油橄欖葉提取物對酒精性肝損傷大鼠肝組織轉化生長因子-β1水平的影響*

王 昱

(隴南師范高等?？茖W校農(nóng)林技術學院，隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心， 甘肅 成縣 742500)

長期大量飲酒會導致多系統(tǒng)臟器的損害，肝臟是酒精代謝的主要器官，也是最容易受損的器官.隨著我國酒的消耗量增加，臨床所見酒精性肝病在逐年增多.研究表明，發(fā)生酒精性肝病后，可在短期內(nèi)發(fā)展為不可逆的肝損傷，肝細胞腫大壓迫肝血竇造成竇間隙變窄，使肝細胞缺氧，長時間就會導致肝細胞變性和壞死，并促進肝纖維化的發(fā)生[1-2].因此，開發(fā)并篩選對酒精性肝病有確切防治作用的中藥新藥并應用于臨床，是當前面臨的重要課題.多酚、黃酮及橄欖苦苷是油橄欖葉主要活性成分，課題組前期已證實油橄欖葉提取物在排鉛、海洛因脫毒、預防糖尿病、抗衰老、減輕缺血再灌注損傷等方面表現(xiàn)出突出的效果[3-12]，具有調(diào)節(jié)肝臟抗氧化能力、抑制脂代謝調(diào)控因子(固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白-1c)表達的作用[13-14].為進一步闡明其作用機制，本研究擬以大鼠為實驗動物建立酒精性肝損傷動物模型，探討OLE對TGF-β1信號通路的影響，以揭示OLE防治酒精性肝損傷的作用機制.

1 材料與方法

1.1 材 料

油橄欖葉提取物(隴南田園油橄欖科技開發(fā)有限公司)；TGF-β1 ELISA試劑盒(購自上海源葉生物科技公司)；兔抗TGF-β1抗體、免疫組織化學試劑盒和DAB(購自武漢博士德生物工程有限公司).

酶聯(lián)免疫檢測儀(ELx800，美國BioTek公司)；高速臺式冷凍離心機(Beckman美國TGL-16 M)等.50只健康雄性SD大鼠，SPF級，購于蘭州大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(甘)2005-0007，體質(zhì)量200～250 g.

1.2 方 法

1.2.1動物模型的建立與給藥

50只大鼠隨機分為5組，即正常組、模型組、OLE低劑量組(Ⅰ)、OLE中劑量組(Ⅱ)和OLE高劑量組(Ⅲ)，每組10只.參照文獻[15]，除正常組外，其他各組采用劑量遞增法灌胃乙醇：1—4周5.0 g/kg，5—8周7.0 g/kg，9—12周9.0 g/kg，13—24周9.5 g/kg，每日1次.造模同時，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ治療組分別用OLE灌胃250 mg/kg、500 mg/kg、1 000 mg/kg，每日1次，連續(xù)24周.

1.2.3肝組織TGF-β1蛋白含量測定

取100 mg濕肝，加入1 m L PBS緩沖液，冰浴中勻漿(10 000 r/min)20 s，重復2次，將勻漿液4 ℃(3 600 r/min)離心20 min，取上清液，ELISA試劑盒檢測.

1.2.4免疫組織化學

免疫組化SP法(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法).末次給藥后，取大鼠肝臟數(shù)塊置于4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋后冠狀位切片，厚6 μm.脫蠟、抗原修復后，用3% H2O2室溫孵育10 min，正常兔血清室溫封閉30 min，然后用兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜；次日取出切片以PBS沖洗后，再依次滴加生物素化羊抗兔IgG孵育30 min，SABC工作液孵育30 min，最后DAB顯色，蘇木素復染，陰性對照以PBS代替一抗.常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照.

1.2.5圖像分析

用美國Image-proplus 5.0 專業(yè)圖像分析軟件進行圖像分析.從TGF-β1陽性反應的切片中各選3 張，檢測活性物質(zhì)在肝臟中表達的強度.測量時保證光源的穩(wěn)定，并且取圖之前預熱20 min以上，采圖時各項設置包括光源、光圈大小、白平衡、曝光強度、敏感度、對比度等均改為手動調(diào)節(jié)且固定，以保證每次取圖系統(tǒng)的設置值一樣.取平均光密度和積分光密度兩個指標，測量值的平均值為最終灰度值.

1.2.6數(shù)據(jù)處理

2 結 果

2.1 OLE對肝損傷大鼠肝組織TGF-β1蛋白含量的影響

由圖1可知，與正常對照組相比，模型組大鼠肝組織TGF-β1蛋白含量顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ治療組肝組織TGF-β1蛋白含量顯著降低(P<0.05，P<0.01).

圖1 OLE對大鼠肝組織TGF-β1蛋白含量的影響注：同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P>0.05).下同.

2.2 OLE對肝損傷大鼠肝組織TGF-β1表達的影響

免疫組織化學顯示：TGF-β1在各實驗組大鼠肝臟中都有不同程度的陽性表達，陽性表達部位被染成棕黃色(圖2: A-E)，陰性對照組無TGF-β1陽性表達(圖2: F).與正常組相比，模型組大鼠肝臟TGF-β1的表達水平增強、陽性細胞數(shù)增加(P<0.01).各給藥組與模型組比較，大鼠肝臟TGF-β1的表達減弱、陽性細胞數(shù)減少(P<0.05，P<0.01，圖3).

3 討 論

關于酒精性肝損傷的發(fā)病機制，近年來的研究表明，細胞因子、自由基損害、脂代謝調(diào)控因子等在酒精性肝損傷發(fā)病機制中起重要作用[15].但目前，仍然缺乏有效的治療手段，采用的治療藥物大都有明顯的副作用.本實驗的研究對象—油橄欖葉，其主要活性成分是多酚、黃酮及橄欖苦苷，既往已證實油橄欖葉提取物具有良好的防治酒精性肝損傷的藥效學效應[13-14].

研究表明，TGF-β1 屬于TGF-β 超家族，對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用，也是目前公認的致纖維化的最強細胞因子[16].酒精致肝損傷時，肝枯否細胞、竇內(nèi)皮細胞以及壞死的肝細胞等通過自分泌或旁分泌方式產(chǎn)生大量TGF-β1，TGF-β1通過自身調(diào)節(jié)機制，刺激上述細胞產(chǎn)生更多的TGF-β1，形成級聯(lián)放大效應，導致大量的TGF-β1生成和激活，與細胞膜上的相應受體結合后，將信號傳遞到細胞內(nèi)，從而調(diào)節(jié)靶基因表達，導致細胞外基質(zhì)大量積聚，使肝細胞死亡、組織纖維化[17,18].因此，抑制肝組織TGF-β1的表達，是對酒精性肝損傷保護作用的重要環(huán)節(jié).本實驗結果顯示，模型組大鼠肝組織TGF-β1含量均明顯升高，提示肝損傷大鼠TGF-β1信號通路明顯被激活.OLE干預后，肝組織TGF-β1含量均顯著降低，提示OLE對TGF-β1表達具有明顯的抑制作用.

綜上所述，OLE可通過調(diào)節(jié)TGF-β1表達水平，緩解酒精性肝損傷的進展.該實驗為研發(fā)OLE制劑防治肝損傷相關疾病提供了理論與實驗依據(jù)，但有關其藥理作用機制和量效關系等尚需進一步研究.

圖2 TGF-β1在大鼠肝臟的表達注：A.正常組, 標尺示100 μm(下同); B.模型組; C.Ⅰ組; D.Ⅱ組; E.Ⅲ組; F.陰性對照

圖3 各組大鼠肝臟TGF-β1表達的比較