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    光照影響紅曲霉桔霉素代謝機(jī)制的研究

    2020-03-28 03:35:16王陸亞郭曉宇余濟(jì)源焦亞華王玉榮
    中國釀造 2020年2期
    關(guān)鍵詞:紅光紫色藍(lán)光

    王陸亞,李 瑤,郭曉宇,余濟(jì)源,張 蕊,焦亞華,王玉榮*

    (1.天津科技大學(xué) 新農(nóng)村發(fā)展研究院,天津 300457;2.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

    紅曲霉菌(Monascusspp.)又稱紅曲菌,是一種重要的食用微生物,能產(chǎn)生紅曲色素、莫納可林K、γ-氨基丁酸等大量有益的次級(jí)代謝產(chǎn)物,近年來受到越來越多國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注[1]。然而,紅曲霉菌也會(huì)產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物桔霉素(citrinin),又名桔青霉素,是一種真菌毒素,具有一定的抑菌活性和細(xì)胞毒性[2],對(duì)動(dòng)物的腎臟、肝臟、心臟、胃腸道等器官具有很強(qiáng)的毒性[3]。因此,紅曲產(chǎn)品的安全性受到普遍關(guān)注,歐洲及美國、日本等國家都對(duì)紅曲霉菌發(fā)酵產(chǎn)品桔霉素的限量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定。桔霉素的存在降低了紅曲霉菌及其發(fā)酵產(chǎn)品的安全性,限制了紅曲霉菌及其發(fā)酵產(chǎn)品的應(yīng)用。因此,研究桔霉素的代謝及調(diào)控機(jī)制,降低紅曲米等紅曲發(fā)酵產(chǎn)品的桔霉素含量具有重要的意義。

    作為一種聚酮類次級(jí)代謝產(chǎn)物,桔霉素以乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A為原料,在聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)及一系列氧化還原酶的作用下生成[4]。產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌主要包括紫色紅曲霉(Monascus purpureus)、安卡紅曲霉(Monascus ruber)、叢毛紅曲霉(Monascus pilosus),尤其是紫色紅曲和安卡紅曲,他們都具有桔霉素合成基因簇[5]。桔霉素合成相關(guān)基因成簇排列,共44 kbp,16個(gè)基因[6]。其中,ctnA基因是轉(zhuǎn)錄因子[7],對(duì)桔霉素的產(chǎn)量具有非常重要的正調(diào)控作用;orf7基因?qū)勖顾睾铣删哂胸?fù)調(diào)控作用[8],pksCT作為聚酮合酶基因,對(duì)桔霉素合成有關(guān)鍵作用。此外,LaeA、VeA等全局性轉(zhuǎn)錄因子在真菌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用[9],對(duì)真菌的初級(jí)代謝、次級(jí)代謝、生長(zhǎng)和發(fā)育都具有調(diào)控作用,LaeA是甲基轉(zhuǎn)移酶基因,VeA是真菌特有的Velvet蛋白家族,含有Velvet結(jié)構(gòu)域,LaeA和VeA可以調(diào)控真菌的多個(gè)下游轉(zhuǎn)錄因子。PKA信號(hào)通路是真菌非常重要的信號(hào)通路,傳遞外界信號(hào),調(diào)節(jié)真菌的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝等各種生理功能[10]。

    紅曲霉菌桔霉素的代謝受光照、pH值、溫度、溶氧、培養(yǎng)基成分等條件的影響[11-15],但影響機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。本研究以產(chǎn)桔霉素紫色紅曲霉(M.purpureus)M9為研究對(duì)象,利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法測(cè)定其在紅光、藍(lán)光、黑暗條件下的桔霉素產(chǎn)量,并利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)對(duì)桔霉素相關(guān)合成基因簇(ctnA、pksCT、orf7基因)、全局性轉(zhuǎn)錄因子(LaeA、VeA基因)及pka基因的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定,研究光照對(duì)紅曲霉桔霉素代謝機(jī)制的影響。有助于闡明桔霉素代謝調(diào)控機(jī)制,為低桔霉素紅曲霉發(fā)酵及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供研究思路和技術(shù)指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌株

    紫色紅曲霉(M.purpureus)M9:天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院保藏。

    1.1.2 試劑

    乙腈、甲醇(均為色譜純):德國Merko公司;無水乙醇、磷酸(均為色譜純):天津市百世化工有限公司;桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%):美國Sigma公司;E.Z.N.A.TM Fungal核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)Kit:美國OMEGA公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiFiScript cDNA Synthesis kit:江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司;熒光定量試劑盒TB Green Premix ExTaqⅡ:寶生物工程(大連)有限公司。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    保藏培養(yǎng)基[16]:麥芽汁(糖度10°Bx),瓊脂粉20 g/L。

    種子培養(yǎng)基[17]:葡萄糖60 g/L,蛋白胨20 g/L,KH2PO410 g/L,NaNO310 g/L,MgSO4·7H2O 5 g/L。

    YES培養(yǎng)基:蔗糖160 g/L,酵母浸粉40 g/L。

    以上培養(yǎng)基的滅菌條件均為121 ℃滅菌20 min。

    1.2 儀器與設(shè)備

    MX3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、1260高效液相色譜儀(帶有G1321A熒光檢測(cè)器):美國安捷倫科技公司;S1000梯度PCR儀:美國伯樂公司;Allegra 25R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):美國貝克曼庫爾特有限公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái):上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HYG-Ⅱ回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床:上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司;DGG-101-2B電熱鼓風(fēng)干燥箱:天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 菌株的培養(yǎng)

    活化:將紅曲霉M9接種于斜面保藏培養(yǎng)基,30 ℃條件下培養(yǎng)5~7 d。

    種子液制備:活化的紅曲霉M9中加入1 mL無菌水,將孢子刮下,制成孢子懸液,將孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)30 h,得種子液。

    培養(yǎng):將M9種子液制成孢子懸浮液(2×106個(gè)/mL),按照10%(V/V)的接種量接種于YES培養(yǎng)基中,分別在光照強(qiáng)度為150 lux的藍(lán)光(400 nm)和紅光(700 nm)及黑暗條件下30 ℃培養(yǎng),分別在培養(yǎng)3 d、5 d、7 d、9 d及11 d取樣,測(cè)定生物量、桔霉素,并進(jìn)行基因表達(dá)定量分析。

    1.3.2 生物量的測(cè)定

    在培養(yǎng)3d、5d、7d、9d及11d時(shí)取樣,發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心25 min,收集菌絲體沉淀,用蒸餾水沖洗后離心,棄去上清液,重復(fù)3次;收集的菌絲體于60 ℃干燥箱中干燥至恒質(zhì)量,準(zhǔn)確稱量。

    1.3.3 桔霉素的檢測(cè)

    取0.5 mL發(fā)酵液,加入9.5 mL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇,60 ℃保溫1 h,6 000 r/min 離心10 min,取上清,用0.45 μm濾膜過濾。采用HPLC法測(cè)定桔霉素含量[15]。

    HPLC條件:色譜柱為Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為水∶乙腈∶甲醇=30∶50∶20(V/V),pH 2.6;柱溫為30 ℃;流速為1 mL/min;熒光檢測(cè)器;進(jìn)樣量為20 μL。

    1.3.4 基因表達(dá)量分析

    ctnA、pksCT及orf7基因的引物序列參考文獻(xiàn)[18]。參考M.purpureusYY-1基因組序列,利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)LaeA、VeA、pka、β-actin基因的引物[19],β-actin作為內(nèi)參基因,引物序列見表1。

    表1 LaeA、VeA、pka及β-actin基因的引物序列Table 1 Sequences of primers of LaeA、VeA、pka and β-actin genes

    利用E.Z.N.A.TMFungal RNA Kit提取總RNA,以其為模板,利用HiFiScriptcDNASynthesiskit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板,β-actin基因?yàn)閮?nèi)參,利用TB Green Premix ExTaqⅡ試劑盒進(jìn)行基因表達(dá)熒光定量分析。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃、30 s;95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,72 ℃、15 s,40個(gè)循環(huán)。熔解曲線:95 ℃、15 s,60 ℃、30 s,95 ℃、15 s。

    1.3.5 數(shù)據(jù)處理

    所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,使用SPSS 10.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同光照條件下菌體生物量及桔霉素產(chǎn)量

    藍(lán)光、紅光、黑暗條件下,紫色紅曲霉M9的菌體生物量和桔霉素產(chǎn)量見圖1。

    圖1 不同光照條件下紫色紅曲霉M9的生物量和桔霉素產(chǎn)量Fig.1 Biomass and citrinin yield of Monascus purpureus M9 under different light conditions

    由圖1可知,藍(lán)光條件下,紫色紅曲霉M9的生長(zhǎng)速度最慢,生物量最低,桔霉素產(chǎn)量最高。與黑暗條件相比,培養(yǎng)11 d,藍(lán)光條件下菌體生物量降低15.85%,桔霉素產(chǎn)量升高30.40%;紅光條件下菌體生物量無顯著差異(P>0.05),桔霉素產(chǎn)量降低35.26%。結(jié)果表明,藍(lán)光有利于紫色紅曲霉M9產(chǎn)桔霉素,而紅光能抑制其產(chǎn)桔霉素。

    2.2 不同光照條件下桔霉素合成相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量

    藍(lán)光、紅光、黑暗條件下,紫色紅曲霉M9中桔霉素合成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量見圖2。

    由圖2可知,與黑暗條件相比,紅光抑制ctnA、pksCT基因的表達(dá),促進(jìn)orf7基因的表達(dá),在培養(yǎng)5 d時(shí)抑制(促進(jìn))作用最強(qiáng),相對(duì)表達(dá)量分別為黑暗條件下的25.90%、30.77%、292.93%。藍(lán)光促進(jìn)ctnA、pksCT基因的表達(dá)、抑制orf7基因的表達(dá),在培養(yǎng)3 d時(shí)促進(jìn)(抑制)作用最強(qiáng),相對(duì)表達(dá)量分別為黑暗條件下的151%、167%、34%。ctnA是桔霉素基因簇的轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)pksCT、orf4等多個(gè)基因具有激活作用,正調(diào)控桔霉素的合成代謝[20]。orf7是桔霉素的合成抑制因子,有研究表明,敲除orf7基因可以提高桔霉素產(chǎn)量142.4%[8]。結(jié)果表明,光照影響基因簇內(nèi)部的激活轉(zhuǎn)錄因子ctnA、抑制因子orf7及合成關(guān)鍵基因pksCT的轉(zhuǎn)錄水平。

    圖2 不同光照對(duì)紫色紅曲霉M9中ctnA(a)、pksCT(b)及orf7(c)基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of different light on relative expression quantity of ctnA (a), pksCT (b) and orf7 (c) genes in Monascus purpureus M9

    2.3 不同光照條件下全局轉(zhuǎn)錄因子的相對(duì)表達(dá)量

    圖3 不同光照對(duì)紫色紅曲霉M9中LaeA(a)及VeA(b)基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of different light on relative expression quantity of LaeA (a) and VeA (b) genes in Monascus purpureus M9

    藍(lán)光、紅光、黑暗條件下,紫色紅曲霉M9中LaeA和VeA基因相對(duì)表達(dá)量見圖3。由圖3可知,與黑暗條件比較,紅光能促進(jìn)全局性轉(zhuǎn)錄因子LaeA、VeA基因的表達(dá),藍(lán)光能抑制LaeA、VeA基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),LaeA和VeA基因相對(duì)表達(dá)量降低,桔霉素產(chǎn)量升高,LaeA和VeA基因相對(duì)表達(dá)量升高而桔霉素產(chǎn)量降低,說明光照通過調(diào)控紅曲全局性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),調(diào)控桔霉素的合成代謝。

    2.4 不同光照條件下pka基因相對(duì)表達(dá)量

    藍(lán)光、紅光、黑暗條件下,紫色紅曲霉M9中pka基因相對(duì)表達(dá)量見圖4。

    圖4 不同光照下紫色紅曲霉M9中pka基因的相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of different light on relative expression quantity of pka in Monascus purpureus M9

    光照、溫度、溶氧等外界信號(hào)需要通過信號(hào)通路傳遞,才能實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的調(diào)控作用。由圖4可知,與黑暗條件比較,紅光促進(jìn)了pka基因的表達(dá),藍(lán)光抑制了pka基因的表達(dá)。并且pka基因相對(duì)表達(dá)量升高,桔霉素產(chǎn)量降低;pka基因相對(duì)表達(dá)量降低,桔霉素產(chǎn)量升高。結(jié)果表明,PKA信號(hào)通路能夠響應(yīng)紅光、藍(lán)光等不同的光照條件對(duì)不同光信號(hào)產(chǎn)生不同的反應(yīng),并將信號(hào)進(jìn)一步傳遞,直到引起桔霉素代謝的變化,并且與桔霉素產(chǎn)量負(fù)相關(guān)。

    3 結(jié)論

    研究光照對(duì)紅曲霉桔霉素代謝機(jī)制的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與黑暗條件相比,藍(lán)光條件下菌體生物量降低15.85%,桔霉素產(chǎn)量升高30.40%;紅光條件下生物量無顯著差異(P>0.05),桔霉素產(chǎn)量降低35.26%。藍(lán)光促進(jìn)ctnA和pksCT基因的表達(dá)、抑制orf7、LaeA、VeA和pka基因的表達(dá),紅光抑制ctnA和pksCT基因的表達(dá)、促進(jìn)orf7、LaeA、VeA和pka基因的表達(dá)。結(jié)果表明,光照通過調(diào)控LaeA、VeA和pka基因的表達(dá)量進(jìn)行信號(hào)傳遞,調(diào)控桔霉素基因簇重要的調(diào)控因子ctnA和orf7,改變桔霉素合成基因pksCT表達(dá)量,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)桔霉素產(chǎn)量的調(diào)控作用。

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