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    肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D影響肝癌細(xì)胞對索拉菲尼耐藥的機(jī)制研究

    2018-10-19 05:11:42馬清霞王園園馬海龍李培宇楊月成楊志宏劉佳姜國輝
    中國藥房 2018年17期

    馬清霞 王園園 馬海龍 李培宇 楊月成 楊志宏 劉佳 姜國輝

    中圖分類號 R735.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408(2018)17-2337-05

    DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.08

    摘 要 目的:研究肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D(MEF2D)影響肝癌細(xì)胞PLC對索拉菲尼耐藥的作用機(jī)制。方法:建立索拉菲尼肝癌耐藥細(xì)胞株(PLC-DR3),以過表達(dá)Ad-MEF2D載體感染PLC(PLC-AdMEF2D),CCK-8法檢測索拉菲尼處理后PLC、PLC-DR3、PLC-AdMEF2D增殖能力,并計(jì)算索拉菲尼對各細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。采用Western blot法檢測PLC、PLC-DR3中MEF2D、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)的表達(dá)和PLC-AdMEF2D細(xì)胞中MEF2D、ERK、p-ERK、促分裂原活化蛋白激酶(MEK)、磷酸化MEK(p-MEK)、快速發(fā)育生長因子同源蛋白4(SPRY4)的表達(dá)。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D mRNA和SPRY4 mRNA的表達(dá)。結(jié)果:索拉菲尼對PLC、PLC-DR3、PLC-AdMEF2D的IC50分別為(8.23±0.06)、(21.80±0.06)、(19.46±0.063) ?mol/L。與PLC比較,PLC-DR3、PLC-AdMEF2D的IC50明顯升高(P<0.001);PLC-DR3中總ERK表達(dá)量基本不變,MEF2D、p-ERK的蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.001);PLC-AdMEF2D中總ERK、MEK表達(dá)量基本不變,p-ERK和p-MEK蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01),SPRY4蛋白表達(dá)明顯減弱(P<0.001),SPRY4 mRNA表達(dá)水平明顯減弱(P<0.001)。結(jié)論:MEF2D可能通過抑制SPRY4的表達(dá),激活RAS/ERK通路,從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞對索拉菲尼耐藥。

    關(guān)鍵詞 索拉菲尼;肝癌細(xì)胞;耐藥機(jī)制;肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D

    ABSTRACT OBJECTIVE: To study the mechanism of myocyte enhancer factor 2D (MEF2D) affecting the resistance of hepatoma carcinoma cells PLC to sorafenib. METHODS: The liver cancer drug resistance cell strain (PLC-DR3) of sorafenib were established, over expression Ad-MEF2D carrier infected liver cancer cell PLC (PLC-AdMEF2D) and CCK-8 assay was used to determine the proliferation of PLC, PLC-DR3 and PLC-AdMEF2D, and the half inhibitory concentration (IC50) of sorafenib on each cell was calculated. Western blot assay was used to detect the protein expression of MEF2D, ERK and p-ERK in PLC and PLC-DR3, the protein expression of MEF2D, ERK, p-ERK, MEK, p-MEK and SPRY4 in PLC-AdMEF2D. RT-PCR was adopted to detect the mRNA expression of MEF2D and SPRY4 in PLC and PLC-AdMEF2D. RESULTS: IC50 of sorafenib on PLC, PLC-DR3, PLC-AdMEF2D was (8.23±0.06),(21.80±0.06),(19.46±0.063) ?mol/L. Compared with PLC, the IC50 of PLC-DR3 and PLC-AdMEF2D was increased significantly (P<0.001); the total expression of ERK in PLC-DR3 keep stale, while the protein expression of MEF2D and p-ERK was increased significantly (P<0.001); total expression of ERK and MEK in PLC-AdMEF2D kept stable, but the protein expression of p-ERK and p-MEK were increased significantly (P<0.01), the protein expression of SPRY4 was decreased significantly (P<0.001), while mRNA expression of SPRY4 was decreased significantly (P<0.001). CONCLUSIONS: MEF2D can promote the generation and development of drug resistance of hepatoma carcinoma cells to sorafenib by inhibiting expression of SPRY4 and active of RAS/ERK pathway.

    KEYWORDS Sorafenib; Hepatoma carcinoma cells; Resistant mechanism; MEF2D

    肝癌是我國最常見的腫瘤之一,據(jù)統(tǒng)計(jì),我國新增肝癌患者的病例數(shù)和死亡人數(shù)居全世界首位[1]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展,肝癌治療的方式和方法有了大幅度的改善,但現(xiàn)有的治療手段仍無法顯著提高肝癌患者的生存率。肝癌易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等問題仍然困擾著醫(yī)務(wù)工作者和科研工作者[1]。

    目前,RAS/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)抑制劑索拉菲尼在治療肝癌上取得了一定的療效,是肝癌晚期系統(tǒng)性治療的唯一選擇[2]。RAS/ERK信號通路是肝癌的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子,也是索拉菲尼的重要治療靶點(diǎn)[3]。RAS/ERK信號通路由一系列可以發(fā)生級聯(lián)激活的蛋白激酶組成,如RAS、有絲分裂原激活的蛋白激酶(RAF)、促分裂原活化蛋白激酶(MEK)、ERK以及通路負(fù)調(diào)控因子快速發(fā)育生長因子同源蛋白4(SPRY4)等,處于激活狀態(tài)的ERK影響一系列與增殖、存活、侵襲和免疫逃避相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定性、入核能力或促轉(zhuǎn)錄活性,最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。然而部分肝癌患者對索拉菲尼存在不同程度的耐藥,使得其預(yù)后較差。相關(guān)研究表明索拉菲尼耐藥可能與RAS/ERK級聯(lián)激活相關(guān)[4]。作為肌細(xì)胞增強(qiáng)因子的成員之一,肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D(MEF2D)不僅在人體發(fā)育和生理功能中發(fā)揮重要作用[5],而且MEF2D異常表達(dá)與包括肝癌在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展也關(guān)系密切[6]。研究發(fā)現(xiàn),MEF2D的表達(dá)在肝癌中顯著升高,不僅促進(jìn)肝癌的惡化,還與肝癌患者的預(yù)后存在負(fù)相關(guān)[7]。因此,筆者思考MEF2D是否在肝癌細(xì)胞對索拉菲尼的耐藥中扮演著重要角色?基于此,筆者構(gòu)建了索拉菲尼耐藥肝癌細(xì)胞株,從細(xì)胞水平探究MEF2D蛋白及RAS/ERK通路的激活是否在肝癌細(xì)胞對索拉菲尼的耐藥中起著關(guān)鍵作用;通過過表達(dá)MEF2D,從細(xì)胞水平探究MEF2D蛋白是否負(fù)向調(diào)控RAS/ERK通路的SPRY4因子,使通路中ERK、MEK磷酸化增加促進(jìn)肝癌細(xì)胞對索拉菲尼的耐藥。

    1 材料

    1.1 儀器

    3543 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Mmultiskan FC酶標(biāo)儀、SimpliAmpTM熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)儀均購自美國賽默飛世爾科技公司;PowerPac300電泳儀(美國Bio-Rad公司);Eclipse Ts100熒光顯微鏡(日本尼康公司)。

    1.2 藥品與試劑

    索拉菲尼(美國Selleck生物科技有限公司,批號:S1040,純度:99.5%);DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基(美國生命技術(shù)公司);腺病毒載體(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司);Trizol總RNA提取試劑(碧云天生物研究所,批號:20171105);qRT-PCR檢測試劑盒(天根生化科技有限公司,批號:R6424);CCK-8試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司,批號:20170106);RIPA裂解液(北京索萊寶生物科技公司,批號:20171206);MEF2D抗體、MEK抗體、p-MEK抗體、ERK抗體、p-ERK抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、兔二抗均購置美國Abcam公司。

    1.3 細(xì)胞

    人肝癌細(xì)胞PLC購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

    PLC細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),置于5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

    2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力

    將PLC以5×103個(gè)/孔分別接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,加入終濃度為0、2、4、8、16、32 ?mol/L的索拉菲尼,培養(yǎng)48 h后,每孔加入10 ?L CCK-8試劑,孵育3 h后,使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定細(xì)胞的光密度(OD)值。OD值越大表示細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%):[空白組(索拉菲尼終濃度為0 ?mol/L)OD-索拉菲尼處理組OD]/空白組OD×100%,然后通過SPSS軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

    2.3 索拉菲尼耐藥肝癌細(xì)胞株的構(gòu)建

    將對數(shù)生長期的PLC接種于含有10%胎牛血清的含藥DMEM培養(yǎng)基(索拉菲尼終濃度為其對PLC的IC50)中,孵育72 h后,棄去含藥培養(yǎng)基,加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)72 h后用PBS清洗3遍,再用該含藥DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h,共進(jìn)行3次,構(gòu)建索拉菲尼耐藥肝癌細(xì)胞株(PLC-DR3)。然后用倒置顯微鏡觀察PLC和PLC-DR3的細(xì)胞形態(tài)變化,利用“2.2”項(xiàng)下方法檢測PLC-DR3增殖能力并計(jì)算索拉菲尼對PLC-DR3的IC50,根據(jù)公式計(jì)算耐藥指數(shù):PLC-DR3細(xì)胞IC50/PLC細(xì)胞IC50。

    2.4 過表達(dá)MEF2D對PLC增殖的影響

    將10 MOI(感染復(fù)數(shù))的腺病毒載體Ad-MEF2D(過表達(dá)MEF2D載體)感染PLC(感染后細(xì)胞命名為PLC-AdMEF2D)。利用“2.2”項(xiàng)下方法檢測PLC-AdMEF2D的增殖能力并計(jì)算索拉菲尼對其的IC50。

    2.5 Western blot法檢測PLC、PLC-DR3、PLC-AdMEF2D中蛋白的表達(dá)

    取PLC、PLC-DR3、PLC-AdMEF2D分別按照RIPA裂解液的操作說明提取細(xì)胞中總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,變性后進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后轉(zhuǎn)入聚偏二氟乙烯膜,經(jīng)5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別置于稀釋1 000倍的一抗液(MEF2D、ERK、p-ERK、MEK、p-MEK、SPRY4抗體),封口,4 ℃孵育過夜,PBS洗膜3次后,加入稀釋1 000倍的兔二抗,室溫孵育1 h,PBS洗膜3次后進(jìn)行顯影,檢測灰度值。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示MEF2D、ERK、p-ERK、MEK、p-MEK、SPRY4的相對表達(dá)水平。

    2.6 qRT-PCR法檢測PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D、SPRY4 mRNA的表達(dá)

    取PLC、PLC-AdMEF2D按照Trizol說明書提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后根據(jù)qPCR試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增。MEF2D的上游引物序列為5′ -GACACAGC- ACCTCAGCAA-3′ ,下游引物序列為5′ -GGAGATCC- AAGAATACCC-3′ ,擴(kuò)增長度為110 bp;SPRY4的上游引物序列為5′ -AGTGGATCCGCCACCATGGAGCCC- CCGATCCCAC-3′ ,下游引物序列5′ -CTATTACTCGA- GTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGAA- AGGCTTGTCCGGTCTG-3′ ,擴(kuò)增長度為120 bp。GAPDH的上游引物序列為5′ -AAGAGAGGCATCCTGA- CCCT-3′,下游引物序列為5′ -TACATGGCTGGGGTGTTGAA-3′,擴(kuò)增長度為20 bp。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共40循環(huán)。采用 2-ΔΔct相對定量法(目的基因ct值/內(nèi)參基因ct值)對SPRY4、MEF2D的mRNA表達(dá)進(jìn)行相對定量。

    2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以x±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 索拉菲尼對PLC增殖能力的影響

    隨著索拉菲尼藥物濃度的增加,作用PLC 48 h的OD值逐漸減小,PLC增殖能力減弱,PLC的IC50值為(8.23±0.06) ?mol/L。索拉菲尼對PLC增殖能力的影響結(jié)果見表1。

    3.2 索拉菲尼耐藥肝癌細(xì)胞株的構(gòu)建結(jié)果

    PLC和PLC-DR3的細(xì)胞形態(tài)如圖1所示,PLC-DR3細(xì)胞相比PLC細(xì)胞小,呈圓形,且有部分漂浮的死細(xì)胞。隨著索拉菲尼藥物濃度的增加,作用PLC-DR3細(xì)胞48 h的OD值逐漸減小,經(jīng)SPSS 18.0軟件計(jì)算得PLC-DR3的IC50為(21.80±0.06) ?mol/L,其耐藥指數(shù)為3。索拉菲尼對PLC-DR3細(xì)胞增殖能力的影響結(jié)果見表2。

    3.3 過表達(dá)MEF2D對PLC增殖能力的影響

    與PLC比較,過表達(dá)MEF2D后PLC-AdMEF2D的IC50[(19.46±0.063) ?mol/L]明顯增加(P<0.001),表明過表達(dá)MEF2D后PLC的增殖能力增強(qiáng)。過表達(dá)MEF2D對PLC增殖能力的影響見表3。

    3.4 PLC、PLC-DR3中MEF2D、p-ERK、ERK蛋白的表達(dá)

    與PLC比較,PLC-DR3中總ERK蛋白表達(dá)水平基本不變,MEF2D、p-ERK蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.001),即ERK蛋白的磷酸化增強(qiáng),說明MEF2D蛋白表達(dá)增強(qiáng)及ERK通路的激活在PLC對索拉菲尼耐藥中起著重要作用。PLC、PLC-DR3中MEF2D、p-ERK、ERK蛋白的表達(dá)電泳圖見圖2,測定結(jié)果見表4。

    3.5 PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D、ERK、p-ERK、MEK、p-MEK、SPRY4蛋白的表達(dá)

    與PLC比較,PLC-AdMEF2D中ERK、MEK表達(dá)量基本不變,p-ERK、p-MEK的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01),SPRY4蛋白的表達(dá)水平明顯減弱(P<0.001)。PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D、ERK、p-ERK、MEK、p- MEK、SPRY4蛋白表達(dá)的電泳圖見圖3,測定結(jié)果見表5。

    因此推測,過表達(dá)MEF2D后使得ERK、MEK磷酸化增加,通路活性升高,從而增加PLC對索拉菲尼的耐藥性。

    3.6 PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D、SPRY4 mRNA的表達(dá)

    與PLC比較,PLC-AdMEF2D中SPRY4 mRNA的表達(dá)明顯減弱(P<0.001),說明過表達(dá)MEF2D抑制了SPRY4 mRNA的表達(dá)。PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D mRNA、SPRY4 mRNA的表達(dá)結(jié)果見表6。

    4 討論

    肝癌是最常見的惡性原發(fā)性肝臟腫瘤,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究逐漸揭示了肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,其中特定信號通路的異常激活對肝癌的形成、生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn),肝癌中RAS/ERK通路的活性處于持續(xù)激活的狀態(tài)[8-9]。更為重要的是,異常激活的RAS/ERK 通路促進(jìn)了肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[10],而且RAS/ERK通路活性強(qiáng)的肝癌患者往往預(yù)后較差[11]。由此可見,RAS/ERK通路是一個(gè)理想的肝癌治療靶點(diǎn)。目前,RAS/ERK通路的抑制劑類藥物己經(jīng)應(yīng)用到肝癌的治療中,例如索拉菲尼。索拉菲尼作為多激酶抑制劑,可以通過抑制 RAF和血管內(nèi)皮生長因子受體激酶,阻斷下游通路的激活達(dá)到抑制肝癌的作用,并且在其他實(shí)體瘤中也有臨床效果[12]。在兩項(xiàng)晚期肝癌患者的隨機(jī)Ⅲ期臨床試驗(yàn)中,索拉非尼治療組的病人相對安慰劑組疾病進(jìn)展時(shí)間延長2.8個(gè)月,同時(shí)總生存期延長2.3個(gè)月[2]?,F(xiàn)有的臨床結(jié)果顯示,索拉菲尼對肝癌的治療效果表現(xiàn)出較大的差異。部分患者應(yīng)答程度較高,存活時(shí)間顯著延長,而部分患者則表現(xiàn)出對索拉菲尼的耐藥,預(yù)后未得到改善[13]。索拉菲尼耐藥性的產(chǎn)生限制了其治療價(jià)值,一方面,肝癌患者對索拉菲尼敏感性存在差異的原因尚不清楚,另一方面,缺乏預(yù)測肝癌治療預(yù)后的分子標(biāo)記物[14]。因此,迫切需要研究肝癌對索拉菲尼發(fā)生耐藥的分子機(jī)制。這不僅有助于腫瘤靶向治療方案的制定,也有助于指導(dǎo)腫瘤耐藥對策的制定,從而避免不必要的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和毒副作用。

    本研究發(fā)現(xiàn),通過在肝癌細(xì)胞株中上調(diào)MEF2D表達(dá),可從細(xì)胞水平確定過表達(dá)MEF2D可促進(jìn)肝癌細(xì)胞對索拉菲尼耐藥。其次,通過分子和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)確定MEF2D可通過抑制SPRY4表達(dá)繼而影響其下游RAS/ERK通路的活性,最終影響肝癌細(xì)胞對索拉菲尼的耐藥性。本研究結(jié)果為闡明MEF2D影響肝癌對索拉菲尼的耐藥機(jī)制中的作用提供試驗(yàn)依據(jù),也為預(yù)測肝癌患者采用索拉菲尼治療的效果提供可能的分子標(biāo)記物。

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    (收稿日期:2018-01-14 修回日期:2018-06-25)

    (編輯:唐曉蓮)

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