UPLC-MS/MS檢測馬兜鈴屬藥材中4種馬兜鈴酸的含量

上海佰年詩丹德技術(shù)有限公司，上海 201203

馬兜鈴酸(Aristolochic acid，AA)為硝基菲類化合物，主要存在于馬兜鈴屬和細(xì)辛屬植物中。近年來，文獻(xiàn)報(bào)道馬兜鈴酸的腎毒性及致癌作用引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視[1-8]。2002年，世界衛(wèi)生組織(WHO)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將馬兜鈴酸列為一種潛在的致癌物質(zhì)，2012年將其列為Ⅰ類致癌物[3]。2003 年以來，我國藥品監(jiān)管部門先后取消了青木香、關(guān)木通、廣防己等含馬兜鈴酸藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并對其他含馬兜鈴酸的藥材如朱砂蓮、天仙藤、馬兜鈴、尋骨風(fēng)等采取了加強(qiáng)監(jiān)管、修訂說明書或質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等措施，以控制其安全性風(fēng)險(xiǎn)。2017年10月18日《Science Translational Medicine》以封面文章的形式刊登了一篇名為“馬兜鈴酸及其衍生物與臺(tái)灣及亞洲地區(qū)肝癌廣泛相關(guān)”[9]的文章，提示馬兜鈴酸與肝癌也有很強(qiáng)的相關(guān)性，再次將馬兜鈴酸推至輿論的風(fēng)口浪尖。

在我國尚有含馬兜鈴酸的藥物上市銷售。對含此類成分的藥材進(jìn)行合理有效的控制是保證人民用藥安全的重要手段。本文采用UPLC-MS/MS法對馬兜鈴、青木香、天仙藤、朱砂蓮、尋骨風(fēng)5種馬兜鈴屬藥材中馬兜鈴酸A、B、C、D的含量進(jìn)行了測定。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1290 超高效液相-G6460三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫科技公司)；離心機(jī)(美國賽默飛世爾科技公司)；超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 馬兜鈴酸A、B、C、D、金合歡素(純度98%以上，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司)；甲醇(HPLC級(jí)，美國賽默飛世爾科技公司) ；乙酸(HPLC級(jí)，美國西格瑪公司)；甲醇(分析純，上海泰坦科技股份有限公司)；馬兜鈴、青木香、天仙藤、朱砂蓮、尋骨風(fēng)購自各藥材公司，經(jīng)我公司劉倩博士鑒定，馬兜鈴為馬兜鈴屬北馬兜鈴(AristolochiacontortaBge)的果實(shí)，青木香為馬兜鈴科植物馬兜鈴(AristolochiadebilisSieb. et Zucc.) 的干燥根，天仙藤為北馬兜鈴(AristolochiacontortaBge.)的干燥地上部分，朱砂蓮為四川朱砂蓮 (AristolochiacinnabarinaC.Y.Cheng et J.L.Wu) 的干燥塊根，尋骨風(fēng)為馬兜鈴科植物綿毛馬兜鈴(AristolochiamollissimaHance)的地上部份。水為超純水。

表1 不同品種藥材飲片信息

表1 不同品種藥材飲片信息

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件 Agilent Zorbax Extend C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：65%甲醇-0.01%乙酸水溶液；流速：0.40 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。電噴霧離子源(ESI)，檢測模式：正離子檢測；MRM模式：馬兜鈴酸A：m/z 359.1→298.1，定性離子對m/z 359.1→324.1；馬兜鈴酸B：m/z 329.0→268.0，定性離子對m/z 329.0→294.1；馬兜鈴酸C：m/z 345.2→282.0，定性離子對m/z 345.2→310.0；馬兜鈴酸D：m/z 375.0→312.0，定性離子對m/z 375.0→296.9；內(nèi)標(biāo)金合歡素：m/z 285.0→242.0，定性離子對：m/z 285.0→152.1，干燥氣流速：5 L/min；霧化氣壓力：45 psi；鞘氣溫度：400 ℃；鞘氣流速：11 L/min。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取馬兜鈴酸A、B、C、D對照品，加甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.12、0.11、0.13、0.12 mg/mL的對照品儲(chǔ)備液，4 ℃保存，備用。

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的制備精密稱取金合歡素對照品適量，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.013 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，4 ℃保存，備用。

2.4 供試品溶液的制備 精密稱取藥材1.0 g，加入10 mL70%甲醇溶液，浸潤15 min，超聲提取30 min，3500 rpm離心10 min，分離上清液，向殘?jiān)屑尤?0 mL70%甲醇溶液，超聲提取30 min，3500 rpm離心10 min，合并兩次上清液，定容于50 mL容量瓶中。取供試品溶液500 μL，加入內(nèi)標(biāo)10 μL，甲醇490 μL，混勻，0.22 μm微孔濾膜過濾。UPLC-MS/MS檢測。對照品及樣品的MRM模式圖見圖2。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系 分別精密吸取對照品儲(chǔ)備液5、10、20、100、500、1000 μL，加入甲醇定容至5 mL容量瓶中，搖勻，制得系列混合對照品溶液。取各濃度對照品溶液500 μL，加入內(nèi)標(biāo)10 μL，甲醇490 μL，混勻， 0.22 μm微孔濾膜過濾，UPLC-MS/MS檢測，分別以馬兜鈴酸A、B、C、D峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)對各對照品濃度(X)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，馬兜鈴酸A的回歸方程為y=1.5803x+0.6644，r= 0.9967，在0.06～12 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；馬兜鈴酸B的回歸方程為y= 1.4476x+0.1844，r= 0.9980，在0.055～11 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；馬兜鈴酸C的回歸方程為y= 1.4451x+0.3561，r= 0.9969，在0.065～13 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；馬兜鈴酸D的回歸方程為y=2.0126x+0.1115，r=0.9982，在0.06～12 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按信噪比(S/N)為10計(jì)算馬兜鈴酸A、B、C、D的定量限分別為6×10-5、2.2×10-4、2.1×10-4、2.2×10-4ng，按信噪比(S/N)為3計(jì)算馬兜鈴酸A、B、C、D的檢測限分別為1.2×10-4、4.4×10-4、4.2×10-4、4.4×10-4ng。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取馬兜鈴藥材粉末1.0 g，按照2.4 項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，按 2.1 項(xiàng)下條件測定，連續(xù)進(jìn)樣測定 6 次，并記錄馬兜鈴酸A、B、C、D的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比。結(jié)果RSD分別為2.41%、2.07%、2.84%、2.71%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2. 5. 2項(xiàng)下制備的供試品溶液，在0、1、2、4、8、12、24 h 按照2. 1 項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算馬兜鈴酸A、B、C、D的含量。結(jié)果其含量的RSD分別為3.77%、4.01%、4.39%、4.85%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次馬兜鈴藥材粉末 6份，按照 2.4 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按 2.1 項(xiàng)下條件測定，計(jì)算馬兜鈴酸A、B、C、D的含量。結(jié)果RSD分別為2.67%、4.25%、3.13%、3.98%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2. 5. 5 加樣回收率試驗(yàn)取已知含量樣品 (MDL04) 6份，精密稱取0.5 g，分別加入一定質(zhì)量的馬兜鈴酸A、B、C、D，按照2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率與RSD。馬兜鈴酸A、B、C、D的加樣回收率分別為89.95%、92.06%、91.06%、92.18%，RSD分別為3.88%、3.97%、4.79%、4.76%。見表2。

2. 6 樣品測定取各藥材樣品適量，粉碎，按照2.4 項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，以 2.1 項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算中藥材中馬兜鈴酸A、B、C、D的含量，結(jié)果見表3。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

表3 五種藥材中馬兜鈴酸A、B、C、D的含量 (n=3,μg·g-1)

續(xù)表 表3 五種藥材中馬兜鈴酸A、B、C、D的含量 (n=3,μg·g-1)

注：“-”表示未檢測到。

3 討論

2015版藥典[10]中規(guī)定，天仙藤中馬兜鈴酸A的含量不得超過0.01%，細(xì)辛中馬兜鈴酸A的含量不得超過0.001%，馬兜鈴僅作了薄層鑒別，不能有效控制藥材的質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸-DNA加合物(AA-DNA加合物)的形成是馬兜鈴酸致癌及致突變的重要原因[11-13]，可能也參與了馬兜鈴酸腎病的發(fā)病過程[14]。本研究在對馬兜鈴、天仙藤、青木香、朱砂蓮等來源于馬兜鈴屬的藥材進(jìn)行馬兜鈴酸-DNA加合物研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，除了被廣泛研究的馬兜鈴酸A、B以外，還有一種馬兜鈴酸成分也能形成DNA加合物，即馬兜鈴酸D。在隨后進(jìn)行的Ames波動(dòng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸A、B均具有致突變作用，且馬兜鈴酸B的致突變作用強(qiáng)于馬兜鈴酸A。另外馬兜鈴酸D也很可能是馬兜鈴酸中具有遺傳毒性的成分[15-16]。馬兜鈴酸C在該試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)致突變作用。

本研究對馬兜鈴屬5種藥材中馬兜鈴酸A、B、C、D的含量進(jìn)行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬兜鈴、青木香、天仙藤、朱砂蓮、尋骨風(fēng)中均含馬兜鈴酸A、B、C、D。馬兜鈴中馬兜鈴酸A、B、C、D的含量都比較高，其中馬兜鈴酸A的含量最高；相對于馬兜鈴酸B、C、D，青木香、尋骨風(fēng)中馬兜鈴酸A的含量較高；天仙藤中馬兜鈴酸D的含量較高，明顯高于其他四種藥材，朱砂蓮中馬兜鈴酸A、B、C、D的含量均較低。五種藥材中馬兜鈴所含四種馬兜鈴酸的總量最高。分析Ames波動(dòng)試驗(yàn)中呈陽性結(jié)果的馬兜鈴酸A、B、D在五種藥材中的含量，目前研究較多的馬兜鈴酸A在青木香中含量最高(最高為146.98 μg/g)，其次為馬兜鈴，尋骨風(fēng)，天仙藤、朱砂蓮中含量較低；馬兜鈴酸B在馬兜鈴、青木香的含量相對較高，但明顯低于同一藥材中馬兜鈴酸A的含量； 五種藥材中馬兜鈴酸D含量最高的是天仙藤，最高者達(dá)到161.50 μg/g，其次為馬兜鈴?？梢婑R兜鈴酸A、B、D在五種藥材中的含量有較大差別，以上結(jié)果提示我們僅檢測馬兜鈴酸A的含量是不夠的，不能保證臨床用藥安全。

實(shí)驗(yàn)過程中四種馬兜鈴酸對照品的質(zhì)譜行為進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，馬兜鈴酸A一級(jí)質(zhì)譜為m/z 705.1[2M+Na]+，m/z 359.1[M+NH4]+， m/z 364.1[M+Na]+，以及較低的m/z 342.1[M+H]+，產(chǎn)物離子為m/z 298.1[M+H-CO2]+，及m/z 324.1[M+H-H2O]+；馬兜鈴酸B一級(jí)質(zhì)譜為m/z 645.1[2M+Na]+，m/z 329.1[M+NH4]+，m/z 334[M+Na]+，以及較低的m/z 312.1[M+H]+，產(chǎn)物離子為m/z 267.9[M+H-CO2]+，及m/z 294.1[M+H-H2O]+，與文獻(xiàn)報(bào)道[17]一致；馬兜鈴酸C一級(jí)質(zhì)譜為m/z 677.0[2M+Na]+，m/z 345.2[M+NH4]+，以及較低的m/z 328.1[M+H]+，產(chǎn)物離子為m/z 282.0[M+H-CO-H2O]+，m/z 310.0[M+H-H2O]+及m/z 237.1[M+H-H2O—CO-NO2]+；馬兜鈴酸D一級(jí)質(zhì)譜為m/z 737.1[2M+Na]+，m/z 375.2[M+NH4]+，以及較低的m/z 358.1[M+H]+，產(chǎn)物離子為m/z 312.0[M+H-CO-H2O]+，m/z 296.9[M+H-CH3-NO2]+。

負(fù)離子模式下，馬兜鈴酸A一級(jí)質(zhì)譜為m/z 340.1[M-H]-，m/z 703.0[2M+Na-2H]-，產(chǎn)物離子為m/z 266.0，為[M-H]-脫掉CO2及甲氧基得到的離子；馬兜鈴酸B一級(jí)質(zhì)譜為m/z 310.2[M-H]-，m/z 643.2[2M+Na-2H]-，產(chǎn)物離子為m/z 265.7[M-H-CO2]-；馬兜鈴酸C一級(jí)質(zhì)譜為m/z 326.2[M-H]-，m/z 653.2[2M-H]-，產(chǎn)物離子為m/z 235.9[M-H--H2O-CO-NO2]-；馬兜鈴酸D一級(jí)質(zhì)譜為m/z 356.1[M-H]-，m/z 713.1[2M-H]-，產(chǎn)物離子為m/z 266.1[M-H--H2O-CO-NO2]-,及 m/z 235.9，為m/z 266.1脫掉甲氧基得到的離子。

馬兜鈴酸A、B、C、D在正負(fù)離子模式下均有響應(yīng)。其中馬兜鈴酸A、B在正離子模式下響應(yīng)較高，馬兜鈴酸C、D在負(fù)離子模式下響應(yīng)相對較高，這是由于在馬兜鈴酸C、D結(jié)構(gòu)中引入了羥基，使得它們在負(fù)離子模式下有更好的響應(yīng)。由于在檢測中對質(zhì)譜進(jìn)行正負(fù)離子切換會(huì)降低靈敏度，且對儀器損耗較大，而馬兜鈴酸C、D在正離子模式下也有較好的響應(yīng)，因此選擇采用正離子模式檢測。

近年來，馬兜鈴酸類成分的安全性受到廣泛關(guān)注。李功勛等[18]利用UPLC-QQQ-MS對不同種類藥材中馬兜鈴酸Ⅰ的含量進(jìn)行了測定，但只測定了一種成分含量，不能有效控制藥材質(zhì)量；路軍章等[19]建立HPLC-MS同時(shí)檢測馬兜鈴中6種馬兜鈴酸類成分的方法，質(zhì)譜采用ESI負(fù)離子模式和選擇性離子掃描(SIM)，檢測時(shí)間為60min。檢測時(shí)間較長，質(zhì)譜的SIM模式與MRM模式相比，后者靈敏度更高；本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，多反應(yīng)監(jiān)測模式，正離子檢測對五種馬兜鈴屬藥材中的馬兜鈴酸A、B、C、D的含量進(jìn)行了測定，5分鐘內(nèi)可完成檢測。與已有方法相比，本方法快速，靈敏度高，為含馬兜鈴酸藥材的質(zhì)量控制提供參考。