利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)高效創(chuàng)制水稻品系“17318”的OsGW2、OsGN1a基因定向突變體

周建平，吉琳藝，何 瑤，鄭雪蓮，羅 樊，蔡光澤*，張 勇*

（1.電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院信息生物學(xué)中心，成都 610054；2.西昌學(xué)院，四川 西昌 615013）

傳統(tǒng)創(chuàng)制突變體的方法主要有輻射誘變、化學(xué)誘變劑處理、轉(zhuǎn)座子插入及T-DNA插入等[1]。盡管這些誘變方法都能夠使植株發(fā)生突變，但是其突變位點(diǎn)是隨機(jī)產(chǎn)生，由此也增加了突變體的篩選難度。近幾年來，基因編輯技術(shù)成為一種新興的創(chuàng)制突變體的方法。其主要是運(yùn)用特異的核酸酶定向使目標(biāo)基因產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（double-strand break，DSB），斷裂的DNA能夠激活細(xì)胞內(nèi)固有的非同源末端連接(Non-homologous-ending-joining，NHEJ)或同源重組(Homologous recombination，HR)兩種不同的修復(fù)機(jī)制對其進(jìn)行修復(fù)[2-3]，從而實(shí)現(xiàn)對基因組的定點(diǎn)編輯。

早期的基因編輯技術(shù)主要包括鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs），它們都是由特異性的DNA識別結(jié)構(gòu)域和具有DNA剪切功能的Fok I核酸內(nèi)切酶組成。ZFNs的DNA識別結(jié)構(gòu)域由3～4個(gè)Cys2-His2鋅指蛋白（zinc-fingers）串聯(lián)組成，每個(gè)鋅指蛋白識別并結(jié)合一個(gè)特異的三聯(lián)體堿基[4]。TALENs的DNA識別結(jié)構(gòu)域由一系列植物病原菌黃單胞菌（Xanthomonas）自然分泌的TAL效應(yīng)子蛋白串聯(lián)重復(fù)組成，每個(gè)TAL效應(yīng)子只能識別一個(gè)堿基[5]。近幾年來，ZFNs和TALENs被應(yīng)用于植物基因組的編輯中[6]，這為植物突變體創(chuàng)制和育種提供了新的思路。但是ZFNs和TALENs這兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作難度大，載體的構(gòu)建較為復(fù)雜，耗時(shí)長，且效率低，一般實(shí)驗(yàn)室很難有效利用。

2013年，多個(gè)研究組相繼發(fā)表了應(yīng)用CRISPR/Cas9 （Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）作為一種新的基因編輯工具對基因進(jìn)行改造的文章[7-12]。CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)早在1987年就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)[13]，但是直到2007年才被首次證明該系統(tǒng)與細(xì)菌免疫系統(tǒng)相關(guān)[14]，是細(xì)菌保護(hù)機(jī)體免受病毒或質(zhì)粒DNA入侵的一種免疫機(jī)制。這種免疫保護(hù)主要是通過細(xì)菌體內(nèi)具有的序列特異性小RNA沉默外來入侵的核苷酸來完成的[15]。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)因其設(shè)計(jì)操縱簡便、編輯高效與通用性廣等優(yōu)勢而廣泛應(yīng)用于動物、植物、微生物基因組的定向修飾及遺傳改良中[16-21]。最近，研究者發(fā)展了新的Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)—CRISPR/Cpf1系統(tǒng)[22-23]，它主要優(yōu)點(diǎn)是刪除片斷比較大(大多為6～13 bp)，目前已經(jīng)在植物中加以應(yīng)用[24-26]。

水稻籽粒大小和穗粒數(shù)是與產(chǎn)量直接相關(guān)的重要性狀，同時(shí)與水稻的品質(zhì)有密切關(guān)系。到目前為止，一些控制籽粒大小和穗粒數(shù)的基因被成功克隆并用于育種中[27-28]。GW2是一個(gè)控制粒寬和粒重的主效基因，GW2編碼一個(gè)環(huán)型E3泛素連接酶，GW2功能缺失會加快水稻籽粒灌漿速率，導(dǎo)致粒寬增大、粒重和產(chǎn)量增加。另外，雖然增大了粒寬，但對籽粒外觀品質(zhì)影響很小，而且?guī)缀鯖]有影響到蒸煮和食味品質(zhì)[29]。GN1a是第一個(gè)被克隆的控制穗粒數(shù)的QTL，位于第1染色體的短臂，編碼細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶2，能夠降解細(xì)胞分裂素。GN1a表達(dá)量的下降或者功能缺失，使得穎花分生組織中細(xì)胞分裂素大量積累，增加二次枝梗數(shù)，引起穎花數(shù)目的增加，最終增加了每穗粒數(shù)，進(jìn)而提高了產(chǎn)量[28]。運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)手段快速創(chuàng)制并聚合這些基因的突變體，將大大加速水稻育種的進(jìn)程。

本文利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)定向創(chuàng)制并獲得了水稻品系“17318”O(jiān)sGW2、OsGN1a基因的突變體，不僅可以為水稻育種儲備更多的遺傳資源，還可以為加速水稻育種進(jìn)程提供新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻品系“17318”。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 載體構(gòu)建

以pZHY988質(zhì)粒作為模板，用引物OsGW2-sgRNA1-P1F（caccggtctcAgtgtGGTGTAAA GACAAAGGgttttagagctagaaata） 和 General-P1R（CGCCAATATATCCTGTCAAA）進(jìn)行擴(kuò)增。

以pZHY988質(zhì)粒作為模板，用引物General-P2F（tttgacaggatatattggcgAGGATccgcGGAT CATG）和 OsGN1a-sgRNA1-P2R（CGATGGTCTC CAAACCCCTG CAGGCGGCCG AGCGACACAC AAGCGACAGC GC）進(jìn)行擴(kuò)增。

將上述兩個(gè)PCR產(chǎn)物回收，等量混合，并以此為模板，用OsGW2-sgRNA1-P1F，OsGN1a-sgRNA1-P2R為引物，做融合PCR。將融合PCR產(chǎn)物直接回收，通過Golden Gate反應(yīng)與pZHY988進(jìn)行連接。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌落PCR驗(yàn)證，挑選陽性克隆搖菌，提質(zhì)粒，測序，最后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

根據(jù)文獻(xiàn)[30]提供的方法進(jìn)行。

1.2.3 再生苗轉(zhuǎn)基因陽性檢測

水稻苗DNA提取采用CTAB法，利用引物TX067-ZmUbi-F：CATATGCAGCAGCTATATGTG GA；ZY295-Cas9-HP-2：TCTTCTCACCAGGGAGC TGAGCA進(jìn)行PCR的方法鑒定陽性植株。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃30 s(35 cycles)；72 ℃ 5 min；10 ℃ 10 min。

1.2.4 突變體的鑒定

對于OsGN1a基因位點(diǎn)，采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism ，PCR-RFLP）技術(shù)進(jìn)行初步鑒定。用引物OsGN1a-PstI-F2：GCCTCCTTCCTCGACGACCT 和OsGN1a-PstI-R3：GGTGAGGTGGAGGTAGTCTGT進(jìn)行PCR后，取10 μL PCR產(chǎn)物用Pst I酶切，后瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效果。

對于OsGW2基因位點(diǎn)，采用PCR-SSCP進(jìn)行突變體的初步篩選，具體方法見文獻(xiàn)[31]。首先用引物 OsGW2-SSCP-F1：CTCACACTGCTCAGCC TACAC和OsGW2-SSCP-R1：GTGCTTCTATGACT TTCTGCTCT進(jìn)行PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段，然后將PCR產(chǎn)物變性，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行突變體的初步篩選。對初步篩選的突變體材料OsGN1a、OsGW2基因位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物送交擎科生物公司測序驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 載體構(gòu)建

經(jīng)過2次PCR擴(kuò)增，一次融合PCR，將OsGN1a-gRNA1和OsGW2-gRNA1兩個(gè)靶位點(diǎn)裝載到pZHY988上，構(gòu)建了載體pZJP049（圖1），并通過測序證實(shí)載體構(gòu)建正確。

圖1 OsGN1a和OsGW2雙位點(diǎn)敲除突變載體示意圖

2.2 陽性檢測

將構(gòu)建的載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷，獲得水稻再生苗。隨機(jī)挑選9株再生苗，采用CTAB法提取水稻基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽性檢測。結(jié)果顯示9株均能擴(kuò)出目的條帶，說明均為陽性植株，其陽性率為100%。

圖2 轉(zhuǎn)基因T0代陽性植株檢測電泳圖

2.3 突變體的鑒定

選取轉(zhuǎn)基因陽性檢測為陽性的單株，首先通過引物OsGN1a-PstI-F2和OsGN1a-PstI-R3從水稻基因組DNA中擴(kuò)增出包含靶位點(diǎn)的一段序列，擴(kuò)增片段長度為456 bp。然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過限制性內(nèi)切Pst I酶切。最后通過瓊脂糖凝膠電泳分離酶切條帶，野生型會被切成311 bp和145 bp的兩條帶。如果陽性植株出現(xiàn)未被切割的抗性帶，即為突變植株。結(jié)果（圖3，圖5，表1）顯示9株中有7株在OsGN1a基因位點(diǎn)產(chǎn)生抗性帶，突變效率為77.7%。

圖3 PCR-酶切檢測OsGN1a基因位點(diǎn)敲除突變體

同時(shí)，對這9株陽性植株引物OsGW2-SSCP-F1和OsGW2-SSCP-R1從水稻基因組DNA中擴(kuò)增出包含靶位點(diǎn)的一段序列，擴(kuò)增片段長度為299 bp。然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過SSCP進(jìn)行鑒定，如果出現(xiàn)與野生型不同的條帶，則為突變體。結(jié)果（圖4，圖5，表1）顯示這9株中有9株在OsGW2基因位點(diǎn)與野生型的條帶不一致，表明突變效率為100%。

2.4 突變體種子大小

突變T0植株在人工氣候室中顯示：株型與野生型沒有明顯差異，分蘗也沒有明顯差異，雙基因聚合突變體(gw2gw2gn1agn1a)的主穗長達(dá)30.5 cm，而野生型的主穗長約22 cm。雙基因聚合突變體T0植株4-1所結(jié)種子在長度和寬度均有明顯增加（圖6），這與預(yù)期結(jié)果一致。

圖4 PCR-SSCP檢測OsGW2基因位點(diǎn)敲除突變體

圖5 突變體GN1a和GW2基因位點(diǎn)測序比對圖

表1 轉(zhuǎn)基因植株突變效率統(tǒng)計(jì)表

圖6 突變體植株4-1所結(jié)種子大小。

3 討論

自CRISPR/Cas9技術(shù)在植物中開始應(yīng)用以來，針對它的剪切效率報(bào)道表明其遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ZFNs和TALENs，但卻因物種、靶基因、靶位點(diǎn)、脫靶效應(yīng)、轉(zhuǎn)化方式等因素的影響，Cas9的剪切效率也不盡相同。Li[16]發(fā)現(xiàn)Cas9在擬南芥原生質(zhì)體中的效率為1.1%～5.6%，而在煙草原生質(zhì)體中效率大大增加，為37.7%～38.5%。Yang等[32]在擬南芥中應(yīng)用Cas9敲除一個(gè)位點(diǎn)的效率為50%～89%，同時(shí)敲除2個(gè)位點(diǎn)的效率為68%～74%。相反，Cas9在水稻原生質(zhì)體中的效率為14.5%～38%，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的效率卻只有7.1%～9.4%[18]。Zhang[33]實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用Cas9在水稻中靶向了11個(gè)基因，單位點(diǎn)敲除效率為22.1%～66.7%，雙位點(diǎn)敲除效率為為5.7%～33.3%。除此之外，Cas9還被應(yīng)用于其他的模式植物中，在大豆中的剪切效率為70%[34]，番茄中的剪切效率為75%[35]，玉米中的剪切效率為16.4%～19.1%[36]。從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，CRISPR/Cas9在水稻中的工作效率很高，單位點(diǎn)敲除效率在OsGN1a、OsGW2基因位點(diǎn)的突變效率分別為77.7%和100%（表1），而雙位點(diǎn)敲除效率為77.7%。

近來，研究者將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于水稻功能基因的功能研究、性狀改良與分子設(shè)計(jì)育種之中。劉耀光課題組利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)研究了水稻雄性不育機(jī)制[37]，高彩霞課題組利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)獲得了對草甘膦具有抗性的材料[16]，王克劍研究組利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定向改良不同水稻品種的GN1a,DEP1,GS3,IPA1等基因[38-39]。我們利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻品系“17318”中定向、高效創(chuàng)制、并快速聚合GN1a,GW2基因，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)性狀的精確改良，為水稻定向育種提供了新的高效方法。