苗藥理氣活血滴丸對慢性心力衰竭模型大鼠的保護作用研究

陳向云 李堯鋒 劉楊 陳云志 張永萍 徐劍 田紫平 熊仕芳 楊長福

摘 要 目的：研究苗藥理氣活血滴丸對慢性心力衰竭（CHF）模型大鼠的保護作用。方法：將60只SD大鼠隨機分為正常組（10只）和造模組（50只），造模組大鼠皮下注射異丙腎上腺素（ISO）以復(fù)制CHF模型。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、依那普利組（陽性對照，20 mg/kg）和理氣活血滴丸低、中、高劑量組（43.75、87.50、175.00 mg/kg），每組10只。各給藥組大鼠每天灌胃相應(yīng)藥物1次，正常組和模型組大鼠均灌胃等容生理鹽水。連續(xù)給藥4周后，監(jiān)測大鼠心功能指標[左心室內(nèi)壓峰值（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax）、左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmax）]；計算左心質(zhì)量指數(shù)；采用蘇木精-伊紅染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化；采用Masson染色觀察心肌纖維化情況，并計算膠原容積分數(shù)（CVF）；采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清中腦鈉肽（BNP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）的含量。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠心肌組織損傷嚴重，心肌纖維化程度明顯加重，其LVSP、±dp/dtmax均顯著降低，LVEDP、左心質(zhì)量指數(shù)、CVF以及血清中BNP、TNF-α、IL-6的含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，依那普利組和理氣活血滴丸中、高劑量組大鼠心肌組織損傷和心肌纖維化程度均明顯減輕，其LVSP、±dp/dtmax均顯著升高，LVEDP、左心質(zhì)量指數(shù)、CVF以及血清中BNP、TNF-α、IL-6的含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：理氣活血滴丸對ISO誘導(dǎo)的CHF模型大鼠具有一定的保護作用，能顯著改善其心功能指標，減輕心肌組織受損和心肌纖維化程度，降低血清中BNP、TNF-α、IL-6的含量。

關(guān)鍵詞 苗藥；理氣活血滴丸；慢性心力衰竭；心功能；心肌纖維化；炎癥細胞因子；大鼠

中圖分類號 R285；R541.6+1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）16-2233-05

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the protective effects of Miao medicine Liqi huoxue dropping pills on chronic heart failure （CHF） model rats. METHODS： Totally 60 SD rats were randomly divided into normal group （10 rats） and modeling group （50 rats）. Modeling group was given subcutaneous injection of isoproterenol （ISO） to induce CHF model. After modeling， CHF model rats were randomly divided into model group， enalapril group （positive control， 20 mg/kg） and Liqi huoxue dripping pills low-dose， medium-dose and high-dose groups （43.75， 87.50， 175.00 mg/kg）， with 10 rats in each group. Administration groups were given relevant medicine intragastrically once a day； normal group and modeling group were both given constant volume of normal saline intragastrically. After 4 weeks of administration， the cardiac function indexes （LVSP， LVEDP， +dp/dtmax， -dp/dtmax） of rats were monitored. The left ventricular mass index was calculated. The morphologic changes of myocardial tissue were observed by HE staining. The myocardial fibrosis was observed by Masson staining， and CVF was calculated. The serum contents of BNP， TNF-α and IL-6 were detected by ELISA. RESULTS： Compared with normal group， there was severe myocardial tissue injury of rats and the degree of myocardial fibrosis increased significantly in model group； the levels of LVSP and ±dp/dtmax were decreased significantly， while LVEDP， left ventricular mass index， CVF， serum contents of BNP， TNF-α and IL-6 were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， myocardial tissue injury and the degree of myocardial fibrosis were relieved significantly in enalapril group and Liqi huoxue dripping pills medium-dose and high-dose groups； while the levels of LVSP and ±dp/dtmax were increased significantly； LVEDP， left ventricular mass index， CVF， serum contents of BNP， TNF-α and IL-6 were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Liqi huoxue dripping pills can protect ISO-induced CHF model rats， improve cardiac function indexes， relieve myocardial tissue injury and the degree of myocardial fibrosis and reduce the serum contents of BNP， TNF-α and IL-6.

KEYWORDS Miao medicine； Liqi huoxue dripping pills； Chronic heart failure； Cardiac function； Myocardial fibrosis； Inflammatory cytokine； Rat

近年來，慢性心力衰竭（CHF）已成為全球性的健康問題，對人類健康造成嚴重威脅[1]。美國心臟協(xié)會（AHA）將CHF定義為一種復(fù)雜的臨床綜合征，是各種心臟結(jié)構(gòu)或功能疾病損傷心室充盈和（或）射血能力的結(jié)果，是各種病因所致心臟疾病的終末階段。臨床主要采用利尿藥、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗藥、β受體阻斷藥等藥物對CHF進行治療，雖然上述治療藥物可明顯改善CHF患者的預(yù)后，但仍存在治療費用高、不良反應(yīng)多等問題[2]。中醫(yī)藥因在提高生活質(zhì)量、減少毒副作用、降低復(fù)發(fā)率、延長遠期存活時間等方面具有明顯的優(yōu)勢，使得越來越多的CHF患者選用中藥或中成藥與西藥聯(lián)合治療的方法[3-4]。

CHF歸屬于中醫(yī)學(xué)心悸、怔忡、心痹等病癥范疇，中醫(yī)認為該癥多由外邪反復(fù)侵襲、過度勞累思慮所致。心主身之血脈，外邪久客血脈，氣血運行不暢，故而氣滯血瘀。苗藥理氣活血滴丸（曾用名“米槁心樂滴丸”）是根據(jù)貴州苗族民間驗方及傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論研制而成的中藥復(fù)方制劑，由苗藥米槁（又名大果木姜子）以及川芎、薤白、艾片等藥材組成，具有理氣活血、溫陽寬胸的功效。臨床研究表明，該藥治療冠心病心絞痛等癥的效果較好[5]。本課題組前期實驗研究也表明，理氣活血滴丸對心肌缺血再灌注損傷模型大鼠的心肌組織具有明顯的保護作用[6-7]。在此基礎(chǔ)上，本研究以異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)復(fù)制大鼠CHF模型，通過監(jiān)測其心功能指標，分析心肌組織病理學(xué)變化及心肌纖維化情況，檢測血清中腦鈉肽（BNP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素6（IL-6）的含量，初步探討理氣活血滴丸對CHF模型大鼠的保護作用，以期為其臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BL-420F型生物機能實驗系統(tǒng)、HX-101E型動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）；RM2016型轉(zhuǎn)輪式切片機（德國Leica公司）；E200型正置顯微鏡（日本Nikon公司）；Arioskan Flash型全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 藥品與試劑

理氣活血滴丸（貴州益佰制藥股份有限公司，批準文號：國藥準字Z20120037，批號：20161002，規(guī)格：每丸重25 mg）；馬來酸依那普利片（揚子江藥業(yè)集團江蘇制藥股份有限公司，批準文號：國藥準字H32026567，批號：20160806，規(guī)格：10 mg）；鹽酸異丙腎上腺素（批號：I8480，規(guī)格：5 g）、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號：20170618）、Masson三色染色試劑盒（含蘇木素、麗春紅品紅、苯胺藍染色液，批號：20170826）均購自北京索萊寶科技有限公司；大鼠BNP酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司，批號：xl-Er0038）；大鼠TNF-α ELISA試劑盒（批號：20171006）和大鼠IL-6 ELISA試劑盒（批號：20170912）均購自深圳欣博盛生物科技有限公司；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

清潔級SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2014-0010]。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將60只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為兩組：正常組（10只）和造模組（50只）。造模組大鼠皮下注射ISO 170 mg/kg（溶劑為生理鹽水），每隔24 h給藥1次，共2次；正常組大鼠皮下注射等容生理鹽水，注射頻次與造模組一致。誘導(dǎo)4周后，測定大鼠血清BNP含量，若其BNP含量顯著升高，則表明CHF模型復(fù)制成功[8-9]。將造模成功的大鼠隨機分為5組：模型組、依那普利組（陽性對照，20 mg/kg，參照前期預(yù)實驗結(jié)果并根據(jù)人用臨床劑量的60倍換算而得）和理氣活血滴丸低、中、高劑量組（43.75、87.50、175.00 mg/kg，分別根據(jù)人用臨床劑量的3.5、7、14倍換算而得）。各給藥組大鼠均按1 mL/100 g灌胃相應(yīng)藥物（溶劑均為生理鹽水），每天1次，連續(xù)4周；正常組和模型組大鼠均灌胃等容生理鹽水。

2.2 心功能監(jiān)測

末次給藥后，稱定所有大鼠的體質(zhì)量，腹腔注射20%烏拉坦進行麻醉，將其以仰臥位固定于實驗臺上，行氣管插管，并連接動物呼吸機（頻率80～90次/min，潮氣量2.5 mL/100 g，呼、吸比3 ∶ 2）。分離右側(cè)頸總動脈，夾閉其遠心端和近心端，在動脈壁剪一小口，逆行刺入帶肝素的靜脈穿刺套管針，慢慢退出穿刺針，緩慢推進套管至左心室，將穿刺套管與生物機能實驗系統(tǒng)的壓力換能器連接，監(jiān)測各組大鼠心功能指標，記錄其左心室內(nèi)壓峰值（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax）和左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmax）。

2.3 左心質(zhì)量指數(shù)分析

摘取大鼠心臟，稱取其左心室質(zhì)量，計算左心室質(zhì)量與大鼠體質(zhì)量的比值，即得左心質(zhì)量指數(shù)[10-11]。

2.4 心肌組織形態(tài)學(xué)觀察

收集大鼠左心室冠狀面中部的環(huán)狀心肌組織，以4%多聚甲醛固定后，經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明，浸蠟，包埋，制得常規(guī)心肌組織石蠟包埋塊。切片（厚度為4 μm）后，經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化，行HE染色，以中性樹膠封片后置顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化情況。

2.5 心肌纖維化情況觀察

取“2.4”項下心肌組織石蠟包埋塊，切片（厚度為4 μm）后，經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化，行Masson染色，以中性樹膠封片后置顯微鏡下觀察各組大鼠心肌纖維化情況。正常組織中膠原纖維呈藍色，肌纖維和胞漿呈紅色，紅細胞呈橘紅色，胞核呈黑藍色。采用ImagePro Plus 6.0圖像分析軟件測定膠原纖維面積，計算其與心肌組織總面積的比值，即膠原容積分數(shù)（CVF）[12]。

2.6 血清中BNP、TNF-α、IL-6含量的測定

采集大鼠腹主動脈血5 mL，于4 ℃下以2 500 r/min離心10 min，取上層血清，于-20 ℃保存，待測。采用ELISA法以全波長掃描式多功能讀數(shù)儀測定各組大鼠血清中BNP、TNF-α、IL-6的含量，嚴格按照各試劑盒說明書操作。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 15.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 理氣活血滴丸對CHF模型大鼠心功能的影響

與正常組比較，模型組大鼠LVSP、±dp/dtmax均顯著降低，LVEDP顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，依那普利組和理氣活血滴丸中、高劑量組大鼠LVSP、±dp/dtmax均顯著升高，LVEDP均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而理氣活血滴丸低劑量組大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dtmax與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），詳見表1（表中，1 mmHg=0.133 kPa）。

3.2 理氣活血滴丸對CHF模型大鼠左心質(zhì)量指數(shù)的影響

與正常組比較，模型組大鼠的左心質(zhì)量指數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，依那普利組和理氣活血滴丸中、高劑量組大鼠的左心質(zhì)量指數(shù)均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而理氣活血滴丸低劑量組大鼠的左心質(zhì)量指數(shù)與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），詳見表1。

3.3 理氣活血滴丸對CHF模型大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的影響

正常組大鼠的心肌細胞排列整齊，肌纖維連接緊密，胞核清晰；模型組大鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)被破壞，肌纖維斷裂，排列極其紊亂，肌束間隙及肌周間隙模糊不清，部分肌纖維壞死，肌細胞出現(xiàn)絲狀物或溶解消失、形成空泡；理氣活血滴丸低劑量組大鼠心肌細胞無正常結(jié)構(gòu)形態(tài)，肌纖維稀疏、排列紊亂，肌束間隙及肌周間隙模糊不清，出現(xiàn)灶性壞死、心肌纖維溶解斷裂，部分心肌細胞出現(xiàn)絲狀物或顆粒物，心肌細胞間隙明顯增寬；依那普利組和理氣活血滴丸中、高劑量組大鼠心肌細胞排列較整齊，肌纖維斷裂較少，部分間隙稍有增寬，詳見圖1。

3.4 理氣活血滴丸對CHF模型大鼠心肌纖維化的影響

與正常組比較，模型組大鼠心肌組織中膠原纖維明顯增多，心肌纖維化程度明顯加重；與模型組比較，理氣活血滴丸低劑量組大鼠心肌纖維化程度并無明顯變化，但依那普利組和理氣活血滴丸中、高劑量組大鼠心肌纖維化程度均明顯減輕，詳見圖2。

與正常組比較，模型組大鼠的CVF顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，依那普利組和理氣活血滴丸中、高劑量組大鼠的CVF均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；而理氣活血滴丸低劑量組大鼠的CVF與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），詳見表1。

3.5 理氣活血滴丸對CHF模型大鼠血清中BNP、TNF-α、IL-6含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中BNP、TNF-α、IL-6的含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，依那普利組和理氣活血滴丸中、高劑量組大鼠血清中BNP、TNF-α、IL-6的含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；而理氣活血滴丸低劑量組大鼠血清中BNP、TNF-α、IL-6的含量雖較模型組有所下降，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），詳見表2。

4 討論

ISO是一種β受體激動藥，能夠誘導(dǎo)大鼠彌散性心肌壞死和間質(zhì)纖維化，使其左心室增厚，從而引發(fā)心肌重構(gòu)、心肌病和心力衰竭的癥狀[10，12-13]，主要表現(xiàn)為±dp/dtmax降低、LVEDP升高[14]。ISO誘導(dǎo)的CHF模型是一種非破壞性模型，具有操作簡單、重現(xiàn)性好等特點[12]。因此，本研究采用ISO誘導(dǎo)的方法復(fù)制CHF大鼠模型。依那普利作為第三代血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，能有效抑制ISO誘導(dǎo)的心肌改變[15]，故本研究將其作為陽性對照藥物。

臨床上，心功能指標可直接反映心室舒張與收縮功能。本研究發(fā)現(xiàn)，在皮下注射ISO復(fù)制CHF模型后，大鼠LVEDP顯著升高，LVSP、±dp/dtmax均顯著降低。其中，LVEDP的升高提示心臟前負荷增加、左心室不完全排空或左心室功能受損，這種現(xiàn)象經(jīng)常出現(xiàn)在心肌梗死或心力衰竭患者中[16-17]；LVSP的降低提示心肌收縮力降低，±dp/dtmax的降低反映心室壁張力變化率減小[18-19]。以上結(jié)果表明，大鼠心室舒張功能發(fā)生障礙。經(jīng)藥物處理后，與模型組比較，依那普利組和理氣活血滴丸中、高劑量組大鼠LVSP、±dp/dtmax均顯著升高，LVEDP均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。這表明中、高劑量的理氣活血滴丸可顯著逆轉(zhuǎn)ISO誘導(dǎo)的CHF模型大鼠LVEDP的上升及LVSP、±dp/dtmax的下降，有助于改善其心功能。

經(jīng)ISO誘導(dǎo)后，CHF模型大鼠左心質(zhì)量指數(shù)、CVF均顯著增加，其心肌組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，大鼠心肌組織形態(tài)被破壞，膠原纖維明顯增多，心肌纖維化程度明顯加重，嚴重影響了大鼠的心功能。心室重構(gòu)是CHF發(fā)展的根本機制，心室肥厚和心肌纖維化是心室重構(gòu)的重要表現(xiàn)形式，兩者均可改變心臟舒張與收縮功能，在CHF發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用[20]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，依那普利組和理氣活血滴丸中、高劑量組大鼠心肌組織損傷及心肌纖維化程度均明顯減輕；且左心質(zhì)量指數(shù)、CVF均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。這表明中、高劑量的理氣活血滴丸能顯著改善CHF模型大鼠的左心質(zhì)量指數(shù)和CVF，減輕左心室肥厚和心肌纖維化程度，進而改善心臟的舒張與收縮功能。

BNP是一種主要由心室心肌細胞分泌的利鈉肽類激素，具有利鈉、利尿、抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、擴張血管等抗心力衰竭的作用[21]。有研究表明，CHF患者血清中BNP的含量持續(xù)升高，其升高程度與CHF的嚴重程度呈正相關(guān)，因此檢測BNP的含量可作為CHF診斷的一種手段[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，ISO誘導(dǎo)的CHF模型大鼠血清中BNP的含量顯著升高，提示模型復(fù)制成功；而依那普利組和理氣活血滴丸中、高劑量組大鼠血清中BNP的含量均較模型組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。這提示中、高劑量的理氣活血滴丸均具有明顯的抗CHF作用。TNF-α和IL-6是與CHF密切相關(guān)的兩種炎癥細胞因子[23]。在正常的心肌細胞中，TNF-α呈低表達；而當心臟受損時，心肌細胞因受到刺激，TNF-α表達增加；同時有研究表明，血清中TNF-α的含量與CHF的嚴重程度及臨床特征密切相關(guān)，提示TNF-α可作為CHF診斷的血清標志物[24-25]。IL-6亦為多功能細胞因子，其與TNF-α共同通過抑制心肌收縮力、誘導(dǎo)心室重塑、促使心肌細胞凋亡等方式參與CHF的發(fā)生與發(fā)展[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，ISO誘導(dǎo)的CHF模型大鼠血清中TNF-α、IL-6的含量均顯著升高；而依那普利組和理氣活血滴丸中、高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-6的含量均較模型組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。這提示中、高劑量的理氣活血滴丸可顯著降低CHF模型大鼠血清中TNF-α、IL-6的含量，對ISO誘導(dǎo)的心肌損傷具有明顯的改善作用，可減輕心肌細胞的炎性損傷。

綜上所述，理氣活血滴丸對ISO誘導(dǎo)的CHF模型大鼠具有一定的保護作用，能顯著改善其心功能指標，減輕心肌組織受損和心肌纖維化程度，降低血清中BNP、TNF-α、IL-6的含量。但理氣活血滴丸改善CHF的具體作用機制還有待進一步探究。

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（收稿日期：2018-02-11 修回日期：2018-05-31）

（編輯：張元媛）