HPLC測定阿齊沙坦片的含量

（魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂 276000）

阿齊沙坦是血管緊張素Ⅱ受體（AT1）拮抗劑（ARB），能競爭性、可逆地阻斷血管緊張素Ⅱ與AT1受體的結合，起到降低血壓作用，其與血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）類降壓藥物相比，具有平穩(wěn)降壓、不會引起干咳的優(yōu)點[1-4]。阿齊沙坦作為新一代雙重功能的ARB，不僅能高選擇性阻斷AT1受體，單獨或聯合用藥均具有平穩(wěn)持久降血壓作用，還能通過部分激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）而對糖尿病患者產生潛在的保護作用，顯示出良好的治療前景[5-6]。2011年2月，阿齊沙坦的前藥阿齊沙坦酯（azilsartan medoxomil，商品名：Edarbi）由美國食品與藥品管理局（FDA）批準在美國上市[7]；2012年1月，阿齊沙坦（商品名：Azilva，アジFI（Ⅲ））由藥品與醫(yī)療器械管理局（PMDA）批準在日本上市[8]。目前，國內尚無本品上市。

按中國藥典以及相關要求[9-10]，本文經過反復摸索，建立了反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定阿齊沙坦片含量的方法，測得結果準確可靠，可用于阿齊沙坦片的含量測定。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀（安捷倫）；XS205DU型十萬分之一電子天平（Mettler Toledo）；乙腈為色譜純，磷酸二氫鈉為分析純，戊烷磺酸鈉為分析純，水為純化水；阿齊沙坦對照品（標定純度：99.8 %，批號：151001，魯南制藥），阿齊沙坦中間體1﹛2-乙氧基-1-[[2’-(羥基脒基聯苯-4-取代)甲基]-苯并咪唑]-7-羧酸甲酯，標定純度：99.1 %，批號：151001A，魯南制藥﹜，阿齊沙坦片（規(guī)格：20 mg，批號：151201，151202，151203，魯南制藥）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Welch Ultimate XB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-緩沖液（pH 2.8）（取1.56 g磷酸二氫鈉和0.87 g戊烷磺酸鈉，加入1000 ml水使溶解，用磷酸調節(jié)pH 2.8）（45:55）；檢測波長：251 nm；流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl。取阿齊沙坦對照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成每1 ml含0.2 mg的溶液，理論板數按阿齊沙坦峰計算不低于30 000。

2.2 溶液制備

取本品20片，混勻，研細，精密稱取細粉適量（約相當于阿齊沙坦20 mg），置入100 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另取阿齊沙坦對照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 ml約含0.2 mg的溶液，作為對照品溶液。取本品空白輔料適量（約相當于阿齊沙坦20 mg的處方比例量），置入100 ml量瓶，加甲醇適量，振搖并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為陰性空白溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 按上述色譜條件，取阿齊沙坦對照品和阿齊沙坦中間體1，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1 ml約含0.2 mg的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。分別取系統(tǒng)適用性溶液、對照品溶液、供試品溶液及陰性空白溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，HPLC圖譜見圖1。實驗結果表明：阿齊沙坦和阿齊沙坦中間體1的分離度為2.45，理論板數按阿齊沙坦峰計為51 254，符合規(guī)定；空白輔料在阿齊沙坦主成分保留時間處無輔料峰，對阿齊沙坦的含量測定無干擾。

圖1 阿齊沙坦片含量測定HPLC圖譜

2.3.2 線性與范圍試驗 稱取阿齊沙坦對照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 ml約含1 mg的溶液，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液1，2，5，3，10，5，50 ml，分別置入50，50，50，20，50，20，100 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取主峰面積，以濃度C（mg/ml）對主峰面積A進行線性回歸，得回歸方程為：A=10 981C+11.98，r=1.0000。結果表明：阿齊沙坦?jié)舛仍?.021～0.5232 mg/ml范圍內呈良好線性關系。

2.3.3 精密度試驗 取線性與范圍試驗項下對照品儲備液，分別精密量取8，10，12 ml，各置入50 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.1674 mg/ml（80 %），0.2092 mg/ml（100 %），0.251 mg/ml（120 %）的溶液，各配制3份。依法測定，記錄色譜圖。以峰面積考察精密度，計算RSD分別為0.23 %，0.09 %，0.16 %。表明精密度良好。

2.3.4 中間精密度試驗 由不同操作者，在不同時間，用不同儀器照重復性項下測定方法測定本品含量，平均含量為99.6 %，RSD為0.46 %（n=6）。

2.3.5 溶液穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，在配制后0～8 h每隔1 h進樣，按含量測定項下的方法測定，記錄峰面積，以0 h的峰面積作為100 %含量，其他時間與0 h峰面積相比，計算變化值。經試驗，供試品溶液在8 h內峰面積變化最大值為0.92 %<2.0 %，峰面積RSD為0.73 %，溶液在8 h內穩(wěn)定。

2.3.6 回收率試驗 取阿齊沙坦對照品適量與處方量的輔料，混合均勻，精密稱取適量，用甲醇制成每1 ml約含阿齊沙坦0.16，0.2，0.24 mg的溶液（80 %，100 %，120 %），各3份，作為供試品溶液，另精密稱取阿齊沙坦對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1 ml約含阿齊沙坦0.2 mg的溶液，作為對照品溶液。分別精密量取供試品溶液及對照品溶液各10 μl，注入色譜儀，記錄色譜圖。根據峰面積，按外標法計算回收率，平均回收率為100.15 %，RSD為0.65 %（n=9）。

2.3.7 重復性試驗 取本品20片，混勻，研細，取細粉適量（約相當于阿齊沙坦20 mg），置入100 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另取阿齊沙坦對照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 ml約含0.2 mg的溶液，搖勻，作為對照品溶液。分別精密量取供試及對照液各10 μl，注入色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算其含量，平均含量為100.8 %，RSD為0.82 %（n=6）。

2.3.8 耐用性試驗 取含量測定項下對照品溶液及供試品溶液，通過改變流速，調整流動相比例，更換同系列不同批的色譜柱進行試驗（改變其中一項條件時，其余條件均保持標準條件不變），計算含量，衡量本方法在微調各種色譜條件時的耐用性，結果見表1。

表1 阿齊沙坦片含量測定方法耐用性試驗結果

由表1可見，微調色譜條件后，測得含量符合規(guī)定，且無明顯變化，本方法耐用性較好。

2.3.9 樣品測定 取本品3批樣品（批號：151201，151202，151203）及對照品，依法測定，含量分別為99.23 %，99.78 %，99.58 %，均符合規(guī)定。

3 討論

在方法摸索過程中，當以乙腈-緩沖液（pH 2.8）（稱取1.56 g磷酸二氫鈉，加入1000 ml水使溶解，用磷酸調節(jié)pH 2.8）（20:80）為流動相時，色譜圖運行至30 min仍未出主峰；當以乙腈-緩沖液（pH 2.8）（稱取1.56 g磷酸二氫鈉，加入1000 ml水使溶解，用磷酸調節(jié)pH 2.8）（35:65）為流動相時，主峰保留時間約為17 min，對稱因子1.83，主峰與各雜質都達到基線分離。當以乙腈-pH 2.8緩沖液（稱取1.56 g磷酸二氫鈉和0.87 g戊烷磺酸鈉，加入1000 ml水使溶解，用磷酸調節(jié)pH至2.8）（45:55）為流動相時，主峰保留時間約為9 min，對稱因子0.95，與未增加離子對相比，峰形更對稱，即增加離子對試劑改善了主峰峰形。

方法學研究表明：通過線性與范圍試驗、精密度試驗、溶液穩(wěn)定性試驗、回收率試驗、重復性試驗、中間精密度試驗、耐用性試驗等研究，本法的精密度良好，回收率高，線性范圍廣，耐用性及溶液穩(wěn)定性良好，表明本方法適合阿齊沙坦片的含量測定。