響應(yīng)面法優(yōu)化刺梨中單寧提取工藝研究*

李志, 冉茂乾， 焦彥朝

(1.六盤水市山地特色生態(tài)產(chǎn)品研究中心，貴州 六盤水553000；2.貴陽海關(guān)出入境檢驗檢疫綜合技術(shù)中心國家果蔬檢測重點實驗室(六盤水)，貴州 六盤水553000；3.貴陽海關(guān)出入境檢驗檢疫綜合技術(shù)中心，貴州 貴陽 550081)

刺梨(RosaroxbunghiiTratt)又名九頭鳥、文先果，是一種稀有的果實，在我國主要分布于貴州、四川、湖北和云南等地[1-5]，果實富含維生素、糖、有機(jī)酸、胡蘿卜素，尤其是維生素C含量極高，被稱為“維C之王”[6-9]；其花、葉、果和籽均可入藥，有健胃、消食、滋補(bǔ)及止瀉的功效[10]，具有很高的藥用價值.單寧屬于鞣酸類物質(zhì)，廣泛分布于植物界[11-12]，具有收斂、防曬、美白、保濕及防腐等功效[13]，目前對其他來源提取單寧有很多文獻(xiàn)報道，如劉寧等[14]關(guān)于微波法提取香蕉皮中水解單寧的工藝研究，章莉娟等[15]關(guān)于核桃青皮中單寧的微波輔助提取工藝，薛文艷等[16]關(guān)于麻櫟橡子單寧脫除工藝優(yōu)化及抗氧化性，但鮮見刺梨中單寧的提取研究報道[17-21].本文運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗和響應(yīng)面法[22-25]對刺梨單寧提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以刺梨單寧得率為指標(biāo)，考察乙醇濃度、超聲時間、料液比、超聲功率對刺梨單寧提取得率的影響，從而找出最優(yōu)提取工藝參數(shù)，為刺梨單寧的提取建立一種可靠、穩(wěn)定、便捷的方法，為單寧的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨：市售；丙酮(分析純)、氨水(分析純)、無水碳酸鈉(分析純)、醋酸鋅(分析純)、氯化銨(分析純)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·2Na)(分析純)：均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；單寧標(biāo)準(zhǔn)品：北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司、Folin-Denis試劑：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600/2700島津紫外可見分光光度計：日本島津公司；AS20500BDT超聲波清洗器：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；HG200 均質(zhì)機(jī)：普利賽斯國際貿(mào)易(上海)有限公司；HWS恒溫水浴鍋：上?；厶﹥x器制造有限公司；FA1004B電子分析天平：上海佑科儀器儀表有限公司；DH-2000R高速臺式冷凍離心機(jī)：上海德洋意邦儀器有限公司；GenPure Pro 超純水儀：賽默飛世爾科技實驗室產(chǎn)品；JXFSTPRP-24全自動樣品快速研磨儀：上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：北京蘭貝石恒溫技術(shù)有限公司；ExcelTM電動移液器：廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.1 g(精確至0.001 g)單寧標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，并用超純水定容至刻度，得到1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，放入4 ℃冰箱中備用；分別移取0、10、20、30、40、50 μL單寧標(biāo)準(zhǔn)儲備液至10 mL容量瓶中，分別加入5.0 mL超純水、1.0 mL Folin-Denis試劑及3.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的Na2CO3溶液，并用超純水定容至刻度，在沸水中加熱2 min，混勻，即得單寧濃度分別為0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液，顯色，放置2 h，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0.0 mg/L為空白，在765 nm波長下測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即為：y=1.256x+0.587 5，R2=0.999 85.

1.3.2 樣品的測定

稱取刺梨果實勻漿2 g(精確至0.001 g)于250 mL錐形瓶中，用70%的乙醇按料液比1∶10 (g/mL)加入20 mL的提取溶劑，放入超聲提取儀中提取10 min，超聲儀提取條件為功率100 W、溫度60 ℃、超聲頻率80 Hz，提取液加壓抽濾，即得待測樣品溶液；吸取1 mL待測樣品溶液，按1.3.1節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法測定其在765 nm波長下的吸光值.

1.3.3 測定吸光度，計算刺梨單寧的得率[13]

式中：ω—刺梨單寧得率；β—提取液中單寧濃度,單位為mg·mL-1；10—提取液定容體積,單位為mL；A—提取液稀釋倍數(shù)；m—刺梨取樣質(zhì)量,單位為g.

1.4 單因素實驗

1.4.1 乙醇濃度對刺梨單寧提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取2 g刺梨果實勻漿3份，每份按料液比1∶10(g/mL)加入20 mL乙醇溶液，提取條件為：功率100 W、浸提10 min，分別考察不同乙醇濃度(70%、75%、80%、85%、90%)對刺梨單寧得率的影響，試驗重復(fù)3次浸提.

1.4.2 浸提時間對刺梨單寧提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取2 g刺梨果實勻漿3份，每份按料液比1∶10(g/mL)加入20 mL乙醇溶液，提取條件為：功率100 W、乙醇濃度85%，分別考察不同浸提時間(10、20、30、40、50 min)對刺梨單寧得率的影響，試驗重復(fù)3次浸提.

1.4.3 料液比對刺梨單寧提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取2 g刺梨果實勻漿3份，每份加入85%的乙醇溶液，提取條件為：功率100 W、浸提40 min，分別考察不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對刺梨單寧得率的影響，試驗重復(fù)3次浸提.

1.4.4 超聲功率對刺梨單寧提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取2 g刺梨果實勻漿3份，每份加入85%乙醇溶液，提取條件為：浸提40 min、料液比為1∶20(g/mL)，分別考察不同提取功率(100、150、200、250、300 W)對刺梨單寧得率的影響，試驗重復(fù)3次浸提.

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken試驗原理[24-25]，選取乙醇濃度、浸提時間、料液比和超聲功率四個因素為自變量，以單因素試驗結(jié)果為參考依據(jù)，以刺梨單寧得率為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化這些因素，每個試驗組重復(fù)3次，取其平均值.試驗因素水平及編碼見表1.

表1 響應(yīng)面分析因素水平及編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 各因素的試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對單寧得率的影響

圖1 乙醇濃度對單寧提取得率的影響

由圖1可知，當(dāng)乙醇濃度為85%時，刺梨單寧提取得率最大；乙醇濃度低于85%時，隨著乙醇濃度的增加，刺梨得率隨之增大；乙醇濃度高于85%時，刺梨單寧提取得率反而有所下降.其原因可能是隨著乙醇濃度的提高，細(xì)胞中蛋白質(zhì)發(fā)生變性，阻礙了單寧的溶出，故提取得率下降.因此選擇85%的乙醇作為提取溶劑.

2.1.2 浸提時間對單寧得率的影響

圖2 浸提時間對單寧提取得率的影響

由圖2可知，當(dāng)浸提時間在10～40 min時，刺梨單寧的提取得率隨著時間的延長而逐漸提高；浸提時間為40 min時，刺梨單寧得率最大；浸提時間大于40 min，因為超聲波是一種機(jī)械波，長時間的作用于刺梨樣品會引起單寧結(jié)構(gòu)的破壞，同時又造成其他雜質(zhì)溶出，從而影響刺梨中單寧提取得率，故刺梨單寧提取得率下降；因此提取時間選擇40 min為宜.

2.1.3 料液比對單寧得率的影響

圖3 料液比對單寧提取得率的影響

由圖3可知，隨著料液比的提升，刺梨單寧提取得率逐漸增大，其原因是隨著提取溶劑的增加會提高傳質(zhì)推動力，促進(jìn)刺梨單寧的浸出；當(dāng)料液比達(dá)到1∶20(g/mL)之后，刺梨單寧得率增速放緩，細(xì)胞中單寧基本溶出，溶劑中單寧含量趨于飽和，增速不明顯，為節(jié)約提取成本及提取時間，選擇1∶20 (g/mL)的料液比為宜.

2.1.4 超聲功率對單寧得率的影響

圖4 超聲功率對單寧得率的影響

由圖4可知，當(dāng)超聲波提取功率在100～250 W時，隨著提取功率的增加刺梨單寧得率逐漸增大，其原因是提取功率較小時，超聲波不足以使刺梨細(xì)胞壁破裂，故提取單寧得率偏低，隨著超聲波功率的增加，超聲波產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)越強(qiáng)，促使刺梨樣品細(xì)胞組織破裂變形，有助于單寧溶出，故單寧得率逐漸增加；當(dāng)提取功率為250 W時，刺梨單寧提取得率最大；當(dāng)提取功率大于250 W時，刺梨單寧得率反而降低，其原因是其他水溶性雜質(zhì)的浸出會影響刺梨中單寧的提取得率，故功率選擇250 W為宜.

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化刺梨單寧提取工藝參數(shù)

2.2.1 Box-Behnken試驗及結(jié)果

以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，根據(jù)Box-Behnken試驗原理[26]，選用表1中的四因素三水平為響應(yīng)面優(yōu)化因素，應(yīng)用Design Expert 8.05軟件對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得到單寧含量與乙醇濃度(A)、超聲時間(B)、料液比(C)、超聲功率(D)等各因素的二次回歸方程：單寧得率=44.14+0.53A+0.16B+0.12C+0.27D+0.19AB-0.30AC-0.38AD+0.86BC-0.30BD+0.018CD-1.77A2-1.13B2-0.55C2-1.05D2.

2.2.2 回歸方差分析

由方差分析表3可知，模型的F=9.88，P<0.000 1表明該模型極顯著，失擬項P=0.917 8>0.05，說明失擬項對于純誤差不顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.908 1和調(diào)整系數(shù) RAdj2=0.816 2，可知擬合情況良好，能真實反映各影響因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系，能較好地對響應(yīng)值進(jìn)行分析與預(yù)測.乙醇濃度和超聲時間交互項、乙醇濃度和超聲功率交互項、乙醇濃度二次項、超聲時間二次項、超聲功率二次項極顯著；乙醇濃度一次項、料液比二次項顯著；其余因素的交互作用、二次項、一次項對刺梨單寧提取得率影響不顯著.根據(jù)F值的大小可知各因素對刺梨單寧提取得率影響的主次關(guān)系是乙醇濃度(A)>超聲功率(D)>超聲時間(B)>料液比(C).

表2中心組合試驗方案及結(jié)果

Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding extraction yields

試驗號因素ABCD刺梨單寧得率/%1-10-1040.94210-1042.533-101041.774101042.1750-10-140.946010-141.8870-10141.948010142.239-100-140.0910100-141.9511-100141.5412100141.871300-1042.08140-11042.34150-1-1042.7816011042.8817-110040.43181-10041.5619-1-10040.8420110041.912101-1-141.9822001-142.472300-1142.9324001142.7425000044.1926000044.527000044.5128000044.4729000044.03

表3 方差分析表

*P<0.05，表示差異顯著；**P<0.01，表示差異極顯著

2.2.3 響應(yīng)面分析

乙醇濃度、超聲時間、料液比、超聲功率中的兩個因素固定為零水平，就可以組合得到另外兩個因素的交互作用(見圖5)，在響應(yīng)面圖中曲面越陡峭，則表明兩因素的交互作用越顯著；反之，則說明因素變化對響應(yīng)值影響較?。挥蓤D5可知，AB與AD響應(yīng)曲面坡度最陡，說明乙醇濃度與超聲時間、乙醇濃度與超聲功率之間的交互作用對刺梨單寧得率影響顯著；其余因素的交互作用對刺梨單寧得率影響不顯著.

2.2.4 優(yōu)化與驗證試驗

應(yīng)用Design Expert 8.05軟件求解二次回歸方程，可以得到刺梨單寧提取工藝的最優(yōu)參數(shù)：乙醇濃度85.35%、超聲時間40.15 min、料液比1∶20.35(g/mL)、超聲功率250.56 W，軟件分析得到最大響應(yīng)值(單寧得率)為45.86%.考慮到單寧提取實際工作中操作的可行性將工藝參數(shù)修正為：乙醇濃度85%、超聲時間40 min、料液比1∶20(g/mL)、超聲功率250 W.為了驗證結(jié)果的可靠性，采用修正參數(shù)做3次平行試驗，其實驗結(jié)果單寧得率為44.98%，與預(yù)測值45.86%基本吻合.因此，應(yīng)用Design Expert 8.05軟件得到的單寧提取工藝參數(shù)真實可靠，具有實際應(yīng)用價值.

圖5 因素交互作用對刺梨單寧提率影響的響應(yīng)面圖

3 結(jié) 論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design Expert 8.05軟件優(yōu)化刺梨單寧提取工藝參數(shù)，最優(yōu)提取工藝參數(shù)是：乙醇濃度85%、超聲時間40 min、料液比1∶20 (g/mL)、超聲功率250 W.在上述最優(yōu)提取條件下，刺梨單寧提取得率為44.98%，模型的預(yù)測值為45.86%，實際提取得率與模型預(yù)測值基本吻合，表明所建的數(shù)學(xué)模型與實際情況擬合較好，說明所選的優(yōu)化提取參數(shù)可靠、穩(wěn)定，為刺梨單寧的提取工藝提供科學(xué)的理論依據(jù).