益骨湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

李桂錦 姚新苗

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院 浙江 杭州 310005

WNT10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4、DKK1表達(dá)水平的變化，探討益骨湯治療骨質(zhì)疏松的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：采用SPF級(jí)12周齡雌性SD大鼠100只，體重200±10g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)20080016，用于造模。

1.2 主要試劑與儀器：益骨口服液（方由補(bǔ)骨脂10g，骨碎補(bǔ)、生地、仙靈脾、懷山藥各15g，丹參30g組成），由浙江省中醫(yī)院中藥房提供，制成含生藥量1.0g/ml的水提液，用于去勢(shì)大鼠灌胃治療）；倍美力水溶液：美國(guó)惠氏艾爾斯特制藥公司艾爾斯特藥廠制造,產(chǎn)品批號(hào)0502090,國(guó)藥準(zhǔn)字(2001)J51(2)號(hào)。水溶液濃度為9.4μg/ml。氯氨酮：上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號(hào)滬衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1995)第001064號(hào)；DKK1反義寡核苷酸序列如下：5′-TCTGGTCCAAGATCTGAT-3′由上海生物工程合成；WNT10b、β-catenin、BMP2、BMP4、DKK1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(R&D Systems美國(guó))；WNT10b、βcatenin、BMP-2、BMP-4、DKK1的PCR引物（艾菲生物技術(shù)有限公司）；PCR儀（BIO-RAD 美國(guó)）；紫外分析圖像處理儀（上海天能科技有限公司）；電泳儀（BIO-RAD 美國(guó)）；半自動(dòng)生化分析儀(上海三科儀器有限公司)；紫外分光光度計(jì)（Eppendorf 德國(guó)）；海爾冰箱（青島海爾股份有限公司）；液氮容器（樂(lè)山市東亞機(jī)電工貿(mào)有限公司）；雙能X線骨密度儀（型號(hào)：DPX-L美國(guó)LUNAR公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組：隨機(jī)分為A組(假手術(shù)組)、B組(益骨湯治療組)、C組(倍美力陽(yáng)性對(duì)照組)、D組(正常對(duì)照組)、E組（DKK-1反義寡核苷酸對(duì)照組）5組,分16籠以常規(guī)飼料喂養(yǎng),自由飲水。飼養(yǎng)室保持良好通風(fēng),室溫控制在21±1℃,濕度63%,噪音＜55分貝,自由攝食、飲水,光照與黑暗時(shí)間為每12h交替。

1.4 動(dòng)物造模：大鼠采用氯胺酮按0.1g/kg進(jìn)行腹腔麻醉,然后打開(kāi)B、C、D、E組大鼠腹腔,去除雙側(cè)卵巢,逐層縫合；A組大鼠僅予以單純剖腹后立即關(guān)閉。術(shù)后予以青霉素肌注預(yù)防感染，按4萬(wàn)U/只/d，持續(xù)3d。

1.5 飼養(yǎng)與給藥：造模術(shù)后將SD大鼠分16籠予以常規(guī)飼料喂養(yǎng)12周,第13周起開(kāi)始每天給藥,A、D組以蒸餾水10ml/kg灌胃；B組以10ml/kg的益骨湯水提液灌胃；C組以濃度為9.4μg/ml倍美力水溶液10ml/kg灌胃,整個(gè)灌胃過(guò)程持續(xù)12周；E組予以DKK1反義寡核苷酸腹膜內(nèi)注射20μg/kg/d，持續(xù)12周。

1.6 股骨骨密度檢測(cè)：取大鼠股骨，剔除周圍的肌肉，密封保存標(biāo)本于－20℃冰箱內(nèi)，采用雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)軟件，測(cè)量每只大鼠股骨BMD，取平均值，BMD值用g/cm2表示。

1.7 Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)目的基因的提取、檢測(cè)：采用Trizol法提取組織總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定各組提取的總RNA濃度。

表1 各基因引物序列

1.8 WNT10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4、DKK1 mRNA的表達(dá)：根據(jù)NCBI網(wǎng)站GeneBank查詢目的基因WNT10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4、DKK1 mRNA序列，引物合成使用Primer Premier 5．0軟件，序列見(jiàn)表1。RNA定量后反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,用熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR總反應(yīng)體系（25μl）為：加入TaqcDNA聚合酶1μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液4μl，dNTP 2μl，上下游引物各0.5μl，cDNA產(chǎn)物5μl和滅菌水12μl，按照各目的基因退火溫度選擇三步法完成擴(kuò)增，循環(huán)45次。根據(jù)熔解曲線判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，由所得的循環(huán)閾值(Ct)，根據(jù) 2-△△Ct法分別計(jì)算目的基因 DKK1、βcatenin在各組中的表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，各組數(shù)據(jù)的兩兩比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊性采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組骨密度比較：與A組比較，D組骨密度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明造模成功；B組、C組、E組的骨密度均明顯高于D組(正常對(duì)照組)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；B組的骨密度與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組去勢(shì)大鼠右股骨上端骨密度結(jié)果比較（-x±s）

2.2 各組大鼠 WNT10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4、DKK1蛋白含量比較：與D組比較，B組、C組、E組WNT10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4蛋白光密度增加，DKK1蛋白光密度減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；B組DKK1蛋白光密度與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；E組WNT10b蛋白光密度低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠成骨細(xì)胞5組蛋白光密度的變化（-x±s）

2.3 mRNA水平檢測(cè)：各組Wnt10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4、DKK1相對(duì)表達(dá)水平的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線分析表明，各基因的熒光定量RT-PCR均為特異性擴(kuò)增。同時(shí)，熒光定量RT-PCR產(chǎn)物的溶解曲線分析也表明，各基因的熒光定量RT-PCR均為單一的溶解峰。以正常對(duì)照組作為校驗(yàn)樣本，以β-catenin作為參照基因，用2-△△CT方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量，D 組的 WNT10b、βcatenin、BMP-2、BMP-4的表達(dá)量低于A組（偽去勢(shì)組），而DKK1的表達(dá)量明顯高于偽去勢(shì)組，說(shuō)明去除大鼠卵巢，可以使DKK1過(guò)度表達(dá)；而B(niǎo)組的WNT10b、βcatenin、BMP-2、BMP-4的表達(dá)量高于A組，DKK1的表達(dá)量低于A組。見(jiàn)圖1。

圖1 各組Wnt10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4、DKK1基因表達(dá)分析

3 討論

中醫(yī)學(xué)無(wú)“骨質(zhì)疏松”病名，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)學(xué)中“骨痿”“骨枯”“骨痹”等范疇，認(rèn)為病變?cè)诠?，其本在腎，其病性多虛多瘀、本虛標(biāo)實(shí)。補(bǔ)腎活血法體現(xiàn)中醫(yī)標(biāo)本兼顧的思想，是治療骨質(zhì)疏松的主要治法。益骨湯是姚新苗教授根據(jù)補(bǔ)腎活血的治療方法，并結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)提煉的治療骨質(zhì)疏松癥驗(yàn)方，由補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、生地、仙靈脾、懷山藥、丹參等6味中藥配伍而成。方中補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)為君藥,補(bǔ)腎填精,強(qiáng)壯筋骨；生地、仙靈脾補(bǔ)腎滋陰；脾為后天之源，脾主肌肉，取懷山藥為臣藥；因久病必瘀，而致疼痛，以丹參活血化瘀。

近年來(lái)研究認(rèn)為，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)理主要為絕經(jīng)后雌激素水平降低改變了成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的功能、數(shù)量、壽命，從而影響骨形成、骨吸收偶聯(lián)，進(jìn)而導(dǎo)致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的形成[1]，骨重建使人體的骨代謝保持在動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。骨重建包括破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收以及成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成[2]。如骨吸收超過(guò)了骨形成的代償，就會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。因此治療骨質(zhì)疏松可以從促進(jìn)成骨細(xì)胞及抑制破骨細(xì)胞兩方面著手。成骨細(xì)胞能夠促進(jìn)骨組織的發(fā)育、形成和重建，同時(shí)加強(qiáng)骨質(zhì)量及骨強(qiáng)度。研究認(rèn)為多種信號(hào)通路均能影響成骨細(xì)胞增殖，而其中經(jīng)典WNT信號(hào)通路、BMP-2通路活化與促成骨細(xì)胞增殖是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。WNT信號(hào)通路中βcatenin、WNT10b蛋白與OP的發(fā)生密切相關(guān)[3]，WNT10b基因缺失小鼠其成骨細(xì)胞數(shù)量及活性顯著下降，并導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[4]，β-catenin經(jīng)過(guò)WNT/LRP5/βcatenin/TCF/LEF級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程促使下游成骨靶基因的表達(dá)[5]，DKK1是經(jīng)典WNT信號(hào)通路的抑制劑,能特異性的抑制經(jīng)典WNT/β-catenin信號(hào)通路[6]。研究[7]證實(shí)BMP信號(hào)通路能調(diào)控成骨細(xì)胞生命周期的各個(gè)方面。BMP家族中BMP-2是促進(jìn)骨形成和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化重要的細(xì)胞外信號(hào)分子之一，有研究[8]表明BMP-4參與骨修復(fù)過(guò)程,是其他骨局部生長(zhǎng)因子發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的必需因子。

本研究通過(guò)骨密度測(cè)定結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)B組、C組、E組成骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加，高于正常對(duì)照組。而B(niǎo)組又明顯高于其他對(duì)照組，從以上結(jié)果可以確定益骨湯、DKK-1反義寡核苷酸能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、增殖，加速骨形成，從而治療骨質(zhì)疏松癥。蛋白測(cè)定及PCR結(jié)果顯示B組、E組對(duì)WNT10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4表達(dá)比D組明顯上調(diào)（P＜0.05），且B組4基因的表達(dá)明顯高于其他組；而B(niǎo)組DKK1的表達(dá)比D組明顯下調(diào)（P＜0.05）；此結(jié)果說(shuō)明益骨湯能夠促進(jìn)WNT10b、βcatenin、BMP-2、BMP-4基因表達(dá)上調(diào)，可以抑制DKK1在成骨細(xì)胞增殖中的過(guò)度表達(dá)，從而推斷，益骨湯促骨質(zhì)疏松成骨細(xì)胞增殖機(jī)制與上調(diào)WNT10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4在成骨細(xì)胞的表達(dá)，抑制DKK1過(guò)度表達(dá)有關(guān)。益骨湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)經(jīng)典WNT信號(hào)通路和BMP-2信號(hào)通路的相互關(guān)系，來(lái)實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖，但其具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

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