虹鱒魚傳染性造血器官壞死?。↖HN）基因工程疫苗免疫效果分析

靳玉樓，王廷寬，吳鵬程，高大珍

（蘭州市漁業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅 蘭州 730030）

虹鱒魚養(yǎng)殖區(qū)域分布廣泛，是全球重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一。2019年全球虹鱒魚養(yǎng)殖產(chǎn)量為916 540 t，產(chǎn)值達(dá)41.55億美元[1]。我國(guó)引進(jìn)虹鱒魚養(yǎng)殖已有60多年，2020年全國(guó)虹鱒魚養(yǎng)殖產(chǎn)量為37 841 t，養(yǎng)殖規(guī)模較大的地區(qū)為青海、云南、遼寧、新疆、甘肅、重慶[2]。

傳染性造血器官壞死?。↖nfectious hematopoietic necrosis，IHN）是由傳染性造血器官壞死病病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）引起，主要危害鮭科魚類，是死亡率較高的魚類病毒病。該病于1985年在我國(guó)東北地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)［3-6］。

2009年因從外省引進(jìn)攜帶IHNV的發(fā)眼卵，使得傳染性造血器官壞死病在甘肅省暴發(fā)性流行，對(duì)甘肅省虹鱒魚產(chǎn)業(yè)造成毀滅性打擊。2010年甘肅省鱒魚養(yǎng)殖產(chǎn)量?jī)H為722 t，較2008年的1 312 t減少45%［7-8］，尤其對(duì)永登縣的養(yǎng)鱒業(yè)造成了毀滅性打擊，使得絕大多數(shù)虹鱒魚養(yǎng)殖場(chǎng)處于停產(chǎn)狀態(tài)。

目前，防控IHN的主要有效手段是疫苗免疫。國(guó)外研究人員通過不同方式制備了多種類型的IHN疫苗[9-12］，尤其是加拿大研究人員研制的DNA疫苗已經(jīng)獲得商業(yè)化批準(zhǔn)[13]。我國(guó)研究人員對(duì)國(guó)內(nèi)的IHN病毒做了系統(tǒng)研究，研制出了相應(yīng)疫苗，并通過注射、口服等方式對(duì)疫苗的免疫效果進(jìn)行研究[14-18]。但目前關(guān)于浸泡免疫的研究報(bào)道不多，因此本試驗(yàn)在成功研制IHN疫苗的基礎(chǔ)上，以開展免疫浸泡試驗(yàn)和攻毒效果觀察試驗(yàn)為主要內(nèi)容，對(duì)研制的虹鱒魚傳染性造血器官壞死?。↖HN）基因工程疫苗免疫效果進(jìn)行分析，探索虹鱒魚傳染性造血器官壞死病的免疫防控措施。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)疫苗

本試驗(yàn)所用IHN疫苗是由蘭州市威特森生物科技有限公司、蘭州市漁業(yè)技術(shù)推廣中心聯(lián)合研制的相對(duì)有效的基因工程苗制品[19-20]。

1.2 虹鱒魚苗

本試驗(yàn)中的虹鱒魚苗均采購(gòu)自黑龍江省國(guó)家級(jí)虹鱒魚良種場(chǎng)，所有魚苗均由經(jīng)檢疫不攜帶虹鱒魚傳染性造血器官壞死病病毒的虹鱒魚卵孵化而來。

1.3 疫苗接種方法

1.3.1 注射接種 在虹鱒魚苗背鰭下方肌肉豐滿處，順著鱗片刺入肌肉0.2～0.5 cm注射疫苗，以疫苗注射魚體不傷及內(nèi)臟為準(zhǔn)。注射時(shí)要防止針頭夾帶鱗片插入魚體內(nèi)。

1.3.2 浸泡接種 將虹鱒魚苗放到含有一定濃度疫苗的溶液中浸泡一定時(shí)間，以達(dá)到對(duì)魚體進(jìn)行免疫的目的。浸泡期間要不斷泵入空氣或氧氣以免缺氧。

1.4 統(tǒng)計(jì)結(jié)果

根據(jù)攻毒苗種總數(shù)和死亡苗種總數(shù)，計(jì)算攻毒成活率。公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 攻毒試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 對(duì)照試驗(yàn)情況 2020年6月16日，永登縣誼源漁場(chǎng)從景泰縣虹鱒魚養(yǎng)殖場(chǎng)購(gòu)買未免疫虹鱒魚苗8 000尾，作為試驗(yàn)對(duì)照組。根據(jù)表1結(jié)果顯示未免疫虹鱒魚苗攻毒成活率僅3.75%，說明IHN對(duì)未經(jīng)免疫的虹鱒魚苗危害性極大，對(duì)魚類養(yǎng)殖危害極大。

表1 虹鱒魚苗成活情況（對(duì)照組）

2.1.2 2018年試驗(yàn)情況 將2018年3月16日進(jìn)行二次浸泡免疫的虹鱒魚苗種（在永登縣鑫維養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行免疫處理）投放到不同地區(qū)的4家養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，詳見表2。結(jié)果顯示：4家養(yǎng)殖場(chǎng)中經(jīng)二次浸泡免疫后的虹鱒魚苗攻毒成活率在69.7%～93.7%之間，平均攻毒成活率達(dá)81.3%，說明經(jīng)二次浸泡免疫后虹鱒魚在IHN疫區(qū)成活率明顯提高，免疫效果顯著。

表2 虹鱒魚苗成活情況（2018年試驗(yàn)）

2.1.3 2019年試驗(yàn)情況 將2019年8月13日進(jìn)行二次浸泡免疫的虹鱒魚苗種（在甘肅土著魚類養(yǎng)殖開發(fā)有限公司進(jìn)行免疫處理）分別投放到永登縣6家養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，詳見表3。結(jié)果顯示：除美味源養(yǎng)殖場(chǎng)外，其他5家養(yǎng)殖場(chǎng)中經(jīng)第二次浸泡免疫的虹鱒魚苗攻毒成活率均在80%以上，平均成活率達(dá)85.3%，說明經(jīng)二次浸泡免疫后，虹鱒魚苗對(duì)IHN的抵抗力增高，抗病能力明顯增強(qiáng)。

表3 虹鱒魚苗成活情況（2019年試驗(yàn)）

2.1.4 2020年試驗(yàn)情況 將2020年8月18日進(jìn)行二次浸泡免疫的虹鱒魚苗種（在甘肅土著魚類養(yǎng)殖開發(fā)有限公司進(jìn)行免疫處理）分別投放到2家養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，詳見表4。結(jié)果顯示：在土著魚類養(yǎng)殖開發(fā)有限公司1號(hào)池塘、2號(hào)池塘和永登縣誼源漁場(chǎng)中經(jīng)二次浸泡免疫的虹鱒魚苗攻毒成活率分別為95%、90%和80.4%，平均成活率達(dá)88.5%，與對(duì)照相比成活效果顯著。

表4 虹鱒魚苗成活情況（2020年試驗(yàn)）

2.1.5 浸泡免疫結(jié)果總結(jié) 通過3年的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)（2018—2020年），與對(duì)照組相比，經(jīng)二次免疫后虹鱒魚苗成活率從3.75%提高到80%以上，魚苗對(duì)IHN的抗病性均顯著增強(qiáng)，說明由蘭州市威特森生物科技有限公司和蘭州市漁業(yè)技術(shù)推廣中心聯(lián)合研制的IHN疫苗對(duì)IHN具有很強(qiáng)的免疫效果，可顯著降低魚苗在IHN疫區(qū)的死亡率，值得廣泛推廣。

2.2 試驗(yàn)總結(jié)及要點(diǎn)分析

2.2.1 注射與浸泡兩種免疫方法的選擇 2016年在永登縣鑫維養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)1 200尾平均規(guī)格為25 g的虹鱒魚苗進(jìn)行注射免疫，并轉(zhuǎn)移至永登縣誼源漁場(chǎng)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。結(jié)果表明注射免疫試驗(yàn)效果良好，攻毒試驗(yàn)場(chǎng)虹鱒魚苗成活率穩(wěn)定在95%以上，但注射難度太大，需要專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行免疫操作，同時(shí)由于缺氧、注射人員操作不當(dāng)?shù)仍驑O易對(duì)魚苗造成傷害，使魚苗大量死亡，因此不適宜大面積推廣。從2018年起，采用基因工程苗浸泡免疫的方法對(duì)不同規(guī)格的苗種進(jìn)行二次浸泡免疫試驗(yàn)。將免疫后的魚苗投放到不同區(qū)域的養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)浸泡免疫魚苗平均成活率達(dá)80%以上，免疫效果良好。同時(shí)，浸泡免疫法可以對(duì)小規(guī)格虹鱒魚苗進(jìn)行免疫，對(duì)苗種的損耗相對(duì)較少，可進(jìn)行規(guī)?；僮?，因此在大型養(yǎng)殖場(chǎng)中可推廣應(yīng)用。

2.2.2 浸泡免疫的魚苗規(guī)格選擇 2018年的浸泡試驗(yàn)，第一次選擇0.5 g左右的稚魚進(jìn)行浸泡免疫，45 d后待該批次浸泡苗種長(zhǎng)到3～4 g時(shí)進(jìn)行第二次浸泡免疫。放入不同區(qū)域4家養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)平均成活率達(dá)到81.3%。但是在第一次免疫過程中發(fā)現(xiàn)，在魚苗規(guī)格太小時(shí)開展免疫操作易造成苗種死亡，影響試驗(yàn)效果。從2019年開始，依據(jù)之前的試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，將第一次浸泡免疫操作選擇在魚苗4 g時(shí)進(jìn)行，30 d后，待該批免疫魚種長(zhǎng)到10 g左右時(shí)進(jìn)行第二次浸泡免疫。2019年將免疫苗種放入永登縣6家水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)開展攻毒試驗(yàn)，平均成活率達(dá)到85.3%。2020年將免疫苗種放入張掖市臨澤縣和永登縣3家不同水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)開展攻毒試驗(yàn)，平均成活率達(dá)到88.5%。

2.2.3 免疫用基因工程苗試劑的濃度選擇 2018年在張掖臨澤用4‰濃度選擇4 g/尾規(guī)格魚苗開展浸泡試驗(yàn)時(shí)發(fā)生大批苗種死亡現(xiàn)象，說明用藥濃度偏高。經(jīng)過多次試驗(yàn)總結(jié)，用1‰濃度進(jìn)行免疫，效果良好，成活率達(dá)80%～90%。

2.2.4 免疫時(shí)魚苗要停食 通過多年試驗(yàn)總結(jié)，免疫前、免疫后投喂飼料都會(huì)引起魚種死亡，而免疫前停食2 d和免疫后停食2 d，免疫效果最佳，魚種死亡率低。

2.2.5 攻毒試驗(yàn)注意事項(xiàng) 一是運(yùn)輸裝車前要停食1 d；二是運(yùn)輸距離盡可能短，若運(yùn)輸距離長(zhǎng)則需要充氧氣或中間換水，防止運(yùn)輸途中損耗魚苗；三是到達(dá)攻毒試驗(yàn)?zāi)康牡睾?，可把試?yàn)池的水少量注入拉魚車的水箱內(nèi)，使魚種運(yùn)輸車上的溫度和試驗(yàn)池水溫接近，然后將免疫魚苗投放到試驗(yàn)池，減少魚苗死亡。

3 討論

利用傳染性造血器官壞死病毒基因工程疫苗進(jìn)行預(yù)防接種在甘肅省內(nèi)虹鱒魚養(yǎng)殖中尚屬首次。從試驗(yàn)效果來看，浸泡法接種免疫效果良好，接種后虹鱒魚苗在疫區(qū)的成活率都達(dá)到80%以上，而對(duì)照組未接種疫苗的魚苗成活率僅為3.75%。本次試驗(yàn)證明浸泡免疫接種虹鱒魚IHN疫苗是預(yù)防虹鱒魚傳染性造血器官壞死病的一種操作簡(jiǎn)單且效果良好的方法。

通過3年的大力宣傳和推廣，永登縣大多數(shù)養(yǎng)殖戶通過生產(chǎn)實(shí)踐比較，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到虹鱒魚IHN免疫對(duì)虹鱒魚養(yǎng)殖業(yè)的重要作用。但目前由于資金受限，虹鱒魚IHN疫苗還處于試驗(yàn)初級(jí)階段，尚未在全國(guó)范圍內(nèi)廣泛推廣，本研究通過攻毒試驗(yàn)對(duì)虹鱒魚IHN疫苗免疫接種效果進(jìn)行分析，為進(jìn)一步推廣IHN疫苗提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。