肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D影響肝癌細(xì)胞對索拉菲尼耐藥的機(jī)制研究

馬清霞 王園園 馬海龍 李培宇 楊月成 楊志宏 劉佳 姜國輝

中圖分類號 R735.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）17-2337-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.08

摘 要 目的：研究肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D（MEF2D）影響肝癌細(xì)胞PLC對索拉菲尼耐藥的作用機(jī)制。方法：建立索拉菲尼肝癌耐藥細(xì)胞株（PLC-DR3），以過表達(dá)Ad-MEF2D載體感染PLC（PLC-AdMEF2D），CCK-8法檢測索拉菲尼處理后PLC、PLC-DR3、PLC-AdMEF2D增殖能力，并計(jì)算索拉菲尼對各細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。采用Western blot法檢測PLC、PLC-DR3中MEF2D、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、磷酸化ERK（p-ERK）的表達(dá)和PLC-AdMEF2D細(xì)胞中MEF2D、ERK、p-ERK、促分裂原活化蛋白激酶（MEK）、磷酸化MEK（p-MEK）、快速發(fā)育生長因子同源蛋白4（SPRY4）的表達(dá)。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D mRNA和SPRY4 mRNA的表達(dá)。結(jié)果：索拉菲尼對PLC、PLC-DR3、PLC-AdMEF2D的IC50分別為（8.23±0.06）、（21.80±0.06）、（19.46±0.063） ?mol/L。與PLC比較，PLC-DR3、PLC-AdMEF2D的IC50明顯升高（P<0.001）；PLC-DR3中總ERK表達(dá)量基本不變，MEF2D、p-ERK的蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.001）；PLC-AdMEF2D中總ERK、MEK表達(dá)量基本不變，p-ERK和p-MEK蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P<0.01），SPRY4蛋白表達(dá)明顯減弱（P<0.001），SPRY4 mRNA表達(dá)水平明顯減弱（P<0.001）。結(jié)論：MEF2D可能通過抑制SPRY4的表達(dá)，激活RAS/ERK通路，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞對索拉菲尼耐藥。

關(guān)鍵詞 索拉菲尼；肝癌細(xì)胞；耐藥機(jī)制；肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the mechanism of myocyte enhancer factor 2D （MEF2D） affecting the resistance of hepatoma carcinoma cells PLC to sorafenib. METHODS： The liver cancer drug resistance cell strain （PLC-DR3） of sorafenib were established， over expression Ad-MEF2D carrier infected liver cancer cell PLC （PLC-AdMEF2D） and CCK-8 assay was used to determine the proliferation of PLC， PLC-DR3 and PLC-AdMEF2D， and the half inhibitory concentration （IC50） of sorafenib on each cell was calculated. Western blot assay was used to detect the protein expression of MEF2D， ERK and p-ERK in PLC and PLC-DR3， the protein expression of MEF2D， ERK， p-ERK， MEK， p-MEK and SPRY4 in PLC-AdMEF2D. RT-PCR was adopted to detect the mRNA expression of MEF2D and SPRY4 in PLC and PLC-AdMEF2D. RESULTS： IC50 of sorafenib on PLC， PLC-DR3， PLC-AdMEF2D was （8.23±0.06），（21.80±0.06），（19.46±0.063） ?mol/L. Compared with PLC， the IC50 of PLC-DR3 and PLC-AdMEF2D was increased significantly （P<0.001）； the total expression of ERK in PLC-DR3 keep stale， while the protein expression of MEF2D and p-ERK was increased significantly （P<0.001）； total expression of ERK and MEK in PLC-AdMEF2D kept stable， but the protein expression of p-ERK and p-MEK were increased significantly （P<0.01）， the protein expression of SPRY4 was decreased significantly （P<0.001）， while mRNA expression of SPRY4 was decreased significantly （P<0.001）. CONCLUSIONS： MEF2D can promote the generation and development of drug resistance of hepatoma carcinoma cells to sorafenib by inhibiting expression of SPRY4 and active of RAS/ERK pathway.

KEYWORDS Sorafenib； Hepatoma carcinoma cells； Resistant mechanism； MEF2D

肝癌是我國最常見的腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國新增肝癌患者的病例數(shù)和死亡人數(shù)居全世界首位[1]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，肝癌治療的方式和方法有了大幅度的改善，但現(xiàn)有的治療手段仍無法顯著提高肝癌患者的生存率。肝癌易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等問題仍然困擾著醫(yī)務(wù)工作者和科研工作者[1]。

目前，RAS/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）抑制劑索拉菲尼在治療肝癌上取得了一定的療效，是肝癌晚期系統(tǒng)性治療的唯一選擇[2]。RAS/ERK信號通路是肝癌的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子，也是索拉菲尼的重要治療靶點(diǎn)[3]。RAS/ERK信號通路由一系列可以發(fā)生級聯(lián)激活的蛋白激酶組成，如RAS、有絲分裂原激活的蛋白激酶（RAF）、促分裂原活化蛋白激酶（MEK）、ERK以及通路負(fù)調(diào)控因子快速發(fā)育生長因子同源蛋白4（SPRY4）等，處于激活狀態(tài)的ERK影響一系列與增殖、存活、侵襲和免疫逃避相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定性、入核能力或促轉(zhuǎn)錄活性，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。然而部分肝癌患者對索拉菲尼存在不同程度的耐藥，使得其預(yù)后較差。相關(guān)研究表明索拉菲尼耐藥可能與RAS/ERK級聯(lián)激活相關(guān)[4]。作為肌細(xì)胞增強(qiáng)因子的成員之一，肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D（MEF2D）不僅在人體發(fā)育和生理功能中發(fā)揮重要作用[5]，而且MEF2D異常表達(dá)與包括肝癌在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展也關(guān)系密切[6]。研究發(fā)現(xiàn)，MEF2D的表達(dá)在肝癌中顯著升高，不僅促進(jìn)肝癌的惡化，還與肝癌患者的預(yù)后存在負(fù)相關(guān)[7]。因此，筆者思考MEF2D是否在肝癌細(xì)胞對索拉菲尼的耐藥中扮演著重要角色？基于此，筆者構(gòu)建了索拉菲尼耐藥肝癌細(xì)胞株，從細(xì)胞水平探究MEF2D蛋白及RAS/ERK通路的激活是否在肝癌細(xì)胞對索拉菲尼的耐藥中起著關(guān)鍵作用；通過過表達(dá)MEF2D，從細(xì)胞水平探究MEF2D蛋白是否負(fù)向調(diào)控RAS/ERK通路的SPRY4因子，使通路中ERK、MEK磷酸化增加促進(jìn)肝癌細(xì)胞對索拉菲尼的耐藥。

1 材料

1.1 儀器

3543 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Mmultiskan FC酶標(biāo)儀、SimpliAmpTM熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）儀均購自美國賽默飛世爾科技公司；PowerPac300電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Eclipse Ts100熒光顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 藥品與試劑

索拉菲尼（美國Selleck生物科技有限公司，批號：S1040，純度：99.5%）；DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基（美國生命技術(shù)公司）；腺病毒載體（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司）；Trizol總RNA提取試劑（碧云天生物研究所，批號：20171105）；qRT-PCR檢測試劑盒（天根生化科技有限公司，批號：R6424）；CCK-8試劑盒（上海七海復(fù)泰生物科技有限公司，批號：20170106）；RIPA裂解液（北京索萊寶生物科技公司，批號：20171206）；MEF2D抗體、MEK抗體、p-MEK抗體、ERK抗體、p-ERK抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、兔二抗均購置美國Abcam公司。

1.3 細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞PLC購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

PLC細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力

將PLC以5×103個(gè)/孔分別接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，加入終濃度為0、2、4、8、16、32 ?mol/L的索拉菲尼，培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 ?L CCK-8試劑，孵育3 h后，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定細(xì)胞的光密度（OD）值。OD值越大表示細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（%）：[空白組（索拉菲尼終濃度為0 ?mol/L）OD-索拉菲尼處理組OD]/空白組OD×100%，然后通過SPSS軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3 索拉菲尼耐藥肝癌細(xì)胞株的構(gòu)建

將對數(shù)生長期的PLC接種于含有10%胎牛血清的含藥DMEM培養(yǎng)基（索拉菲尼終濃度為其對PLC的IC50）中，孵育72 h后，棄去含藥培養(yǎng)基，加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后用PBS清洗3遍，再用該含藥DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，共進(jìn)行3次，構(gòu)建索拉菲尼耐藥肝癌細(xì)胞株（PLC-DR3）。然后用倒置顯微鏡觀察PLC和PLC-DR3的細(xì)胞形態(tài)變化，利用“2.2”項(xiàng)下方法檢測PLC-DR3增殖能力并計(jì)算索拉菲尼對PLC-DR3的IC50，根據(jù)公式計(jì)算耐藥指數(shù)：PLC-DR3細(xì)胞IC50/PLC細(xì)胞IC50。

2.4 過表達(dá)MEF2D對PLC增殖的影響

將10 MOI（感染復(fù)數(shù)）的腺病毒載體Ad-MEF2D（過表達(dá)MEF2D載體）感染PLC（感染后細(xì)胞命名為PLC-AdMEF2D）。利用“2.2”項(xiàng)下方法檢測PLC-AdMEF2D的增殖能力并計(jì)算索拉菲尼對其的IC50。

2.5 Western blot法檢測PLC、PLC-DR3、PLC-AdMEF2D中蛋白的表達(dá)

取PLC、PLC-DR3、PLC-AdMEF2D分別按照RIPA裂解液的操作說明提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，變性后進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)入聚偏二氟乙烯膜，經(jīng)5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別置于稀釋1 000倍的一抗液（MEF2D、ERK、p-ERK、MEK、p-MEK、SPRY4抗體），封口，4 ℃孵育過夜，PBS洗膜3次后，加入稀釋1 000倍的兔二抗，室溫孵育1 h，PBS洗膜3次后進(jìn)行顯影，檢測灰度值。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示MEF2D、ERK、p-ERK、MEK、p-MEK、SPRY4的相對表達(dá)水平。

2.6 qRT-PCR法檢測PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D、SPRY4 mRNA的表達(dá)

取PLC、PLC-AdMEF2D按照Trizol說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后根據(jù)qPCR試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增。MEF2D的上游引物序列為5′ -GACACAGC- ACCTCAGCAA-3′ ，下游引物序列為5′ -GGAGATCC- AAGAATACCC-3′ ，擴(kuò)增長度為110 bp；SPRY4的上游引物序列為5′ -AGTGGATCCGCCACCATGGAGCCC- CCGATCCCAC-3′ ，下游引物序列5′ -CTATTACTCGA- GTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGAA- AGGCTTGTCCGGTCTG-3′ ，擴(kuò)增長度為120 bp。GAPDH的上游引物序列為5′ -AAGAGAGGCATCCTGA- CCCT-3′，下游引物序列為5′ -TACATGGCTGGGGTGTTGAA-3′，擴(kuò)增長度為20 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40循環(huán)。采用 2-ΔΔct相對定量法（目的基因ct值/內(nèi)參基因ct值）對SPRY4、MEF2D的mRNA表達(dá)進(jìn)行相對定量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 索拉菲尼對PLC增殖能力的影響

隨著索拉菲尼藥物濃度的增加，作用PLC 48 h的OD值逐漸減小，PLC增殖能力減弱，PLC的IC50值為（8.23±0.06） ?mol/L。索拉菲尼對PLC增殖能力的影響結(jié)果見表1。

3.2 索拉菲尼耐藥肝癌細(xì)胞株的構(gòu)建結(jié)果

PLC和PLC-DR3的細(xì)胞形態(tài)如圖1所示，PLC-DR3細(xì)胞相比PLC細(xì)胞小，呈圓形，且有部分漂浮的死細(xì)胞。隨著索拉菲尼藥物濃度的增加，作用PLC-DR3細(xì)胞48 h的OD值逐漸減小，經(jīng)SPSS 18.0軟件計(jì)算得PLC-DR3的IC50為（21.80±0.06） ?mol/L，其耐藥指數(shù)為3。索拉菲尼對PLC-DR3細(xì)胞增殖能力的影響結(jié)果見表2。

3.3 過表達(dá)MEF2D對PLC增殖能力的影響

與PLC比較，過表達(dá)MEF2D后PLC-AdMEF2D的IC50[（19.46±0.063） ?mol/L]明顯增加（P<0.001），表明過表達(dá)MEF2D后PLC的增殖能力增強(qiáng)。過表達(dá)MEF2D對PLC增殖能力的影響見表3。

3.4 PLC、PLC-DR3中MEF2D、p-ERK、ERK蛋白的表達(dá)

與PLC比較，PLC-DR3中總ERK蛋白表達(dá)水平基本不變，MEF2D、p-ERK蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.001），即ERK蛋白的磷酸化增強(qiáng)，說明MEF2D蛋白表達(dá)增強(qiáng)及ERK通路的激活在PLC對索拉菲尼耐藥中起著重要作用。PLC、PLC-DR3中MEF2D、p-ERK、ERK蛋白的表達(dá)電泳圖見圖2，測定結(jié)果見表4。

3.5 PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D、ERK、p-ERK、MEK、p-MEK、SPRY4蛋白的表達(dá)

與PLC比較，PLC-AdMEF2D中ERK、MEK表達(dá)量基本不變，p-ERK、p-MEK的表達(dá)增強(qiáng)（P<0.01），SPRY4蛋白的表達(dá)水平明顯減弱（P<0.001）。PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D、ERK、p-ERK、MEK、p- MEK、SPRY4蛋白表達(dá)的電泳圖見圖3，測定結(jié)果見表5。

因此推測，過表達(dá)MEF2D后使得ERK、MEK磷酸化增加，通路活性升高，從而增加PLC對索拉菲尼的耐藥性。

3.6 PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D、SPRY4 mRNA的表達(dá)

與PLC比較，PLC-AdMEF2D中SPRY4 mRNA的表達(dá)明顯減弱（P<0.001），說明過表達(dá)MEF2D抑制了SPRY4 mRNA的表達(dá)。PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D mRNA、SPRY4 mRNA的表達(dá)結(jié)果見表6。

4 討論

肝癌是最常見的惡性原發(fā)性肝臟腫瘤，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究逐漸揭示了肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，其中特定信號通路的異常激活對肝癌的形成、生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌中RAS/ERK通路的活性處于持續(xù)激活的狀態(tài)[8-9]。更為重要的是，異常激活的RAS/ERK 通路促進(jìn)了肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[10]，而且RAS/ERK通路活性強(qiáng)的肝癌患者往往預(yù)后較差[11]。由此可見，RAS/ERK通路是一個(gè)理想的肝癌治療靶點(diǎn)。目前，RAS/ERK通路的抑制劑類藥物己經(jīng)應(yīng)用到肝癌的治療中，例如索拉菲尼。索拉菲尼作為多激酶抑制劑，可以通過抑制 RAF和血管內(nèi)皮生長因子受體激酶，阻斷下游通路的激活達(dá)到抑制肝癌的作用，并且在其他實(shí)體瘤中也有臨床效果[12]。在兩項(xiàng)晚期肝癌患者的隨機(jī)Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，索拉非尼治療組的病人相對安慰劑組疾病進(jìn)展時(shí)間延長2.8個(gè)月，同時(shí)總生存期延長2.3個(gè)月[2]?，F(xiàn)有的臨床結(jié)果顯示，索拉菲尼對肝癌的治療效果表現(xiàn)出較大的差異。部分患者應(yīng)答程度較高，存活時(shí)間顯著延長，而部分患者則表現(xiàn)出對索拉菲尼的耐藥，預(yù)后未得到改善[13]。索拉菲尼耐藥性的產(chǎn)生限制了其治療價(jià)值，一方面，肝癌患者對索拉菲尼敏感性存在差異的原因尚不清楚，另一方面，缺乏預(yù)測肝癌治療預(yù)后的分子標(biāo)記物[14]。因此，迫切需要研究肝癌對索拉菲尼發(fā)生耐藥的分子機(jī)制。這不僅有助于腫瘤靶向治療方案的制定，也有助于指導(dǎo)腫瘤耐藥對策的制定，從而避免不必要的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和毒副作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過在肝癌細(xì)胞株中上調(diào)MEF2D表達(dá)，可從細(xì)胞水平確定過表達(dá)MEF2D可促進(jìn)肝癌細(xì)胞對索拉菲尼耐藥。其次，通過分子和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)確定MEF2D可通過抑制SPRY4表達(dá)繼而影響其下游RAS/ERK通路的活性，最終影響肝癌細(xì)胞對索拉菲尼的耐藥性。本研究結(jié)果為闡明MEF2D影響肝癌對索拉菲尼的耐藥機(jī)制中的作用提供試驗(yàn)依據(jù)，也為預(yù)測肝癌患者采用索拉菲尼治療的效果提供可能的分子標(biāo)記物。

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（收稿日期：2018-01-14 修回日期：2018-06-25）

（編輯：唐曉蓮）