苦蕎飲食對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腸道菌群的影響

蔡光澤，蔡興勇，王安虎，劉新宇

（1.西昌學(xué)院，四川 西昌 615013；2.西昌市農(nóng)牧局，四川 西昌 615000；3.四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041）

高血壓是全球最常見的心血管疾病。1937年，Morse等[1]研究結(jié)果表明，四川省涼山地區(qū)彝族人群血壓維持在較低水平且不隨年齡增長而升高或只是輕微升高。1979年，吳德誠等[2]對(duì)普格縣彝族農(nóng)民的調(diào)查證實(shí)了Morse的研究結(jié)果。吳天一等[3]抽樣調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),同一地區(qū)不同民族間和不同地區(qū)同一民族間高血壓標(biāo)化患病率存在差異。1991年第三次全國高血壓抽樣調(diào)查也顯示[4]，患病率最低為彝族(3.28%),較高依次為朝鮮族(22.95%)、藏族(21.04%)、蒙古族(20.22%)。中國流行病學(xué)的先驅(qū)和奠基人何觀清教授根據(jù)全國（1958—1959年、1979—1980年）高血壓流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，影響彝族人血壓的主要因子是環(huán)境因素，包括當(dāng)?shù)氐纳鐣?huì)經(jīng)濟(jì)因素、居民膳食結(jié)構(gòu)、體力活動(dòng)等，未發(fā)現(xiàn)與遺傳因素的顯著關(guān)聯(lián)[5-6]。遺傳流行病學(xué)與移民流行病學(xué)研究表明彝族移民和彝族原住農(nóng)民有著相同的遺傳背景,但移居到城鎮(zhèn)后生活方式和膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,因此環(huán)境因素的改變是影響彝族移民血壓的最主要因素?？嗍w、土豆和玉米幾千年來都是彝族人的主食，盡管彝族人平常還食用燕麥等小眾糧食作物，但現(xiàn)有的研究不足以支持長期土豆、玉米加上零星的燕麥飲食能降低血壓這種觀點(diǎn)。這提示以苦蕎為主食的彝族人膳食結(jié)構(gòu)對(duì)低的高血壓發(fā)病率起到直接作用。

腸道菌群是生物體的第二基因組，不斷深入的研究表明腸道菌群不只在消化過程發(fā)揮作用，它和宿主健康有著極為密切的聯(lián)系。相關(guān)研究[7]顯示在SHR和藥物誘導(dǎo)高血壓大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)都發(fā)生顯著改變，表現(xiàn)為菌群的豐度、多樣性、均一度降低，而F/B升高。Adnan等[8]也發(fā)現(xiàn)，接受來自高血壓大鼠腸道菌群的抗生素處理大鼠血壓升高了。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院高血壓中心蔡軍等[9]發(fā)文揭示高血壓與腸道菌群的關(guān)系，闡述了腸道菌群平衡對(duì)維持血壓的重要性，也為高血壓的治療提供了新思路——可以通過飲食干預(yù)等方式，重構(gòu)高血壓患者腸道菌群，從而達(dá)到治療的目的。研究表明[10]不同遺傳背景的人對(duì)相同的膳食響應(yīng)可能不同，并且跟個(gè)人的腸道菌群有著極大的聯(lián)系。盡管有研究表明苦蕎飲食能降低SHR血壓，但苦蕎通過對(duì)SHR腸道菌群的影響降低血壓，未見報(bào)道。因而，本研究通過SHR模型，闡釋苦蕎飲食對(duì)SHR腸道菌群的影響，以期為高血壓等心血管疾病食療提供一些有益的參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供的健康狀況良好，清潔級(jí)、11周齡自發(fā)性高血壓大鼠10只，合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于四川大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度40%～60%，光照節(jié)律：06：00：00—18：00：00，保持通風(fēng)良好。動(dòng)物適應(yīng)一周后（12周齡）開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器和試劑

SoftronBP-98A型大鼠智能無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測量儀（北京軟隆科技有限責(zé)任公司）；SIGMA 1-15PK高速離心機(jī)(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)?？嗍w粉購自涼山州邛都苦蕎制品有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組

10只SHR大鼠隨機(jī)分成2組，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d經(jīng)血壓、體重測量后，根據(jù)收縮壓、體重差異采用拉丁方分組法將其分為常規(guī)飲食對(duì)照組和苦蕎飲食干預(yù)組，每組5只。飲食干預(yù)試驗(yàn)開始后第3、6和12周收集大鼠糞便。

1.3.2 血壓測量

采用智能Softron-98A型大鼠無創(chuàng)尾動(dòng)脈測壓儀,測量大鼠尾動(dòng)脈收縮壓時(shí)，測量大鼠血壓的操作間溫度保持在22℃，室內(nèi)保持安靜。測量時(shí)先將智能無創(chuàng)血壓儀的主機(jī)與電腦相連，并依據(jù)所要測量大鼠的大小，挑選合適的鼠袋；調(diào)試無創(chuàng)血壓儀主機(jī)上的溫度設(shè)置，確使鼠袋內(nèi)部的保溫桶保持在39℃；將大鼠固定在鼠袋之中時(shí)，動(dòng)作一定要輕柔，盡量使大鼠保持安靜。在鼠袋預(yù)熱15 min后，無創(chuàng)血壓儀主機(jī)及電腦自動(dòng)開啟測量模式，每只大鼠連續(xù)測量3次取其平均值，并記錄測量結(jié)果。因大鼠的血壓，易受環(huán)境狀態(tài)、溫度高低等影響，所以測量時(shí)應(yīng)在同一條件下進(jìn)行，這樣才能做到一致。測量時(shí)間固定在13:00—15:00。每2周測一次血壓。

1.3.3 大鼠糞便菌群基因組DNA的提取與PCR擴(kuò)增

采用Stool DNA Kit抽提大鼠糞便 DNA，步驟按照說明書進(jìn)行。完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA完整性。采用細(xì)菌16S rRNA(V3+V4)區(qū)域引物：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；5'-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃5 min；25個(gè)循環(huán)包括95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s；72℃7 min，至4℃停止。每個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，上樣量3 uL。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

PCR產(chǎn)物采用His-seq高通量測序平臺(tái)進(jìn)行測序。高質(zhì)量序列的提?。篐is-seq測得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，將成對(duì)的reads拼接成1條序列，同時(shí)對(duì)reads質(zhì)量和merge的效果進(jìn)行質(zhì)量控制和過濾，去除序列末端的引物和接頭序列、多堿基N、polyA/T尾巴及低質(zhì)量堿基；去除所得到的barcode標(biāo)簽序列、前引物序列以及長度短于200 bp、模糊堿基數(shù)大于0、序列平均質(zhì)量低于20的序列。

操作單元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚類分析：提取非重復(fù)序列，使用QIIME分析平臺(tái)進(jìn)行序列的生物信息學(xué)分析，與Silva數(shù)據(jù)庫已比對(duì)的16S核糖體序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，對(duì)相似性大于97%以上的序列進(jìn)行歸并，生成分類結(jié)果。進(jìn)行alpha和beta多樣性計(jì)算，采用Chao、Shannon評(píng)估指數(shù)分別對(duì)樣本進(jìn)行多樣性分析。根據(jù)Silca數(shù)據(jù)庫已有的參考序列對(duì)OUT進(jìn)行種屬鑒定。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用R軟件進(jìn)行繪圖分析，數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 SHR一般情況比較

常規(guī)飲食組和苦蕎飲食干預(yù)組動(dòng)物生長良好，飲水、進(jìn)食、活動(dòng)正常。

2.2 SHR體質(zhì)量變化

從體質(zhì)量來看，在第3和第6周時(shí)，常規(guī)飲食組與苦蕎飲食組體質(zhì)量差異不明顯；在第12周時(shí)，常規(guī)飲食組與苦蕎飲食組體質(zhì)量存在顯著性差異（mean±SD,p＜0.001），苦蕎飲食組體質(zhì)量平均減少了9.6%（圖1）。

圖1 苦蕎飲食對(duì)SHR體重的影響

2.3 SHR血壓變化

和SHR-C相比較，SHR-TBW大鼠血平均壓顯著性下降（mean± SD,p＜0.001）。在第3周時(shí)，和SHR-C相比，平均血壓下降了11.03%；第6周時(shí)下降了18.84%；第12周時(shí)下降了25.64%。

圖2 苦蕎飲食干預(yù)顯著性降低了SHR平均血壓

2.4 苦蕎飲食干預(yù)對(duì)SHR腸道菌群的影響

2.4.1 苦蕎飲食對(duì)SHR腸道菌群多樣性影響分析

OTU（Operational Taxonomic Units：操作分類單元）是為了便于生物信息統(tǒng)計(jì)分析，將所有序列歸類操作成多個(gè)小組，即通常在相似度97%水平上聚類成可操作分類單元（OTU）。通過對(duì)樣本進(jìn)一步的多樣性分析，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)分析群落的物種多樣性和豐富度，包括菌群豐度指數(shù)（Chao、Ace）、菌群多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson）、測序深度指數(shù)（Coverage），其中 Shannon 則是用來估測樣本中微生物的多樣性指數(shù)之一，Shannon指數(shù)的數(shù)值與微生物多樣性成正比，其值越大，說明微生物群落多樣性越大。從圖3A中可以看出：隨著TBW飲食時(shí)間延長，SHR-TBW的OTU數(shù)目得到顯著性提高，即OTU數(shù)增多；從 Shannon指數(shù)來看，SHR-TBW的Shannon指數(shù)增加，也就是苦蕎飲食干預(yù)后，SHR-TBW大鼠菌群微生物多樣性得到提高。

圖3 苦蕎飲食對(duì)SHR腸道菌群多樣性的影響

2.4.2 苦蕎飲食對(duì)SHR腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性影響分析

門水平上腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化在正常人體糞便中存在著四大主要的細(xì)菌門，包括厚壁菌門（Firmicutes)、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）以及放線菌門（Actinobacteria）。從圖4（封二）中可以看出，苦蕎飲食干預(yù)后，SHR腸道菌群四大菌在門水平上的豐度發(fā)生了變化，其中厚壁菌門和擬桿菌門的豐度改變最為明顯，這就說明，苦蕎飲食會(huì)改變SHR腸道菌群的菌群結(jié)構(gòu)。

在四大主要菌門中，厚壁菌門和擬桿菌門在腸道中占絕對(duì)優(yōu)勢，因此二者的比值（F/B）從0.22上調(diào)至1.89，能夠很好地反應(yīng)菌群在門水平上結(jié)構(gòu)的改變。

在屬水平上，腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化明顯。如圖5（封二）所示，苦蕎飲食干預(yù)后，隨時(shí)間改變SHR腸道菌群結(jié)構(gòu)變化較為明顯的部分菌屬依次為普氏菌屬（Prevotella）、擬桿菌屬（Bacteroides）、甲烷粒菌屬（Methanocorpusculum)、毛螺菌屬（Lachnospiracea_incertae_sedis）、Allobaculum、陶厄氏菌（Thauera）、乳桿菌屬（Lactobacillus）以及變形桿菌屬（Proteus)。

3 討論

高血壓是多因素疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，為環(huán)境與遺傳共同作用的結(jié)果，是一種最常見的慢性非傳染病，已成為心、腦血管疾病和腎病等慢性疾病最重要的危險(xiǎn)因素，促使罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)和全因死亡率增加，其流行已成為全球重要的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)[11-12]。2013年全球約1 000萬死亡及8.5%的壽命損失（傷殘調(diào)整壽命年）可歸因于高血壓，位列所有健康危險(xiǎn)因素第二位。在我國，約250萬死亡（占總死亡的28%）和15%的壽命損失可歸因于高血壓，是僅次于不合理膳食的第二位健康危險(xiǎn)因素[13]。Lewington等[14]中國50萬人高血壓調(diào)查新數(shù)據(jù)表明：我國高血壓患病率高達(dá)32.5%，控制率僅僅4.2%。這是自我國1957年第一次普查以來患病率最高的數(shù)據(jù)。研究高血壓發(fā)病誘因及調(diào)控機(jī)制，對(duì)于明確疾病診斷，控制血壓，減輕靶器官損害及改善預(yù)后有重要的意義。腸道菌群組成變化和功能失調(diào)與包括高血壓在內(nèi)的多種慢性病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，通過調(diào)控腸道菌群來維持健康成為目前研究熱點(diǎn)[7-9]，抗生素、飲食、宿主遺傳和細(xì)菌之間的作用是調(diào)控腸道菌群功能組成四大因素。其中膳食營養(yǎng)是影響腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能最為重要的，也較為迅速的因素，并由此影響宿主的代謝狀況[15]。高脂等不健康飲食習(xí)慣會(huì)引起腸道菌群的失調(diào)，使腸道通透性增加，形成全身的慢性、低水平炎癥，進(jìn)一步破壞胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致包括胰島素抵抗、肥胖、糖尿病和高血壓等在內(nèi)的代謝綜合征的發(fā)生[16-18]。高纖維飲食、富含多酚飲食并輔以蔬菜水果等進(jìn)行干預(yù)，在保證足夠的人體營養(yǎng)基礎(chǔ)上，又保證腸道菌群的“營養(yǎng)健康”，就可以改善由高脂飲食導(dǎo)致的菌群失調(diào)并改善由此帶來的代謝失衡等慢性疾病。在食物—腸道菌群—代謝這條通路中到底存在著一種怎樣的調(diào)控血壓機(jī)制，針對(duì)高血壓低發(fā)病人群彝族人的飲食結(jié)構(gòu)，本研究做了前瞻性的研究，并獲得了一些有益的結(jié)果：苦蕎飲食可以降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓，同時(shí)自發(fā)性高血壓大鼠的體質(zhì)量也發(fā)生了顯著性變化，肥胖是包括高血壓在內(nèi)的很多疾病的誘因，肥胖與腸道菌群功能失調(diào)密切相關(guān)，苦蕎飲食是否是通過熱量限制調(diào)控體質(zhì)量從而降低了血壓？是需要我們進(jìn)一步研究來破解苦蕎飲食對(duì)血壓調(diào)控的機(jī)制。