亞抑菌濃度抗菌藥物對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成的影響

樊莉 孫鳳軍 枉前 夏培元 周世文

摘 要 目的：探討亞抑菌濃度（sub-MIC）抗菌藥物對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（MDR-AB）生物膜形成的影響，為臨床相關(guān)感染的防治提供參考。方法：采用瓊脂平板倍比稀釋法測(cè)定臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌（AB）的最低抑菌濃度（MIC），篩選MDR-AB菌株；采用微孔法分析不同劑量sub-MIC抗菌藥物對(duì)MDR-AB菌株生物膜形成的影響，并使用AB標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 17978）進(jìn)行驗(yàn)證；采用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法測(cè)定其生物膜形成相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)情況。結(jié)果：臨床檢出的MDR-AB菌株對(duì)碳青霉烯類、頭孢菌素類、喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物耐藥（MIC≥16 μg/mL），對(duì)多黏菌素B和替加環(huán)素較敏感（MIC≤8 μg/mL）。不同劑量sub-MIC頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、阿米卡星均可顯著抑制大多數(shù)MDR-AB菌株生物膜的形成，且以阿奇霉素的抑制作用相對(duì)最強(qiáng)（其對(duì)應(yīng)菌株的相對(duì)生物膜形成值最?。?；多西環(huán)素可顯著誘導(dǎo)大多數(shù)菌株生物膜的形成，而美羅培南、頭孢哌酮、替加環(huán)素、慶大霉素、多黏菌素B對(duì)其生物膜形成的影響并不明顯。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，與未經(jīng)藥物作用的對(duì)照菌株比較，經(jīng)0.25、0.125 μg/mL阿奇霉素以及0.25 μg/mL阿米卡星作用后，標(biāo)準(zhǔn)菌株的相對(duì)生物膜形成值均顯著下降（P<0.05），且阿奇霉素的抑制作用呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系（P<0.05）?；虮磉_(dá)測(cè)定結(jié)果顯示，與未經(jīng)藥物作用的對(duì)照菌株比較，經(jīng)0.25 μg/mL阿奇霉素作用后，bap、filA、pbp-1a、pbp-1b基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著下降（P<0.05），而ompA、csuE基因的相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著變化（P>0.05）。結(jié)論：我院MDR-AB菌株的耐藥情況嚴(yán)重。sub-MIC頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、阿米卡星、阿奇霉素對(duì)其生物膜的形成具有明顯的抑制作用，其中阿奇霉素的作用最強(qiáng)且呈量效關(guān)系。阿奇霉素對(duì)MDR-AB菌株生物膜形成的抑制作用可能與其下調(diào)bap、filA、pbp-1a、pbp-1b基因的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 鮑曼不動(dòng)桿菌；多重耐藥；生物膜；亞抑菌濃度；抗菌藥物；阿奇霉素；基因表達(dá)

中圖分類號(hào) R969.3；R978.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）22-3129-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.23

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of sub-MIC antibiotics on the biofilm formation of multi-drug resistant Acinetobacter baumannii （MDR-AB）， and to provide reference for the prevention and treatment of related infection. METHODS： Agar plate doubling dilution method was used to detect MIC of clinically isolated A. baumannii （AB） and screen MDR-AB. Microporous method was used to analyze the effects of different doses of sub-MIC antibiotics on the biofilm formation of MDR-AB， which was validated by using AB standard strain （ATCC 17978）. The expression of biofilm-related gene was detected by RT-PCR. RESULTS： The detected MDR-AB was resistant to carbapenems， cephalosporins， quinolones， aminoglycosides， tetracyclines and macrolides （MIC≥16 μg/mL）. It was sensitive to polymyxin B and tegocycline （MIC≤8 μg/mL）. Different doses of sub-MIC cefepime， ciprofloxacin， azithromycin and amikacin could significantly inhibit the biofilm formation of MDR-AB， and azithromycin had the strongest inhibitory effect （the relative biofilm formation values of the corresponding strains was minimal）. Doxycycline could significantly induce the formation of biofilm in most strains， but meropenem， cefoperazone， tigacycline， gentamicin and polymyxin B had no significant effect on the formation of biofilm. Results of validation test showed that compared with untreated control strains， the relative biofilm formation values of standard strains were decreased significantly after treated with 0.25 and 0.125 μg/mL azithromycin and 0.25 μg/mL amikacin （P<0.05）， and inhibitory effect of azithromycin showed a dose-dependent relationship （P<0.05）. Results of gene expression detection showed that compared with untreated control strains， relative expression of bap， filA， pbp-1a and pbp-1b gene were decreased significantly （P<0.05）， while relative expression of ompA and csuE gene had no significant change （P>0.05）. CONCLUSIONS： The drug resistance of MDR-AB strains in our hospital is serious. Sub-MIC cefepime， ciprofloxacin， amikacin and azithromycin shows significant inhibitory effect on biofilm formation， and the inhibitory effect of azithromycin is the strongest， with dose-dependent manner. Azithromycin can inhibit the biofilm formation of MDR-AB which may be associated with the expression down-regulation of bap， filA， pbp-1a and pbp-1b gene.

KEYWORDS Acinetobacter baumannii； Multi-drug resistance； Biofilm； Sub-MIC； Antibiotics； Azithromycin； Gene expression

鮑曼不動(dòng)桿菌（AB）是導(dǎo)致院內(nèi)感染的主要病原菌之一，且多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（MDR-AB，即對(duì)3類或3類以上抗菌藥物耐藥的AB）在臨床較為常見(jiàn)，而該類細(xì)菌可形成生物膜（Biofilm），最終可造成難以徹底清除的感染[1]。有研究指出，在重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）中雖有高達(dá)80%的AB菌株處于抗菌藥物的治療壓力下，但卻無(wú)法被迅速清除，這種現(xiàn)象與AB耐藥性強(qiáng)等因素所導(dǎo)致的患者體內(nèi)抗菌藥物濃度處于低于最低抑菌濃度（MIC）且無(wú)法殺滅AB的亞抑菌濃度（sub-MIC）有關(guān)[2]。這類sub-MIC抗菌藥物雖無(wú)法殺滅病原菌，卻可顯著影響菌株的病原學(xué)行為，且其對(duì)菌株生物膜形成的影響也可因抗菌藥物種類和菌株的差異而有所不同[3]。因此，探討sub-MIC抗菌藥物對(duì)耐藥菌株生物膜形成的影響，并從中篩選具生物膜抑制活性的抗菌藥物對(duì)于AB（尤其是MDR-AB）感染的防治具有重要的臨床意義[4]。為此，本研究以陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）臨床分離的MDR-AB為對(duì)象，探討sub-MIC抗菌藥物對(duì)其生物膜形成的影響，以期為臨床相關(guān)感染防治策略的完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

THZ-92B型恒溫振蕩培養(yǎng)箱、SPX-150-Z型恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；Power 300型電泳儀、Gel Doc 2000型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；7500型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；Sunrise型酶標(biāo)儀（奧地利Tecan公司）；MIT-P型多點(diǎn)接種儀（日本Sakuma公司）；MR23i型低溫離心機(jī)（法國(guó)Jouan公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；BP221S型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；DW-86L338型超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

美羅培南對(duì)照品[批號(hào)：130506-201403，純度：供高效液相色譜法（HPLC）含量測(cè)定用]、頭孢哌酮對(duì)照品（批號(hào)：130420-201105，純度：供含量測(cè)定用）、頭孢吡肟對(duì)照品（批號(hào)：130524-201404，純度：供含量測(cè)定用）、環(huán)丙沙星對(duì)照品（批號(hào)：130451-201203，純度：供HPLC法含量測(cè)定用）、阿米卡星對(duì)照品（批號(hào)：130335-200204，純度：供含量測(cè)定用）、慶大霉素對(duì)照品（批號(hào)：130326-201015，純度：供抗生素生物效價(jià)測(cè)定用）、多西環(huán)素對(duì)照品（批號(hào)：130485-201202，純度：供含量/限量測(cè)定用）、阿奇霉素對(duì)照品（批號(hào)：130593-201303，純度：供含量測(cè)定用）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；多黏菌素B對(duì)照品（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：1222536，純度：供含量測(cè)定用）；注射用替加環(huán)素（意大利 Pfizer Limited，注冊(cè)證號(hào)：H20130483，批號(hào)：AIXD/12，規(guī)格：50 mg）；結(jié)晶紫溶液（成都科龍化工試劑廠，批號(hào)：2013121101）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)分別為NAB1335、1221119）；LB培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號(hào)分別為150813、151012）；血瓊脂平板（重慶龐通醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)：15K2701）；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，美國(guó)HyClone公司，批號(hào)：NAG1423）；DP430-RNAprep Pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，批號(hào)：121221]；PrimeScript RT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RR820A-SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光定量試劑盒（日本Takara公司，批號(hào)分別為AK3301、AK3101）；引物由美國(guó)Invitrogen公司設(shè)計(jì)、合成；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 菌株

AB臨床分離菌株均來(lái)自于我院臨床送檢的標(biāo)本，剔除同一患者同一部位檢出的重復(fù)菌株。質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）以及AB標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 17978）均由美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)提供。上述菌株均常規(guī)保存于陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院國(guó)家藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)。

2 方法

2.1 臨床分離菌株MIC的測(cè)定

以大腸埃希菌（ATCC 25922）和銅綠假單胞菌（ATCC 27853）為質(zhì)控菌株，采用瓊脂平板倍比稀釋法測(cè)定臨床分離AB菌株的MIC（MIC反映抗菌藥物對(duì)受試菌株的抑制活性，其值越大表明藥物對(duì)菌株的抑制活性越弱[5]）。取臨床分離的AB菌株適量，用劃線法接種于血瓊脂平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，用生理鹽水稀釋，制得濃度約為1×108 CFU/mL的菌懸液。取“1.2”項(xiàng)下各抗菌藥物適量，用生理鹽水倍比稀釋后，取1 mL分置于各培養(yǎng)皿中，加入MH培養(yǎng)基適量，混勻；用多點(diǎn)接種儀將上述菌懸液接種至含不同質(zhì)量濃度抗菌藥物的MH培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后，參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2015年標(biāo)準(zhǔn)[5]讀取結(jié)果，并選取其中耐藥種類最多的10株（即MDR-AB，編號(hào)分別為WA0719、WB1387、WB1483、WB1486、WB1531、WB1549、WA0611、WB1055、WB1197、WB1032）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 sub-MIC抗菌藥物對(duì)菌株生物膜形成影響的半定量分析

選取臨床常用的代表性抗菌藥物（如美羅培南、頭孢哌酮、阿奇霉素等）以及既往對(duì)AB具有良好抑制作用的其他抗菌藥物（如多黏菌素B、替加環(huán)素、多西環(huán)素等），在對(duì)應(yīng)MIC的基礎(chǔ)上兼顧臨床實(shí)際可及的組織濃度，設(shè)置各抗菌藥物的劑量，以未經(jīng)藥物作用的菌株作為對(duì)照，采用微孔法對(duì)各菌株生物膜的形成進(jìn)行半定量分析[5]。取“2.1”項(xiàng)下臨床分離的MDR-AB菌株適量，用劃線法接種于血瓊脂平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落至LB培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振搖（約130 r/min）培養(yǎng)過(guò)夜。用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，用生理鹽水稀釋，制得濃度約為1×107 CFU/mL的菌懸液，以每孔200 μL加至96孔板中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸棄上層培養(yǎng)液，殘?jiān)肞BS清洗2次，吹干并固定后，每孔加入1%結(jié)晶紫溶液150 μL，染色3 min，用超純水洗凈，吹干，每孔加入30%冰醋酸溶液溶解染色液，使用酶標(biāo)儀在590 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD）值。OD值的高低可間接反映生物膜形成能力的強(qiáng)弱，且當(dāng)OD590 nm>0.5時(shí)，表明該菌株生物膜形成的能力較強(qiáng)[6]。其中，與未經(jīng)藥物作用的對(duì)照菌株比較，OD590 nm值顯著增加（組間比較P<0.05）的為“顯著誘導(dǎo)”，OD590 nm值無(wú)顯著差異（組間比較P>0.05）的為“無(wú)顯著影響”，OD590 nm值顯著降低（組間比較P<0.05）的為“顯著抑制”。 “相對(duì)生物膜形成”指與對(duì)照菌株比較，10株MDR-AB菌株OD值變化的平均水平（其值等于給藥菌株的平均OD值與對(duì)照菌株的平均OD值的比值）。為確保試驗(yàn)的可重復(fù)性，本研究以AB標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 17978）為對(duì)象，選取對(duì)臨床分離菌株生物膜形成具有明顯抑制作用的抗菌藥物進(jìn)行驗(yàn)證，并設(shè)置更低的劑量以探討其量效關(guān)系。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 MDR-AB菌株生物膜形成相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)的測(cè)定

以未經(jīng)藥物作用的菌株作為對(duì)照，采用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）測(cè)定MDR-AB菌株生物膜形成相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)情況。按照培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒說(shuō)明書方法提取細(xì)菌總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量試劑盒說(shuō)明書方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA），隨后使用熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增（引物序列見(jiàn)表1）。PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green（熒光定量試劑盒內(nèi)所含試劑）10 ?L，上、下游引物各0.3 ?L，cDNA 2 ?L，ddH2O 7.4 ?L。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52～57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。SYBR Green試劑的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為497 nm和520 nm。以表達(dá)穩(wěn)定的16SrRNA為內(nèi)參，通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中熒光強(qiáng)度的變化，采用ABI-7500 2.0軟件以2-ΔΔCt分析各基因的表達(dá)量，并計(jì)算相對(duì)表達(dá)量（相對(duì)表達(dá)量=給藥菌株的基因表達(dá)量/對(duì)照菌株的基因表達(dá)量）。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 臨床分離MDR-AB菌株的MIC值

10株MDR-AB菌株對(duì)10種臨床常用抗菌藥物的MIC值見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，10株菌株對(duì)碳青霉烯類、頭孢菌素類、喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物耐藥，而對(duì)多黏菌素B和替加環(huán)素較敏感。

3.2 sub-MIC抗菌藥物對(duì)臨床分離MDR-AB菌株生物膜形成的影響

10株MDR-AB菌株分別來(lái)自于痰液、腦脊液、血液、傷口分泌物和尿液標(biāo)本，涉及最常被該類菌株感染的人體部位，具有一定的代表性[7]。以不同劑量的sub-MIC抗菌藥物對(duì)MDR-AB菌株生物膜的形成進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、阿米卡星等4種抗菌藥物對(duì)MDR-AB菌株生物膜的形成具有較強(qiáng)的抑制作用，且阿奇霉素的抑制作用相對(duì)最強(qiáng)（其相對(duì)生物膜形成值最小，2 μg/mL即可顯示出較強(qiáng)的抑制作用）；多西環(huán)素對(duì)MDR-AB菌株生物膜的形成具有較明顯的誘導(dǎo)作用；而美羅培南、頭孢哌酮、替加環(huán)素、慶大霉素、多黏菌素B對(duì)其生物膜形成的影響不明顯。

以標(biāo)準(zhǔn)菌株為對(duì)象，選取阿奇霉素和阿米卡星進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，與未經(jīng)藥物作用的對(duì)照菌株比較，經(jīng)0.25、0.125 μg/mL阿奇霉素以及0.25 μg/mL阿米卡星作用后，標(biāo)準(zhǔn)菌株的相對(duì)生物膜形成值均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示其生物膜形成受到明顯抑制。此外，0.25、0.125、0.06 μg/mL阿奇霉素組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示這種體外抑制作用呈明顯的量效關(guān)系；而阿米卡星對(duì)其生物膜形成的抑制作用則未見(jiàn)類似量效關(guān)系（P>0.05）。

在研究過(guò)程中筆者還發(fā)現(xiàn)，WB1549菌株生物膜形成受到阿奇霉素和阿米卡星的抑制較顯著（相對(duì)生物膜形成值均低于0.8），且該菌株來(lái)自于呼吸道感染者的痰液標(biāo)本，而阿奇霉素常用于呼吸道感染的治療，故將其作為后續(xù)機(jī)制研究的代表菌株。

3.3 sub-MIC阿奇霉素對(duì)WB1549菌株生物膜形成相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)的影響

以0.25 μg/mL（驗(yàn)證試驗(yàn)顯示，該劑量的抑制作用最強(qiáng)）阿奇霉素作用于WB1549菌株后，對(duì)其生物膜形成相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)的變化情況進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，6個(gè)生物膜形成相關(guān)調(diào)控基因中有4個(gè)基因的表達(dá)受到顯著抑制（P<0.05），包括生物膜相關(guān)蛋白（BAP）編碼基因bap、Ⅲ型菌毛合成的調(diào)控基因filA以及與膜結(jié)構(gòu)相關(guān)的青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）編碼基因pbp-1a、pbp-1b；而外膜蛋白（OMPA）編碼基因ompA和調(diào)控菌毛合成的csu家族基因csuE的表達(dá)則未見(jiàn)顯著變化（P>0.05）。這提示阿奇霉素影響了MDR-AB菌株生物膜形成的多個(gè)調(diào)控途徑，包括影響Ⅲ型菌毛的合成、生物膜的完整性以及生物膜蛋白的合成。

4 討論

隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用及濫用，MDR-AB菌株的臨床檢出率日益增高[8]。本研究MIC測(cè)定結(jié)果顯示，我院臨床檢出的MDR-AB菌株對(duì)多類常用抗菌藥物耐藥，包括碳青霉烯類、頭孢菌素類、喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等。這提示當(dāng)患者受到MDR-AB菌株感染時(shí)，臨床可供選擇的抗菌藥物有限；此外這也提示，許多抗菌藥物的常規(guī)治療濃度難以達(dá)到抑制MDR-AB菌株的MIC而處于sub-MIC。在此背景下，探討sub-MIC抗菌藥物對(duì)MDR-AB菌株生物膜形成的影響具有極大的臨床價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，不同劑量sub-MIC抗菌藥物對(duì)MDR-AB菌株生物膜的形成會(huì)產(chǎn)生不同影響。其中，有明顯誘導(dǎo)作用的為多西環(huán)素，影響不明顯的包括美羅培南、頭孢哌酮、替加環(huán)素、慶大霉素、多黏菌素B等，而頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、阿奇霉素和阿米卡星則表現(xiàn)出了明顯的抑制作用，且阿奇霉素的抑制作用相對(duì)最強(qiáng)（2 μg/mL即可顯示出較強(qiáng)的抑制作用），其量效關(guān)系在基因背景清楚的AB標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 17978）中得到了驗(yàn)證。已有研究表明，阿奇霉素對(duì)銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌的生物膜形成具有抑制作用[9]，但其對(duì)MDR-AB菌株生物膜形成的影響尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，故本課題組在上述研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了sub-MIC阿奇霉素影響MDR-AB菌株生物膜形成的可能機(jī)制。

MDR-AB菌株生物膜形成的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。已有研究顯示，其生物膜形成可能與BAP蛋白、OMPA蛋白、膜結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因以及細(xì)菌運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)[10]，因此筆者推測(cè)sub-MIC抗菌藥物對(duì)MDR-AB菌株生物膜形成的影響亦有可能涉及以上靶點(diǎn)。相關(guān)研究證實(shí)，BAP蛋白可通過(guò)促進(jìn)菌株的黏附來(lái)誘導(dǎo)其生物膜的形成[10]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)sub-MIC阿奇霉素作用后，bap基因的表達(dá)受到顯著抑制，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。OMPA蛋白可誘導(dǎo)菌株黏附或侵襲上皮細(xì)胞，促進(jìn)其生物膜形成，增強(qiáng)其活性[11]，但本研究并未發(fā)現(xiàn)阿奇霉素對(duì)其編碼基因ompA表達(dá)的影響，提示該基因可能并非阿奇霉素的作用靶點(diǎn)。值得注意的是，AB菌株沒(méi)有鞭毛，菌毛是其主要的運(yùn)動(dòng)器官，且生物膜的形成與之密切相關(guān)[12]。盡管csu基因家族（csuA/BABCDE）編碼蛋白可影響細(xì)菌菌毛的合成，但本研究并未發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵調(diào)控基因csuE表達(dá)的顯著改變，提示csu基因家族介導(dǎo)的菌毛合成可能并未參與阿奇霉素的作用過(guò)程[12]。Ⅲ型菌毛相關(guān)基因filA調(diào)控Ⅲ型菌毛的合成[12]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)sub-MIC阿奇霉素作用后，其表達(dá)受到了顯著抑制，表明該基因可能是阿奇霉素的作用靶點(diǎn)。PBPs蛋白可與青霉素G共價(jià)結(jié)合，是一類廣泛存在于細(xì)菌表面的膜蛋白。該蛋白參與了細(xì)菌細(xì)胞壁的合成和糖肽結(jié)構(gòu)的形成，對(duì)維持細(xì)菌的正常形態(tài)具有重要的作用[13]。已有研究表明，大腸埃希菌中PBPs蛋白表達(dá)的下調(diào)會(huì)影響其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，從而影響鞭毛的活力，導(dǎo)致細(xì)菌運(yùn)動(dòng)力受損[13]。后續(xù)研究顯示，PBP1a、PBP2a、PBPB2等蛋白及其編碼基因的缺失對(duì)變形鏈球菌[14]、金黃色葡萄球菌[15]等多種細(xì)菌的分裂、生長(zhǎng)或生物膜形成均有顯著影響，但尚未見(jiàn)PBPs對(duì)MDR-AB菌株生物膜形成影響的相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)sub-MIC阿奇霉素作用后，MDR-AB菌株中PBPs蛋白編碼基因pbp-1a、pbp-1b的表達(dá)均顯著下降，提示PBPs蛋白可能參與了該菌株生物膜的形成，而阿奇霉素對(duì)其調(diào)控的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，我院MDR-AB菌株的耐藥情況嚴(yán)重。sub-MIC頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、阿米卡星、阿奇霉素對(duì)其生物膜的形成具有明顯的抑制作用，其中阿奇霉素的作用最強(qiáng)且呈量效關(guān)系。阿奇霉素對(duì)MDR-AB菌株生物膜形成的抑制作用可能與其下調(diào)bap、filA、pbp-1a、pbp-1b基因的表達(dá)有關(guān)。但目前對(duì)該菌的研究多集中在其流行病學(xué)特征上，而對(duì)其生物膜形成等病原學(xué)行為機(jī)制的探討甚少，故本研究的結(jié)論及其具體機(jī)制仍有待后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

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（收稿日期：2018-08-24 修回日期：2018-09-25）

（編輯：張?jiān)拢?/p>