HPLC同時(shí)測定曲安奈德新霉素貼膏中醋酸曲安奈德和麝香草酚含量

（江門市藥品檢驗(yàn)所，廣東 江門 529030）

曲安奈德新霉素貼膏是本地制藥企業(yè)生產(chǎn)的外用橡膠膏劑，其組分為醋酸曲安奈德、麝香草酚、硫酸新霉素等。主要用于局限性神經(jīng)性皮炎、慢性濕疹，也可用于小面積的銀屑病。近年還發(fā)現(xiàn)它可有效地治療結(jié)節(jié)性癢疹[1]、結(jié)節(jié)性疥瘡[2-3]、神經(jīng)性皮炎[4-5]、蕁麻疹[6]等，臨床應(yīng)用廣泛。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》WS-10001-(HD-1079)-2002-2006[7]，目前該標(biāo)準(zhǔn)中無含量測定部分。為提高藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文建立了同時(shí)測定醋酸曲安奈德和麝香草酚含量的高效液相色譜法（HPLC），該方法簡便、快速，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可作為該制劑的質(zhì)量控制的有效方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀，包括LC-20AT高壓泵，SPD-M20A二極管陣列檢測器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器（日本島津）；XS205DU電子分析天平（Mettler Toledo）。

1.2 試藥

麝香草酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量99.9 %，批號(hào)100508-201603）；醋酸曲安奈德對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量99.1 %，批號(hào)100125-201406）；曲安奈德新霉素貼膏（批號(hào)：160715，170107，170514）；甲醇（HPLC級，Honeywell，批號(hào)：R6AG1H），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-SP色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：30℃，流動(dòng)相：甲醇-水（57:43），流速：1.0 ml/min，檢測波長：240 nm，進(jìn)樣量：20 μl。理論板數(shù)以麝香草酚與醋酸曲安奈德峰計(jì)均不低5000，兩峰間的分離度大于5.0。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取醋酸曲安奈德對照品10 mg，置入25 ml量瓶，用85 %乙醇溶解并稀釋至刻度，另精密稱取麝香草酚對照品10 mg，置入50 ml量瓶，加85 %乙醇20 ml使溶解，再吸取先前制備的醋酸曲安奈德對照品溶液3 ml，混入50 ml量瓶中，用85 %乙醇稀釋至刻度，作為對照品儲(chǔ)備液。精密量取對照品儲(chǔ)備液6 ml，置入20 ml量瓶，用85 %乙醇稀釋至刻度，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品2片（48 cm2），除去蓋襯，剪成小塊，置入具塞錐形瓶，加入石油醚（60～90 ℃）25 ml，振搖，使膏體溶解。溶液轉(zhuǎn)移至燒杯中，容器及殘?jiān)檬兔眩?0～90 ℃）洗滌3次（15 ml，10 ml，10 ml），洗滌液并入上述溶液中，再用無水乙醇洗滌容器及殘?jiān)?次（20 ml，15 ml，10 ml），將乙醇洗滌液邊攪拌邊緩緩加入上述合并的石油醚液中，靜置30 min使沉淀完全，濾過。濾液置入分液漏斗，容器及沉淀用石油醚（60～90 ℃）-無水乙醇（4:3）混合液洗滌3次（10 ml，5 ml，5 ml），洗液并入分液漏斗，加水10 ml，振搖，靜置至分層完全，分取乙醇液置入100 ml量瓶，石油醚層用85 %乙醇液洗滌3次（15 ml，10 ml，5 ml），合并乙醇液于上述100 ml量瓶中，用85 %乙醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液取不含麝香草酚和醋酸曲安奈德的空白制劑樣品，按2.2.2項(xiàng)方法制備溶液，作為陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試

驗(yàn)分別取陰性對照溶液、對照品溶液、供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，考察系統(tǒng)適用性。HPLC色譜圖見圖1，由圖1可見，輔料及其他組分對測定組分無干擾。

圖1 陰性對照溶液、對照品溶液和供試品溶液的HPLC圖譜

2.4 線性試驗(yàn)

精密量取對照品儲(chǔ)備液4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 ml，分別置入20 ml量瓶，用85 %乙醇液稀釋至刻度，搖勻。按2.1項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），分別以麝香草酚和醋酸曲安奈德的濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)（X），計(jì)算回歸方程。結(jié)果表明：麝香草酚濃度與峰面積在0.0454～0.0907 mg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=2×106X+98.4，r=0.9995；醋酸曲安奈德在0.0050～0.0101 mg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=3×107X+17 286，r=0.9995。

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，麝香草酚、醋酸曲安奈德峰面積的RSD分別為0.67 %，0.47 %，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，于室溫下放置，分別在0，2，4，6，8，10，12 h測定峰面積，麝香草酚、醋酸曲安奈德峰面積的RSD分別為0.61 %，0.53 %。表明供試品溶液在室溫條件下，12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

選擇同一批號(hào)的曲安奈德新霉素貼膏，按2.2.2項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果：麝香草酚含量的RSD為0.89 %（n=6）；醋酸曲安奈德含量的RSD為0.25 %（n=6）。表明該方法重復(fù)性良好。

表1 麝香草酚的加樣回收率試驗(yàn)（n=6）

表2 醋酸曲安奈德的加樣回收率試驗(yàn)（n=6）

2.8 回收率試驗(yàn)

取曲安奈德新霉素貼膏（批號(hào)：160715）1片（24 cm2），共6份，分別精密加入麝香草酚、醋酸曲安奈德混合對照溶液（含麝香草酚3.162 mg/ml，醋酸曲安奈德0.442 mg/ml）1 ml，置入具塞錐形瓶，按2.2.2項(xiàng)方法制備回收率試驗(yàn)用供試品，測定峰面積，計(jì)算得麝香草酚的平均回收率為101.11 %，RSD=0.42 %（n=6）；醋酸曲安奈德的平均回收率為100.08 %，RSD=0.47 %（n=6）。表明該方法的準(zhǔn)確度較好，符合定量測定要求。結(jié)果見表1、表2。

2.9 樣品含量測定

按2.2.2項(xiàng)方法測定3個(gè)批次的供試品，按外標(biāo)法計(jì)算各組分的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別考察了以不同比例的甲醇-水不同作為流動(dòng)相的色譜圖，結(jié)果表明，甲醇比例大于70 %，供試品溶液中輔料峰與麝香草酚峰、醋酸曲安奈德峰的分離度較差；甲醇比例小于50 %，醋酸曲安奈德的保留時(shí)間太長，且峰形不理想；選擇甲醇-水比例為57:43，色譜峰之間的分離度均較好，且理論板數(shù)較高。

3.2 檢測波長的選擇

本實(shí)驗(yàn)對麝香草酚和醋酸曲安奈德進(jìn)行紫外光譜掃描，發(fā)現(xiàn)麝香草酚、醋酸曲安奈德分別在275 nm、240 nm處有較大吸收，但處方中麝香草酚與醋酸曲安奈德的投藥量之比為8:1，當(dāng)兩成分濃度比為8:1時(shí)，在240 nm波長處兩峰高接近，故選擇240 nm作為最佳檢測波長。

3.3 提取溶劑的選擇

供試品溶液的制備過程中，用石油醚（60～90 ℃）溶解膏體，再用乙醇沉淀后，所得混合溶液的提取是影響含量的關(guān)鍵步驟。曾嘗試了不同比例的乙醇水溶液進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)85 %乙醇水溶液既能有效地將目標(biāo)成份從石油醚中提取出來，又能和石油醚達(dá)到很好的分層效果，所以在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，盡量使乙醇水溶液中乙醇比例達(dá)85 %。為與供試品溶液保持一致，對照品溶液也采用85 %乙醇水溶液制備。

方法學(xué)考察表明本文建立的方法具有良好的線性、精密度、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，可同時(shí)對曲安奈德新霉素貼膏中麝香草酚和醋酸曲安奈德的含量進(jìn)行有效、簡便、準(zhǔn)確的定量，便于企業(yè)和監(jiān)管部門對產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行有效評價(jià)與監(jiān)控。