大型海藻組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

徐睿航 張國庚

[摘 要] 本文首先對大型海藻的組織培養(yǎng)歷史研究成果進(jìn)行介紹，然后分析海藻組織培養(yǎng)存在的問題，最后從培養(yǎng)方法、取材、培養(yǎng)基、生長條件等方面對海藻組織培養(yǎng)的相關(guān)技術(shù)及相關(guān)研究進(jìn)行總結(jié)。

[關(guān)鍵詞] 大型海藻；組織培養(yǎng)；取材；培養(yǎng)基；生長條件

[中圖分類號(hào)] Q943.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-7909（2018）05-89-3

海藻在海洋植物中占有很重要的地位，而大型海藻是海藻中非常重要的組成部分，主要的經(jīng)濟(jì)大型藻類包括紅藻、綠藻、褐藻等多個(gè)門類。大多數(shù)藻類的經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，可以用作食品、一些藥物的原料，也可用作動(dòng)物飼料等，甚至是可以提煉工業(yè)原料，如角叉膠、瓊脂、早酸鹽、卡拉膠等。盡管我國在海藻研究方面人數(shù)較少且起步相對比較晚，但是在經(jīng)濟(jì)海藻的應(yīng)用研究方面如紫菜體細(xì)胞育苗上已經(jīng)達(dá)到國際領(lǐng)先水平[1]。為了有效提高海藻作物的產(chǎn)量，要盡快實(shí)現(xiàn)海藻組織培養(yǎng)的產(chǎn)業(yè)化，突破海藻組織培養(yǎng)的瓶頸，快速生產(chǎn)市場上缺少的商品苗。

1 歷史研究情況

20世紀(jì)50年代，海藻組織培養(yǎng)的研究開始興起。1952年，Aharon Gibor開始著手對囊鏈藻Cystoseira組織培養(yǎng)進(jìn)行研究[2]。二十世紀(jì)七八十年代，海藻組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展比較迅猛。1978年，有學(xué)者運(yùn)用無菌培養(yǎng)技術(shù)對皺波角叉菜（Chondrus crispus）髓部組織進(jìn)行培養(yǎng)，并獲取其愈傷組織誘導(dǎo)分化形成完整植株，取得不小的研究成果[3]。20世紀(jì)80年代，植物組織培養(yǎng)發(fā)展最為迅速，很多研究人員相繼通過海藻組織培養(yǎng)得到相應(yīng)的孢子體。20世紀(jì)末，隨著分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)的不斷發(fā)展，海藻組織培養(yǎng)技術(shù)因此也增加了許多鑒定及分析方法，對其有著極大的影響。同樣，隨著固定化技術(shù)、基因工程、細(xì)胞雜交等一系列生物技術(shù)的發(fā)展，藻類生物技術(shù)同樣飛快進(jìn)步著。羊棲菜（Sarqassum fusiforme）假根育苗等技術(shù)也為藻類育苗提供了新的方法[4，5]。

2 海藻組織培養(yǎng)存在的問題

現(xiàn)在的主要問題是對控制海藻細(xì)胞成長與分化等方面知識(shí)較缺乏，導(dǎo)致很難控制組織、細(xì)胞愈合組織或細(xì)胞的發(fā)育。并且截至目前，依然無法得到合適的、準(zhǔn)確的海藻培養(yǎng)基。

另外，早期組織培養(yǎng)的問題是無菌材料的獲取，無法有效獲取無菌組織導(dǎo)致在培養(yǎng)過程中細(xì)菌快速生長而抑制藻類組織的生長，甚至?xí)⑺琅囵B(yǎng)組織。截至目前，大型海藻的無菌取材、操作及培養(yǎng)仍是一個(gè)難以跨越的瓶頸。在無菌條件下培養(yǎng)的藻類，多數(shù)個(gè)體最終都不能正常生長，其中最易發(fā)生的情況就是植株發(fā)育畸形。但是，如果在培養(yǎng)過程中加入某些被分離的細(xì)菌或其他污染物時(shí)，藻類恢復(fù)正常生長。這說明在那些被分離的污染物中包含能使藻類正常生長的物質(zhì)，但目前還沒有成功分離出相應(yīng)的物質(zhì)，并且對這些物質(zhì)的鑒定也并不完全成熟[6]。

3 相關(guān)技術(shù)研究

3.1 培養(yǎng)方法

大型海藻的組織培養(yǎng)主要是培養(yǎng)大型海藻生活史中的微觀階段，如配子、配子體和孢子等。根據(jù)培養(yǎng)目的的不同，可以將培養(yǎng)方法分為以下三類：一是粗培養(yǎng)，就是在培養(yǎng)過程中將多種藻混在一起進(jìn)行培養(yǎng)，并且包含細(xì)菌的培養(yǎng)；二是單藻培養(yǎng)，即在培養(yǎng)過程中僅存在一種藻類，但是單藻培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基中會(huì)含有細(xì)菌；三是無菌培養(yǎng)，即在培養(yǎng)過程中只培養(yǎng)一種藻，并且沒有細(xì)菌污染[7]。

3.2 取材

3.2.1 取材部位。在組織培養(yǎng)過程中，其生長活力或者產(chǎn)生的愈傷組織的不同，有很大一部分原因是培養(yǎng)的組織塊的取材位置不同。因此，選擇比較合理、準(zhǔn)確的培養(yǎng)材料是非常重要和必要的。1977年，Saga等[8]在海帶的葉片、假根、莖的切段再生試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)有再生能力的部位僅僅是離基部較近的一段區(qū)域（包括柄和假根）。方宗熙等[9]對海帶和裙帶菜孢子體兩者不同部位的再生能力進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙方皆是葉片基部切塊經(jīng)愈傷組織長出的孢子體的數(shù)量最多，其次是葉片中部。而對于羊棲菜芽生苗出苗率而言，最高的是假根，之后是主干中上部，最后是下部[9]。不同部位的組織塊生長發(fā)育狀況不同的現(xiàn)象同樣出現(xiàn)于條斑紫菜離體組織再生苗的研究試驗(yàn)中[10]。同樣，鼠尾藻不同部位的分生能力也是各不相同，其中最強(qiáng)的是固著器的外植體，其次則是主莖，而枝與葉的形態(tài)發(fā)生活性很差[11]。

3.2.2 滅菌處理。滅菌的程度就是既要?dú)缤庵搀w所帶的細(xì)菌，又不能對外植體有所損害。常用的消毒試劑如表1所示。

3.3 培養(yǎng)基的制備

3.3.1 培養(yǎng)基的種類。培養(yǎng)基是根據(jù)材料和培養(yǎng)目的的不同來選擇的，高等植物的培養(yǎng)基主要有MS培養(yǎng)基（Murashige和Skoog，1962）、ER培養(yǎng)基（Eriksson，1965）、B5培養(yǎng)基（Gambor等，1968）、SH培養(yǎng)基（Shenk和Hildebrandt，1972）和HE培養(yǎng)基（Heller，1953）。而海藻與高等植物有一定的區(qū)別，故在培養(yǎng)基的選擇上也有所不同，主要有培養(yǎng)褐藻的PESI培養(yǎng)基、MES培養(yǎng)基、PES培養(yǎng)基、VAS培養(yǎng)基，其中PES培養(yǎng)基主要培養(yǎng)紅藻和綠藻，還有就是Erd（-shreiher）培養(yǎng)基和ESS培養(yǎng)基，這兩種培養(yǎng)基主要用于培養(yǎng)一般海藻。這些培養(yǎng)基在組成成分上是有所不同的。除了化學(xué)成分外，培養(yǎng)基的物理因素在培養(yǎng)過程中所造成的影響也是不能忽視的。比如，固體培養(yǎng)基對于誘導(dǎo)愈傷組織的形成是比較有利的，而細(xì)胞和胚狀體的增殖則在液體培養(yǎng)基中更容易進(jìn)行。

3.3.2 植物激素。培養(yǎng)基中除了那些必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)外，其他植物生長調(diào)節(jié)劑及其他植物激素也尤為重要。植物激素的添加在藻類組織培養(yǎng)中一直是個(gè)難題。對于大型海藻的組織培養(yǎng)而言，植物激素對其愈傷組織的分化以及后期植株的形成與發(fā)育都是十分重要的。一般細(xì)胞分裂素對于誘導(dǎo)細(xì)胞脫分化形成愈傷組織是非常有利的，較高的細(xì)胞分裂素與生長素之比有益于芽的形成，較高的生長素和細(xì)胞分裂素之比有利于根的形成。但是，由于植物激素與組織分化之間的相互作用和植物基因的遺傳表達(dá)有著非常緊密的關(guān)系，所以有時(shí)甚至?xí)霈F(xiàn)相反的結(jié)果。研究表明，多胺類、油菜素甾醇類、三十烷醇等化合物也具有植物生長調(diào)節(jié)劑活性[12]。

另外，激素的種類和濃度的不同對海藻組織塊的發(fā)育和生長同樣有著不同的影響。比如，6-BA和2，4-D在條斑紫菜組織培養(yǎng)過程中的作用就不同[13]。吲哚乙酸和脫落酸在海帶中不同部位不同時(shí)期的分布對其生長發(fā)育有著不同的影響，對此，李鐵松對其關(guān)系進(jìn)行了研究測定[14]。

3.4 生長條件

培養(yǎng)條件的不同對之后培養(yǎng)的過程及結(jié)果會(huì)有很大的影響。一是光照條件。通常應(yīng)用日光燈，一般光照強(qiáng)度控制在15～40 μmol/（m2·s），每天的光照時(shí)間在12～16 h。二是溫度條件。不同的植物體在自然環(huán)境中所適合的溫度不同，要根據(jù)不同植物體在自然環(huán)境中所適宜的生長溫度來適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)溫度，通常在15～25 ℃。三是濕度條件。不僅僅是培養(yǎng)容器中的濕度對培養(yǎng)有影響，培養(yǎng)環(huán)境的濕度對培養(yǎng)也有影響，所以要同時(shí)注意這兩方面的濕度條件。四是充氣條件。在液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時(shí)可以通過充氣的方式來達(dá)到攪拌培養(yǎng)的效果。在通入空氣時(shí)，要對通入的空氣進(jìn)行加工，需要經(jīng)過濾膜孔徑為0.22 μm的過濾裝置，以此來保證培養(yǎng)過程無菌。此外，可以利用硫酸銅溶液去除其他藻類和雜菌，以避免培養(yǎng)過程被污染。五是培養(yǎng)液的更換。要根據(jù)培養(yǎng)要求及培養(yǎng)對象的不同按規(guī)定更換適量的培養(yǎng)液。需要注意的是，海水培養(yǎng)液由于蒸發(fā)的原因會(huì)使鹽度有所增加，因此，應(yīng)根據(jù)蒸發(fā)量每天定量補(bǔ)加蒸餾水。例如，1997年Saga等[15]用海帶藻體分別進(jìn)行假根、莖、葉片切段再生試驗(yàn)，結(jié)果表明只有在靠近基部（包括假根、柄）部分才有再生能力。培養(yǎng)條件為用PESI培養(yǎng)液培養(yǎng)，光照周期為10L∶14D，溫度為10 ℃，光照強(qiáng)度30 μmol/（m2·s）。

4 結(jié)語

雖然目前海洋組織培養(yǎng)在組織塊的無菌培養(yǎng)及植物生長調(diào)節(jié)劑的研究方面存在不足，但在海藻組織培養(yǎng)領(lǐng)域已經(jīng)取得了不小的成就。隨著今后基因工程、細(xì)胞雜交、固定化等技術(shù)的發(fā)展和成熟，對藻類的組織培養(yǎng)是很有利的，對藻類的育苗、快速繁殖、相應(yīng)活性物質(zhì)的提取研究及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)都是十分可觀的?？傊孱惤M織培養(yǎng)技術(shù)在今后一定會(huì)得到更加廣泛的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1]徐禮根，阮積惠，徐程，等.海洋植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].海洋學(xué)研究，1999（2）：1-9.

[2]何培民，秦松，嚴(yán)小軍，等.海藻生物技術(shù)及其應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007.

[3]吳融.海藻生物技術(shù)的現(xiàn)狀和前景[J].海洋科學(xué)，1992（2）：27-30.

[4]徐禮根，阮積惠，徐程，等.海洋植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].東海海洋，1999（2）：9.

[5]劉杰，韓曉弟，湯銀川，等.海洋植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（19）：8860-8862.

[6]王志勇.鷓鴣菜組織和細(xì)胞培養(yǎng)的研究Ⅳ.藻體任意碎片的培養(yǎng)與損傷藻體再生的觀察[J].海洋湖沼通報(bào)，1991（1）：66-72.

[7]何培民，秦松，嚴(yán)小軍，等.海藻生物技術(shù)及其應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007.

[8]Saga N，Sskai Y. Studies on the morphogeneais of Lominariales plant[J].Bull. Japanese Soc. Phyeol.，1977（sl）：297-301.

[9]方宗熙，閻祚美，王宗誠.海帶和裙帶菜組織培養(yǎng)的初步觀察[J].科學(xué)通報(bào)，1982（11）：690-691.

[10]梅俊學(xué)，費(fèi)修綆.條斑紫菜離體組織再生苗的研究[J].海洋科學(xué)，2000（6）：39-42.

[11]董棟.鼠尾藻組織培養(yǎng)的初步研究[D].青島：中國海洋大學(xué)，2007.

[12]侯和勝，吳超元.藻類中植物激素的研究進(jìn)展[J].海洋科學(xué)集刊，1998（40）：167-176.

[13]王萍，王丹丹，藤亞娟，等.激素對條斑紫菜葉狀體離體培養(yǎng)的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（4）：173-175.

[14]李鐵松.海帶中兩種植物激素的分離及其活性研究[D].大連：大連理工大學(xué)，2008.

[15]Saga N，Uchida T，SskaiY. CloneLam inaria frum simgle isolated cell[J].Bull. Japanese Soc. Phyeol.，1978（44）：87.