黃葵膠囊對糖尿病腎病TGF-β1、α-SMA、ILK表達(dá)影響的研究

楊筱瑤 王亦薇 施中凱

糖尿病腎?。―iabetic nephropathy，DN）是一種常見的糖尿病并發(fā)癥，其所致的慢性腎功能衰竭是糖尿病患者的主要死因[1-2]。糖尿病腎病的病理特點(diǎn)是腎小球硬化與腎間質(zhì)纖維化。α-SMA在腎臟的表達(dá)水平可以反映腎間質(zhì)纖維化的嚴(yán)重程度[3]。TGF-β1被認(rèn)為是重要的促腎間質(zhì)纖維化因子之一[4]。而ILK參與TGF-β1誘導(dǎo)EMT的重要步驟[5]。因此，探索一種恢復(fù)糖尿病腎病腎臟功能，延緩腎臟纖維化的藥物十分必要。本研究通過觀察黃葵膠囊對糖尿病腎病大鼠生化指標(biāo)、腎臟結(jié)構(gòu)改變及腎間質(zhì)纖維化關(guān)鍵因子表達(dá)的影響，來探索黃葵膠囊對糖尿病腎病的治療效果及其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

45只體重170 g，8周齡左右的SPF級雄性SD（Sprague Dawley）大鼠，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物中心，所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。黃葵膠囊（國藥準(zhǔn)字Z19990040）購自江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；STZ購自Sigma公司。

1.2 研究方法

給予SD大鼠高糖、高脂飲食（常規(guī)飼料加入20%糖，10%豬油，2.5%膽固醇），均自由飲水，于8周后禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液3.5 ml/kg，進(jìn)行麻醉，之后行左側(cè)腎臟切除術(shù)。術(shù)后2周禁食18 h后按50 mg/kg一次性給與STZ腹腔注射，72 h后測尾靜脈血糖并留24 h尿。以血糖水平＞16.7 mmol/L、尿糖陽性，并穩(wěn)定5天且2周后測尿蛋白陽性，作為糖尿病腎病模型建立標(biāo)準(zhǔn)。將45只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、糖尿病腎病組與黃葵處理組三組，每組15只。在造模成功后，黃葵處理組大鼠每天按0.2 g/kg給予灌胃，正常對照組及糖尿病腎病組也同時給予蒸餾水灌胃1 ml，每天1次，持續(xù)8周。于第8周末，用代謝籠收集24 h尿液測定尿蛋白水平，采集血液檢測血清肌酐、尿素氮，取腎臟組織進(jìn)行HE染色，觀察并提取RNA檢測TGF-β1、α-SMA及ILK的mRNA表達(dá)水平。

1.3 評價(jià)方法

1.3.1 總RNA提取及qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 分別取三組動物的腎臟組織50 mg研磨后，用Trizol法提取相關(guān)基因總RNA，用紫外分光光度儀檢測RNA濃度，進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，經(jīng)40個循環(huán)，95℃延伸15 s。以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算相關(guān)基因mRNA表達(dá)的相對水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 生化指標(biāo)分析 用代謝籠收集24 h尿液，檢測尿蛋白。采集大鼠血清后用自動生化儀檢測肌酐、尿素氮水平。

1.3.3 HE染色觀察腎臟組織病理改變 用4%多聚甲醛固定腎臟組織，并用石蠟包埋，并對病理切片進(jìn)行HE染色，用光鏡觀察大鼠腎臟組織的病理改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，兩組間變量用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃葵膠囊對大鼠血清肌酐、尿素氮及蛋白尿的影響

黃葵膠囊可以明顯降低大鼠血清肌酐、尿素氮及蛋白尿（表1）。

2.2 大鼠腎臟組織中TGF-β1、α-SMA及ILK mRNA的表達(dá)

黃葵膠囊可明顯降低TGF-β1、α-SMA及ILK mRNA的表達(dá)（圖1）。

圖1 各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、α-SMA及ILK mRNA的表達(dá)

2.3 HE染色檢測

黃葵膠囊可改善腎小球硬化、系膜增生和腎小球基底膜增厚的情況（圖2）。

圖2 各組大鼠HE染色比較

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病患者的首要致死因素，給患者造成很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，其病理改變主要包括腎臟纖維化，腎小球和腎小管功能障礙，從而導(dǎo)致蛋白尿和腎小球?yàn)V過不全[6]。有證據(jù)顯示TGF-β1在糖尿病腎病患者中有重要作用，在糖尿病腎病中，TGF-β1被認(rèn)為是腎臟纖維化與腎臟增大的重要調(diào)節(jié)因子。在STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠模型中，TGF-β1顯著增高，可能對腎小球基底膜增厚、腎小球硬化和膠原蛋白沉積有重要影響[7]。α-SMA在成肌纖維細(xì)胞中表達(dá)，在糖尿病腎病中α-SMA表達(dá)升高可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)累積，從而引起腎小球閉塞。在糖尿病腎病大鼠中誘導(dǎo)α-SMA高表達(dá)可促進(jìn)腎小球硬化的進(jìn)展。而ILK在糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化過程中起到十分重要的作用。

表1 各組大鼠肌酐、尿素氮及蛋白尿情況

很多研究表明，傳統(tǒng)中藥是治療糖尿病的重要資源，并可以延緩糖尿病腎病等其并發(fā)癥的發(fā)展[8-9]。已經(jīng)確認(rèn)黃葵膠囊在很多慢性腎臟疾病都有減輕血尿，蛋白尿，改善腎功能的作用[10-12]。然而，黃葵膠囊治療糖尿病腎病的分子機(jī)制尚不明確。本研究評估了在STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠中黃葵膠囊的治療作用，及其中可能的機(jī)制。我們的結(jié)果表明黃葵膠囊明顯改善糖尿病腎病大鼠的神纖維化，顯著降低了大鼠血清肌酐、尿素氮和尿蛋白。同時，我們發(fā)現(xiàn)黃葵膠囊可下調(diào)TGF-β1、α-SMA和ILK的mRNA表達(dá)水平。綜上，黃葵膠囊在糖尿病腎病中有明確的治療作用，并可能通過降低TGF-β1、α-SMA、ILK表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)。