納米淡水珍珠粉的制備及生物學實驗評價

毛秋華 徐 普 程亞楠 廖 軍 陳 靈 邢 璐 李木元

珍珠主要是由約95%多晶體碳酸鈣（納米級碳酸鈣晶粒構成）和不到5%有機質構成，具有天然骨相類似結構，國內外大量研究證實珍珠具有良好的生物相容性和骨誘導作用，而納米級珍珠粉生物降解性和骨生成作用更突出[1～5]。

納米材料是指由處于一定尺度范圍（1nm～100nm）內的納米顆粒及其致密的聚集體，或由納米微晶體所構成的具有表面效應、量子（?。┏叽缧土孔铀淼佬纫幌盗刑厥庑牟牧蟍6]，由于其粒子尺寸小、比表面積大、化學活性高等優(yōu)良特性使其具有廣泛的應用前景，許多在一般條件沒有生物毒性的物質，在納米粒度尺寸下可以表現出很強的生物毒性，而不同納米材料類型、形態(tài)、濃度和制備方法等毒性作用也可能不一樣，因此，有必要對每一種納米材料的生物相容性進行實驗研究。

本研究參照國家醫(yī)療器械生物學評價標準GB/T 16886，選擇細胞毒性試驗、溶血試驗、皮內反應試驗和急性毒性試驗對研磨制備的納米級淡水珍珠粉的生物相容性進行了初步實驗研究。

資料和方法

一、實驗細胞、動物與材料

1.細胞株

L929細胞（小鼠成纖維細胞），由上海中科院細胞庫提供。

2.實驗動物

SD大鼠16只，雌性，體重180～220g；健康新西蘭白兔3只，雌雄不限，體重2kg～2.5kg，由長沙市天勤生物技術有限公司提供。

3.主要材料與儀器

材料：微米級淡水珍珠粉（海南京潤珍珠生物技術股份有限公司）；MTT、二甲基亞砜、0.25%胰蛋白酶溶液等試劑（Sigma公司，美國）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素（Gibco公司，新西蘭）；磷酸鹽緩沖液1×10（索萊寶）；苯酚（分析純，廣州市番禺力強化工廠）。

儀器：立式雙軸納米陶瓷砂磨機（KLLN-1，深圳市科力納米工程設備有限公司）；臺式低速離心機（KDC-40，安微中科中佳科學儀器有限公司）；電子分析天平（Ohaus，美國；JE-01，上海浦春）；CO2細胞培養(yǎng)箱（Sanyo，日本）；酶聯免疫檢測儀（Thermo MK3，美國）；紫外分光光度儀（Bio-Rad 美國）；高分辨透射電子顯微鏡（JEM-2100，日本）。

二、實驗方法

1.制備納米級淡水珍珠粉

將微米級淡水珍珠粉與無水乙醇以重量體積比（g/ml）約為1：15的比例在砂磨機中研磨2h，干燥，利用透射電子顯微鏡觀測珍珠粉的粒徑。

2.制備樣品浸提液

納米珍珠粉-DMEM培養(yǎng)液浸提液制備：將納米珍珠粉浸在DMEM培養(yǎng)液（10%胎牛血清）中，樣品重量與浸提液的體積按0.2g/ml計算，37℃恒溫箱中浸提 24h，離心（3500rpm，10min），吸取上清液，0.22μm過濾器過濾除菌，配制成100%、50%、25%、12.5%濃度的材料浸提液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

納米珍珠粉-生理鹽水浸提液制備：將納米珍珠粉浸在生理鹽水中，樣品重量與浸提液的體積按0.2g/ml計算，37℃恒溫箱中浸提72h。

3.細胞毒性實驗

方法：0.25%胰酶消化L929細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調整細胞密度為4×104個/mL，取96孔培養(yǎng)板，每孔加入200μL細胞懸液，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)板內舊培養(yǎng)液，實驗組分四個濃度組，各組每孔分別加入100%、50%、25%、12.5%的納米珍珠粉-DMEM培養(yǎng)液浸提液200μL，并設空白對照組（200μL，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液）和陽性對照組（200μL，0.64%苯酚），每組各8個復孔，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，加人 5mg/ml的MTT溶液20μL，于5%C02、37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸除原液，再加入150μL/孔二甲基亞砜（DMSO），室溫下在96孔微震搖器上震蕩l0min，待藍紫色結晶溶出后，使用酶聯免疫檢測儀測定490nm OD值，根據各組OD值計算各實驗組細胞相對增殖率（relative growth rate，RGR）。RGR＝實驗組或陽性對照組的平均OD值/陰性對照組的平均OD值×l00%。

材料細胞毒性判斷標準：0級為≥100%，1級為75%～99%，2級為 50%～74%，3級為 25%～49%，4級為1%～24%，5級為0。

4.溶血試驗

方法：取健康成年人肘部靜脈血10mL，加入到含有抗凝肝素鈉的試管中，制備新鮮抗凝血，取8mL，加生理鹽水10mL稀釋備用。實驗分為3組，每組取3個試管，每組各管分別加入納米珍珠粉生理鹽水浸提液10mL（實驗組）、同批號生理鹽水10mL（陰性對照組）和蒸餾水10mL（陽性對照組）。全部試管放入37℃恒溫箱中30min后，每管加稀釋血0.2mL，輕輕混勻，置37℃恒溫箱中繼續(xù)保溫60min。2500rpm離心5min，取每管上清液，分光光度儀測取545nm處的OD值，取平均值計算溶血率（hemolysis rate，HR）。HR＝（實驗組OD值-陰性對照組OD值）/（陽性對照組OD值-陰性對照組OD值）×100%。

結果評定：若HR＞5%，則表示材料有溶血作用；若HR＜5%，說明材料符合生物材料的溶血試驗要求。

5.皮內刺激試驗

方法：取新西蘭白兔3只，在每只兔脊柱兩側各作8個點皮內注射，每側相鄰點間隔約2cm，其中左側每個點注射0.2ml珍珠粉生理鹽水浸提液，右側每個點注射0.2ml生理鹽水作為對照，注射后即刻，4h、24h、48h和72h觀察記錄各注射部位狀況。

評分：按皮膚反應評分系統(tǒng)對每個注射部位的紅斑和水腫組織反應進行評分，計算局部原發(fā)刺激指數（primarily stimulation index，PII）。

6.急性全身毒性試驗

方法：選用體重180g～220g雌性SD大鼠16只，隨機分為2組，每組8只，分籠飼養(yǎng)，各組大鼠標記編號，稱重。每只大鼠腹腔內按20mL/kg劑量，實驗組注射納米珍珠粉生理鹽水浸提液，對照組注射生理鹽水。

結果觀察：注射后24h、48h和72h觀察記錄所有SD大鼠的進食、活動及有無死亡等一般狀況，并對每只大鼠進行稱重。7d后，頸椎脫臼法處死動物，解剖暴露腹腔，觀察大鼠腹腔有無粘連，取動物肝、脾、腎臟行組織學檢查。

結 果

1.研磨后珍珠粉粒徑的透射電鏡觀測

研磨后珍珠粉的透射電鏡圖可以看出，珍珠粉顆粒形態(tài)多樣，顆粒間有團聚，顆粒大小不均，但是基本都在100nm以下（圖1）。使用Nano Measurer 1.2軟件對珍珠粉透射電鏡圖片中的顆粒（至少200個）進行測量，顆粒粒徑以近似等效圓形的直徑進行估算。用SPSS 17.0對珍珠粉粒徑進行單樣本K-S檢驗，P＜0.05，即珍珠粉粒徑分布不屬于正態(tài)分布，它的算術平均粒徑為37.45nm，中位數為34.72nm，極大值為83.65nm。按照我國和歐盟對納米材料的要求[7，8]，研磨后的珍珠粉顆粒平均粒徑小于100nm，符合納米材料的標準。

圖1 研磨后的珍珠粉透射電鏡觀察

2.細胞毒性實驗

表1為加樣3d后各組平均OD值、相對增殖率、細胞毒性等級，從表可以看出，納米珍珠粉浸提液各濃度組細胞增殖率都小于陰性對照組，濃度越高增殖率越低，但各實驗組細胞毒性均在I級，符合國家醫(yī)用生物材料的細胞毒性要求。利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，將各組OD值進行單因素方差分析，結果顯示，納米珍珠粉各濃度組與陰性對照組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＝0＜O.05）。

表1 納米珍珠粉對L929細胞增殖的影響及細胞毒性

3.溶血試驗

實驗組及陰性對照組各管離心后上層均為清亮無色液體，下層為紅細胞沉淀物；陽性對照組各管離心后，上層液體為紅色。實驗組的溶血率為1.01%。該材料的溶血率小于5%，符合組織工程材料溶血試驗要求。

4.皮內刺激試驗

將納米珍珠粉浸提液注射于兔背部皮內后，4h時各注射部位皮丘消失，可見個別注射后靜脈創(chuàng)傷淤血點，其余無異常。在24h、48h、72h各觀察時間點注射部位皮膚無紅斑和水腫表現，按GB/T 16886皮膚反應評分系統(tǒng)，PII為0，屬于無刺激反應類型，表明納米珍珠粉浸提液不引起皮內刺激反應。

5.急性全身毒性試驗

將納米珍珠粉浸提液經SD大鼠腹腔注射后，1w內所有大鼠活動未見異常，進食正常，未見嘔吐、腹瀉，大便無異常，無驚厥、癱瘓和死亡等見毒性表現。于24h、48h、72h稱重，所有的大鼠體重都有不同程度增加，隨時間延長呈增長趨勢（表2），經SPSS 17.0統(tǒng)計分析，將實驗組和對照組各時間段體量增加量進行t檢驗，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。7d后解剖觀察所有大鼠腹腔內無積液、無粘連，內臟無充血、水腫、結節(jié)形成，肝、脾、腎大體觀察和組織學檢查未見異常。

表2 急性全身毒性試驗中大鼠體量增加結果（±s，n=8，單位：g）

表2 急性全身毒性試驗中大鼠體量增加結果（±s，n=8，單位：g）

實驗組和對照組各時間點比較：AP＝0.462＞0.05；BP＝0.651＞0.05；CP＝0.148＞0.05

組別 動物數 觀察時間（h）24hA 48hB 72hC實驗組對照組8 8 3.37±1.39 3.61±0.43 6.14±2.16 6.69±1.08 9.56±2.44 9.73±1.81

討 論

體外細胞毒性試驗可以評價醫(yī)療器械和生物材料是否存在潛在性的致細胞毒性反應。L929細胞，來自永生細胞系小鼠成纖維細胞，是國際公認的應用于體外細胞毒性實驗評價的細胞系[9]。本研究中體外細胞毒性試驗研究納米珍珠粉-DMEM培養(yǎng)液浸提液對L929細胞的影響，結果顯示，與陰性對照組相比，浸提液對L929細胞增殖有一定抑制作用，這可能是納米珍珠粉中碳酸鈣顆粒吸附了培養(yǎng)基中的一些有效成份而導致細胞缺乏營養(yǎng)和增殖抑制[10～12]；碳酸鈣微溶于水，PH值變化對細胞會有不同程度的影響，此外，培養(yǎng)基中的一些懸浮納米碳酸鈣粒子可以通過氧化損傷細胞[10，12，13]。由于細胞受溫度、滲透壓、酸堿度、營養(yǎng)成分等多方面因素的影響，確切原因還有待進一步研究?？傊?，經球磨制備的納米珍珠粉表現為輕微的細胞毒性，根據GBT/ISO標準仍可認為其為合格材料。

體外溶血試驗是將材料或浸提液與紅細胞接觸，通過測定溶液中的血紅蛋白量反映紅細胞破壞程度，血紅蛋白量升高，反映出紅細胞在與材料和器械接觸中細胞膜的易破裂性。本研究中0.2g/ml納米珍珠粉浸提液的溶血率為1.01%，遠低于國際標準要求的溶血率小于5%，符合GBT/ISO血液相容性標準，可以認為該材料無毒。

皮內反應試驗是通過皮內注射材料浸提液，對材料產生刺激反應的潛在性做出評價。本研究中在將納米珍珠粉鹽水浸提液及對照組鹽水分別注射于家兔背部，各觀察期皮膚無水腫和紅斑，皮內反應指數為0，根據GBT/ISO標準，可以認為試驗材料無刺激作用。

急性全身毒性試驗是指24h內一次或多次大劑量給予機體后造成機體全身代謝的毒性反應，從而評價材料對生物體的急性毒性作用。本實驗是將納米珍珠粉浸提液按大鼠的最大劑量20ml/kg體積重量比進行腹腔注射，實驗組和對照組大鼠都無中毒癥狀及不良反應，沒有發(fā)生死亡現象，各觀察時間點所有動物體重都有不同程度增加，隨著時間延長，不斷增加。腹腔探查及內臟組織病理檢查無異常，根據GBT/ISO標準，可以認為納米珍珠粉浸提液體內無急性毒性作用。

通過上述的細胞毒性試驗、溶血試驗、皮內刺激試驗和急性毒性試驗的結果，表明實驗材料符合國家生物醫(yī)學實驗評價標準。因此，可以認為納米珍珠粉具有一定的生物相容性，有必要對該材料在動物和人體中的生物學性質進行進一步研究。