烏藥提取物對(duì)伴刀豆凝集素A致免疫性肝損傷小鼠保護(hù)作用的研究

潘建強(qiáng) 彭 昕

1 浙江省德清縣人民醫(yī)院 浙江 德清 313200

2 浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校 浙江 寧波 315100

免疫性肝損傷是由免疫反應(yīng)介導(dǎo)的肝實(shí)質(zhì)炎癥性病變，其重要特征是血清自身抗體陽(yáng)性，肝組織內(nèi)有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，從而導(dǎo)致肝臟損傷。免疫性肝損傷是肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等肝臟疾病轉(zhuǎn)歸和發(fā)生發(fā)展的誘發(fā)因素。因此，積極治療免疫性肝損傷有著十分重要的意義。烏藥是一味具有行氣止痛、溫腎散寒功效的傳統(tǒng)中藥，近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，烏藥提取物可減輕急性酒精性肝損傷[1-2]。本文利用伴刀豆凝集素A（ConA）所致小鼠免疫性肝損傷模型，探討其對(duì)免疫性肝損傷的潛在功效，為拓展其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑：聯(lián)苯雙酯滴丸購(gòu)自浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠；伴刀豆凝集素A（ConA）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、考馬斯亮藍(lán)試劑盒、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自寧波航景生物科技有限公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自碧云天生物科技公司；腫瘤壞死因子（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：60只昆明種雄性SPF級(jí)小鼠，鼠齡7～8周，體重18±3g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。每日12h照明，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。保持飼養(yǎng)室溫、濕度分別為：25±2℃、（55±5）%。

1.3 藥品制備：烏藥藥材由浙江省天臺(tái)山烏藥生物工程有限公司提供，經(jīng)鑒定為樟科（Lauraceae）山胡椒屬（Lindera）植物烏藥Lindera aggregate（Sims）Kosterm的干燥塊根。將干燥烏藥藥材粉碎，稱取10g，分別用200、100ml的80%乙醇超聲提取2次，每次60min，合并兩次提取液，減壓旋轉(zhuǎn)濃縮至20ml，使提取液的濃度按生藥計(jì)為0.5g/ml。小鼠灌胃量10、5、1ml/kg則分別制得高、中、低劑量（按生藥計(jì)為5.0、2.5、0.5g/kg）。給藥劑量參考成人臨床常規(guī)用量確定。

1.4 分組與給藥：60只小鼠按每組10只，隨機(jī)分為6組，Ⅰ組為對(duì)照組（空白），Ⅱ組為肝損傷模型組，Ⅲ組為聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性藥物對(duì)照組，Ⅳ～Ⅵ組分別為烏藥低、中、高劑量治療組。連續(xù)給藥10天，每日1次，對(duì)照組和模型組灌胃給予等量生理鹽水，陽(yáng)性藥物組給予聯(lián)苯雙酯溶液（0.10g/kg），低、中、高劑量組分別給予相應(yīng)濃度的提取物，末次給藥后4h造模，除對(duì)照組外，其他各組小鼠尾靜脈注射ConA 25mg/kg誘導(dǎo)ConA免疫性肝損傷模型[3]。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)測(cè)定：造模8h后小鼠眼靜脈叢取血，全血在4℃、5000r/min，離心5min，取上層血清置4℃貯存?zhèn)溆?，檢測(cè)血清中ALT、AST、TNF-α活性。摘眼球取血后處死小鼠，并迅速分離肝、脾，稱取質(zhì)量，計(jì)算小鼠的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)。小鼠肝臟指數(shù)=（肝質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%，小鼠脾臟指數(shù)=（脾質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%。取相同部位大小約0.3cm×0.3cm×0.3cm的肝組織，經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，HE染色，顯微鏡下比較各組病理組織的形態(tài)學(xué)變化差異；并采用比色法檢測(cè)肝組織勻漿中SOD、MDA的活性和含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)以-x±s表示結(jié)果。組間采用One-way ANOVA方差分析，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 烏藥提取物對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝臟、脾臟指數(shù)的影響：除對(duì)照組外，經(jīng)ConA誘導(dǎo)的其它各組小鼠肝臟出現(xiàn)不同程度的損傷，其中模型組的肝損傷最明顯，整肝呈現(xiàn)顆粒狀，與對(duì)照組相比，肝、脾明顯腫大，肝脾指數(shù)顯著升高（P＜0.05），其它各組的肝表面均有大小不同的壞死斑，表明造模成功。烏藥各劑量給藥組均能夠降低肝脾指數(shù)，中、高劑量組效果均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。其中高劑量組抑制肝臟指數(shù)增大的效果與陽(yáng)性藥物聯(lián)苯雙酯組相似，說(shuō)明烏藥提取物能抑制肝臟、脾臟的增大，且呈一定的劑量相關(guān)性。見表1。

2.2 烏藥提取物對(duì)小鼠急性免疫性肝損傷肝組織病理學(xué)變化的影響：HE染色可見正常組小鼠肝臟組織細(xì)胞形態(tài)正常，未見明顯病理?yè)p傷，肝索及肝血竇排列規(guī)則，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝索結(jié)構(gòu)消失，會(huì)管區(qū)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞擴(kuò)張并含有大量紅細(xì)胞，脂滴空泡，可見點(diǎn)狀壞死及小灶狀壞死。陽(yáng)性藥物組和各給藥組均能不同程度地減輕肝臟受損程度。高劑量組肝索基本呈放射狀排列，肝竇結(jié)構(gòu)較清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞腫脹及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與模型組相比有明顯改善。見圖1。

圖1 各組HE染色肝臟病理觀察（×40）

2.3 烏藥提取物對(duì)肝損傷小鼠血清相關(guān)指標(biāo)的影響：見表2。

表2 烏藥提取物對(duì)肝損傷小鼠血清相關(guān)指標(biāo)的影響（-x±s）

3 討論

ConA致小鼠肝損傷是常用的免疫性肝損傷模型。ConA主要效應(yīng)細(xì)胞有輔助性T細(xì)胞（Th）和巨噬細(xì)胞，進(jìn)入體內(nèi)后可激活肝竇內(nèi)的大量巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子直接損傷肝細(xì)胞，大量活化的T淋巴細(xì)胞可隨血流到達(dá)肝臟，或激活巨噬細(xì)胞使血管內(nèi)皮細(xì)胞被破壞，最終導(dǎo)致免疫性肝損傷[4]。MDA是自由基損傷機(jī)體不飽和脂肪酸形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量高低往往與機(jī)體和細(xì)胞的受損程度成正比。SOD是機(jī)體抗氧化體系中起重要作用的一種含金屬離子酶，可通過催化超氧自由基的歧化反應(yīng)清除活性氧自由基，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能完整性。由肝巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)多個(gè)調(diào)節(jié)免疫和炎癥過程的基因轉(zhuǎn)錄，是參與免疫性肝損傷的重要因素之一。ALT和AST是分布在肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的可溶性酶，肝臟受損后便釋放入血，因此血清ALT和AST水平高低常作為判定肝損傷程度的重要指標(biāo)。

本研究結(jié)果表明，烏藥各劑量給藥組均能夠降低肝、脾指數(shù)，中、高劑量組可使血清ALT、AST水平顯著降低，且變化趨勢(shì)與給藥濃度成正比。各劑量組的MDA和

TNF-α水平都顯著下降，高劑量組還可顯著提高SOD活性（P＜0.05），說(shuō)明其可以通過提高肝細(xì)胞中抗氧化酶活性，抑制肝細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化等來(lái)降低免疫性肝損傷小鼠氧化應(yīng)激程度，從而改善肝損傷情況。由此可見，烏藥對(duì)ConA所致的免疫性肝損傷有較好的拮抗作用，為烏藥保肝藥效的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 參考文獻(xiàn)

[1]季夢(mèng)漂，譚明明，王軍偉，等.烏藥不同提取物對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠腸推進(jìn)率的影響[J].浙江中醫(yī)雜志，2017，52（9）：700-701.

[2]陳卓亮，王軍偉，譚明明，等.烏藥水提物與醇提物對(duì)急性酒精性肝損傷模型大鼠抗氧化作用的比較研究[J].浙江中醫(yī)雜志，2015，50（6）：414-415.

[3]鄭丹丹，姜楠，胡揚(yáng)揚(yáng)，等.雙孢菇胞內(nèi)和胞外多糖對(duì)伴刀豆凝集素A誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2017，31（4）：303-310.

[4]馬靜，姚廣濤.保肝藥效篩選方法及中藥保肝的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2016，22（23）：4671-4675.