龍膽苦苷納米乳處方優(yōu)化及其質(zhì)量評(píng)價(jià)

夏鵬飛 馬肖 吳國(guó)泰 李陽 樊秦 趙磊

摘要：目的 篩選處方并制備龍膽苦苷納米乳，并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 根據(jù)龍膽苦苷的基本性質(zhì)，基于單因素試驗(yàn)和偽三元相圖法選擇納米乳處方，對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行考察，采用HPLC對(duì)其含量進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 篩選得到龍膽苦苷納米乳制劑處方為：龍膽苦苷∶乙酸乙酯∶聚氧乙烯醚（35）蓖麻油∶無水乙醇∶水=1.77∶7.66∶5.94∶11.91∶72.71；測(cè)得龍膽苦苷納米乳平均粒徑為23.08 nm；建立了HPLC測(cè)定龍膽苦苷納米乳中龍膽苦苷含量的方法，專屬性良好，線性范圍為0.004 28～0.214 mg/mL；在不同溫度、光照和濕度條件下含量無明顯變化，穩(wěn)定性良好。結(jié)論 本研究篩選的龍膽苦苷納米乳制備工藝簡(jiǎn)單，為提高龍膽苦苷口服生物利用度提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：龍膽苦苷；納米乳；制備工藝；質(zhì)量評(píng)價(jià)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.015

中圖分類號(hào)：R283.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）07-0062-05

Abstract： Objective To optimize prescription of gentiopicroside nanoemulsion； To evaluate its quality and security. Methods According to the basic properties of gentiopicroside， single-factor test and pseudo-ternary phase diagram were adopted to optimize prescription of gentiopicroside nanoemulsion. The physicochemical property was investigated， and the content was evaluated by HPLC. Results Optimal prescription was obtained as gentiopicroside/ ethyl acetate/ EL-35/ absolute ethyl alcohol/ ultrapure water （1.77：7.66：5.94：11.91：72.71）； the particle size of nanoemulsion was 23.08 nm； the content of gentiopicroside was determined by HPLC； the specificity of the method was good with a linear range of 0.004 28–0.214 mg/mL； stability of prepared gentiopicroside nanoemulsion was good in the state of different temperatures， illumination intensity and humidity conditions， without significant changes. Conclusion The optimized preparation technology of gentiopicroside nanoemulsion is simple， repeatable and stable， which can provide references for improving the bioavailability of gentiopicroside.

Keywords： gentiopicroside； nanoemulsion； preparation technology； quality evaluation

龍膽苦苷是秦艽、龍膽等龍膽科植物的主要有效成分。研究表明，龍膽苦苷具有明確的保肝利膽、抗炎鎮(zhèn)痛活性[1]，同時(shí)還具有抗氧化、抑制腫瘤[2]、中樞興奮、抗病原微生物及增強(qiáng)免疫等作用[3]，臨床可應(yīng)用于肝炎防治[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，龍膽苦苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎具有一定的治療作用[5]。目前，含有龍膽苦苷的中藥劑型以口服制劑為主[6]。龍膽苦苷為環(huán)烯醚萜類化合物，自身極性較大，極易被酸水解，所以口服后在生物體內(nèi)吸收快、消除快。藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，其在大鼠體內(nèi)代謝的消除半衰期僅0.64 h[4]，生物利用度較低，嚴(yán)重影響龍膽苦苷的藥效發(fā)揮和開發(fā)利用。

納米乳包括水包油（O/W）型、油包水（W/O）型及雙連續(xù)型，是由水相、油相、乳化劑和助乳化劑按適當(dāng)比例組成的熱力學(xué)穩(wěn)定體系，能夠通過將藥物包裹形成粒徑在10～100 nm之間的球體，達(dá)到增加難溶藥物溶解度、提高易水解藥物穩(wěn)定性的作用，進(jìn)而達(dá)到緩釋、靶向及提高藥物生物利用度的目的[7]，該技術(shù)已滲透到生物醫(yī)藥、化工、食品等領(lǐng)域，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[8]。本試驗(yàn)旨在篩選適宜的油相、乳化劑及助乳化劑，制備龍膽苦苷納米乳，以期憑借納米乳的特性，研制一種能夠提高龍膽苦苷穩(wěn)定性、療效及生物利用度的納米乳制劑，并對(duì)其含量、黏度、密度、折光率、粒徑、穩(wěn)定性等參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，以評(píng)價(jià)和控制納米乳制劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Tecnai G2 20型分析透射電鏡，美國(guó)FEI公司；Zetasizenano 3600激光納米粒度儀，英國(guó)馬爾文公司；JJ-3控溫磁力攪拌器，金壇市恒豐儀器廠；SW22恒溫水域振蕩器，優(yōu)萊博技術(shù)（北京）有限公司；PBJ 420-3M電子分析天平，德國(guó)科恩公司；UW620H電子分析天平，日本島津公司；Agilent 1260II Infinity高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司。

龍膽苦苷（批號(hào)20160308），天津士蘭科技有限公司；聚氧乙烯醚（35）蓖麻油（EL-35）、肉豆蔻酸異丙酯（IPM）、聚氧乙烯醚（40）蓖麻油（EL-40）、聚氧乙烯醚（40）氫化蓖麻油（RH40）均為化學(xué)純，江蘇省海安石油化工廠；司盤-80、乳化劑OP-10（萊陽市雙雙化工有限公司），乙酸乙酯、無水乙醇、吐溫- 80（天津市大茂化學(xué)試劑廠），液體石蠟（天津歐博凱化工有限公司），大豆卵磷脂（天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司），丙三醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），均為分析純。液相色譜用試劑為色譜純，水為超純水（本實(shí)驗(yàn)室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方篩選

2.1.1 偽三元相圖的繪制

將乳化劑與助乳化劑按一定質(zhì)量比（Km）混勻形成混合乳化劑，再與油相按Km分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1混勻，在磁力攪拌情況下逐滴加入超純水，觀察混合體系的變化，滴定過程中可借助丁達(dá)爾現(xiàn)象和偏光顯微鏡來判斷是否形成了納米乳，最終記錄體系由渾濁變?yōu)槌吻鍟r(shí)的臨界加水量。采用OriginPro8.5軟件，以水相、油相及混合乳化劑質(zhì)量為3個(gè)頂點(diǎn)，繪制偽三元相圖[9]，以偽三元相圖中納米乳區(qū)域面積的大小作為篩選各相的依據(jù)。

2.1.2 水相和油相的選擇

龍膽苦苷極性較大，在水中具有良好的溶解性，溶解度達(dá)7.65 g/100 g[10]，因此，選擇超純水為水相，選取乙酸乙酯、IPM、液體石蠟、橄欖油及棕櫚酸異丙酯為待選油相，測(cè)定龍膽苦苷在各油相中的溶解度，最終選擇對(duì)龍膽苦苷溶解能力較大的乙酸乙酯為油相。

2.1.3 乳化劑和助乳化劑的篩選

乳化劑的選擇要考慮到納米乳本身及其使用目的、經(jīng)濟(jì)性、安全性等問題，是篩選納米乳處方組分最重要的一步。本研究選擇OP-10乳化劑、RH-40、吐溫-80、EL-35及EL-40為待選乳化劑。根據(jù)乳化理論和納米乳的特性，納米乳的形成需要有助表面活性劑提供短暫的負(fù)表面張力作用。醇類為應(yīng)用最廣泛的助表面活性劑，不僅可以協(xié)助表面活性劑降低界面張力，增加界面流動(dòng)性，調(diào)節(jié)表面活性劑的親水疏水平衡值（HLB），還可以增大藥物溶解度，增大納米乳區(qū)域面積。因此，本研究選擇無水乙醇、異丙醇、正丁醇及1，2-丙二醇為待選助乳化劑。在考察乳化劑時(shí)選擇無水乙醇為助乳化劑，按“2.1.1”項(xiàng)下方法繪制偽三元相圖，以圖中納米乳區(qū)域面積大小作為選擇乳化劑及助乳化劑的依據(jù)，結(jié)果見圖1、圖2，最終選擇EL-35為乳化劑，無水乙醇為助乳化劑。

2.1.4 乳化劑與助乳化劑比例篩選

分別將EL-35與無水乙醇按Km分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3混合，再按“2.1.1”項(xiàng)下方法繪制偽三元相圖，以圖中納米乳區(qū)域面積大小作為選擇Km值的依據(jù)，結(jié)果見圖3?？梢钥闯?，Km分別為2∶1、1∶2時(shí)，偽三元相圖中納米乳區(qū)域較大，考慮到無水乙醇對(duì)納米乳制劑的良好影響，因此選擇Km=1∶2。

2.1.5 龍膽苦苷納米乳的制備

以偽三元相圖和藥物穩(wěn)定性為依據(jù)，龍膽苦苷納米乳的處方組成為：龍膽苦苷∶乙酸乙酯∶EL-35∶無水乙醇∶水=1.77∶7.66∶5.94∶11.91∶72.71。按照該比值對(duì)各組分進(jìn)行稱取，室溫下將龍膽苦苷溶于超純水中，攪拌的同時(shí)加入乙酸乙酯、EL-35、無水乙醇，得到澄清透明的龍膽苦苷納米乳。

2.2 理化性質(zhì)考察

2.2.1 外觀和類型鑒別

正常光照下觀察，龍膽苦苷納米乳為淡藍(lán)色、澄清透明的液體，流動(dòng)性良好，激光束照射呈現(xiàn)丁達(dá)爾效應(yīng)。納米乳類型的鑒別采用染色法[11]，根據(jù)紅色的油溶性染料蘇丹紅Ⅲ和藍(lán)色的水溶性染料亞甲蘭在納米乳中擴(kuò)散的快慢來判斷，藍(lán)色的擴(kuò)散速度大于紅色則納米乳為O/W型，反之則為W/O型，二者相同則為雙連續(xù)型。結(jié)果表明，本試驗(yàn)研制的龍膽苦苷納米乳為O/W型。

2.2.2 密度、黏度、折光率和pH值

采用比重瓶測(cè)定龍膽苦苷納米乳的密度為1.009 9；采用奧氏黏度計(jì)測(cè)定龍膽苦苷納米乳的黏度為4.443 7×10-3 Pa·s；采用阿貝折光儀測(cè)定龍膽苦苷納米乳的折光率為1.344 8；采用酸度計(jì)測(cè)定龍膽苦苷納米乳的pH值為6.049。

2.2.3 形態(tài)

將龍膽苦苷納米乳滴在覆有支持膜的銅網(wǎng)上，靜置10 min后滴加3%磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上負(fù)染5 min，自然揮干，透射電鏡下觀察納米乳的形態(tài)呈圓球形，分布均勻（見圖4）。

2.2.4 粒徑和粒度分布

取適量龍膽苦苷納米乳，采用激光納米粒度儀進(jìn)行測(cè)定，納米乳的粒徑分布見圖5。結(jié)果表明，龍膽苦苷納米乳的粒徑主要集中在10～100 nm之間，平均粒徑為23.08 nm，多分散系數(shù)（PDI）為0.24。

2.3 龍膽苦苷含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Thermo ODS HYPERSIL柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（25∶75）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱取龍膽苦苷對(duì)照品0.010 7 g，用甲醇溶解并定容于50 mL量瓶中，得到濃度為0.214 mg/mL的貯備液，于4 ℃保存。精密吸取貯備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.7、5.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，用甲醇定容，得龍膽苦苷系列濃度溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積對(duì)龍膽苦苷濃度進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=12 053X+6.111（r2=1），表明龍膽苦苷在0.004 28～0.214 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.3.3 供試品溶液的制備

精密稱取樣品適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲30 min破乳，靜置10 min，取續(xù)濾液，用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，即得。

2.3.4 專屬性考察

取龍膽苦苷對(duì)照品溶液、空白納米乳、龍膽苦苷納米乳按，“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖6?？梢姡埬懣嘬丈V峰無干擾，峰形良好。

2.3.5 方法學(xué)考察

重復(fù)性試驗(yàn)，穩(wěn)定性試驗(yàn)，日間、日內(nèi)精密度試驗(yàn)RSD均小于3%，加樣回收率為99.4%。

2.4 穩(wěn)定性考察

龍膽苦苷納米乳10 000 r/min離心10 min，仍保持澄清透明，未出現(xiàn)分層、沉淀；室溫密封放置90 d，仍保持澄清透明，無分層、藥物析出現(xiàn)象；將龍膽苦苷納米乳置于高溫（40 ℃）、低溫（4 ℃）及光照（4500±500）Lx、相對(duì)濕度92.5%條件下，分別于0、3、7 d取樣進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見表1。可見，龍膽苦苷納米乳在上述條件下含量、性質(zhì)保持穩(wěn)定。

3 討論

納米乳是超微米大小的膠體微粒系統(tǒng)，可以增強(qiáng)藥物的生物利用度，提高藥物的治療效果及物理穩(wěn)定性，提高親脂性藥物的溶解性，掩蓋原料藥苦味，可制成多種多樣的劑型，用于注射給藥、黏膜給藥、口服給藥及經(jīng)皮給藥，擴(kuò)大藥物的使用范圍。

本試驗(yàn)基于單因素法結(jié)合偽三元相圖法對(duì)納米乳的處方進(jìn)行篩選優(yōu)化，得到了龍膽苦苷納米乳的最佳處方，同時(shí)使處方中油相、乳化劑及助乳化劑的比例降至最低，以減少其對(duì)機(jī)體的影響；通過考察納米乳的理化性質(zhì)，保證制劑工藝的合理；通過建立含量測(cè)定的方法，對(duì)納米乳的質(zhì)量進(jìn)行控制；通過測(cè)定穩(wěn)定性，保證納米乳制劑在非正常狀態(tài)下仍能保持性質(zhì)、含量的穩(wěn)定。

龍膽苦苷具有明顯抗炎鎮(zhèn)痛作用[12-13]，因良好的活性展現(xiàn)出巨大的潛在優(yōu)勢(shì)。但其極性較大，口服后吸收快、消除快，導(dǎo)致生物利用度較低。將龍膽苦苷制成納米乳制劑可減小極性，提高放置穩(wěn)定性，借助納米乳形成包裹物減慢其在體內(nèi)的吸收、代謝速度。

龍膽苦苷在水中具有良好的溶解度，使龍膽苦苷納米乳的載藥量得到了保障。選擇乙酸乙酯為油相，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)；選擇EL-35為乳化劑，所得偽三元相圖納米乳區(qū)域較大，能滿足作為藥物原料時(shí)的臨床要求；醇類是常用的助乳化劑，能增大藥物溶解度，提高載藥量，通過自身的剪切作用減小納米乳的粒徑，最終選擇無水乙醇為助乳化劑。本研究制備的龍膽苦苷納米乳為O/W型納米乳，可用大量水進(jìn)行稀釋，自由調(diào)節(jié)濃度，使用方便，并且可開發(fā)成其他劑型，擴(kuò)大適用范圍。本研究結(jié)果可為提升龍膽苦苷口服生物利用度及擴(kuò)大臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

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