高效液相色譜法測(cè)定益和長泰片中淫羊藿苷含量的研究

河南省口岸食品檢驗(yàn)檢測(cè)所（450003）魏華琳 李嘉 陶健

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿、或朝鮮淫羊藿的干燥葉，淫羊藿苷是淫羊藿提取物，也是重要的有效成分[1][2]。現(xiàn)代藥理研究表明，淫羊藿苷具有廣泛的生理活性，能增加心腦血管血流量、促進(jìn)造血功能、免疫功能及骨代謝，還有補(bǔ)腎壯陽等功效[3]。

目前，淫羊藿苷的檢測(cè)方法主要有分光光度法、薄層法、液相色譜法。為準(zhǔn)確監(jiān)控其含量，本文建立高效液相色譜法測(cè)定淫羊藿苷含量的方法。本方法簡便，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，適用于益和長泰片中淫羊藿苷含量的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 ①儀器：高效液相色譜儀，美國waters公司，型號(hào)Waters e2695，Waters 2998 PDA檢測(cè)器。水純化系統(tǒng)，默克公司，Milli Q IQ7000超純水儀。②試劑及耗材：淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品購自ChromaDex公司，批號(hào)：00009038-612。聚酰胺粉，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠，批號(hào)：2017年8月9日。甲醇，德國默克公司，色譜純，批號(hào)：2020/04/30。無水乙醇，天津富宇精細(xì)化工有限公司，分析純，批號(hào)：2018年1月15日。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱Inertsustain C18 column（250mm×4.6mm,5μm)，柱溫30℃，檢測(cè)波長270nm，進(jìn)樣量10μL。流動(dòng)相A：甲醇，B：水，等度洗脫條件見附表1。

1.2.2 樣品處理 試樣經(jīng)過粉碎過后，稱取0.50g（精確至0.01g）置于50mL離心管中，加入20mL70%乙醇水溶液，超聲20min，渦旋1min，于4000r離心2min，上層清液全部轉(zhuǎn)移到100mL梨形瓶，殘?jiān)偌?0mL70%乙醇水溶液，渦旋1min，于4000r離心2min，合并上清液到梨形瓶中，在80℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干，加10mL水溶解，待凈化。取待凈化溶液，過預(yù)先處理的聚酰胺柱，棄去流出液，加50mL水淋洗兩次，棄去淋洗液；抽干小柱，加100mL乙醇洗脫，收集洗脫液（整個(gè)上樣、洗脫過程保持流速1mL/min）到250mL梨形瓶中。在80℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干洗脫液，用5mL甲醇溶解。經(jīng)0.22μm濾膜重新過濾，供高效液相色譜測(cè)定。

附表1 流動(dòng)相的洗脫程序

附表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

附圖1 淫羊藿苷對(duì)照品溶液色譜圖

附圖2 樣品溶液色譜圖

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 用甲醇配制質(zhì)量濃度分別為2μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長的選擇 采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)淫羊藿苷對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果270nm處有最大吸收，最終確定檢測(cè)波長為270nm。

2.2 色譜條件的選擇 考察了不同比例的甲醇（35%～65%）流動(dòng)相條件，結(jié)果表明，流動(dòng)相為（甲醇：水=45+55）可獲得更好的峰形和較高的響應(yīng)值。附圖1、附圖2分別為對(duì)照品溶液及樣品溶液的色譜圖。

2.3 前處理方法的選擇 樣品經(jīng)聚酰胺柱洗脫時(shí)，分段收集乙醇洗脫液（0～60mL，60～80mL，80～100mL，100～120mL）蒸干后，用甲醇定容進(jìn)樣。結(jié)果顯示80mL醇洗液已經(jīng)將淫羊藿苷完全洗脫，考慮到樣品中淫羊藿苷含量的差異，最終確定乙醇洗脫液的用量為100mL。

2.4 方法的線性關(guān)系 將不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果表明，淫羊藿苷在2～100μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9994）。

2.5 方法的檢出限 對(duì)空白樣品分別添加一定濃度的對(duì)照品溶液，使之在可以檢出。按照信噪比為S/N=3計(jì)算，最低檢出限為4μg/g。

2.6 精密度和回收率試驗(yàn) 采用空白樣品進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)。樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成20μg/g、50μg/g、100μg/g三個(gè)添加水平，分別進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，平均回收率為98.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）2.3%，符合試驗(yàn)對(duì)回收率和精密度的要求，見附表2。

3 結(jié)論

本方法通過對(duì)目標(biāo)物的有效凈化和分離，實(shí)現(xiàn)了快速測(cè)定，準(zhǔn)確定量和確證的目的，適用于益和長泰片中淫羊藿苷含量的檢測(cè)。