）女，漢族，籍貫山東省青島市，本科 在讀學(xué)生。