肝龍膠囊聯(lián)合水飛薊素體外抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究*

邵明園，焦素月，李燕，賴(lài)泳

（1.大理大學(xué) 藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671003；2.大理大學(xué) 云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671003）

肝纖維化是諸如病毒性肝炎、脂肪肝、酒精肝等慢性肝病發(fā)展為肝硬化或肝癌的中間環(huán)節(jié)，特征為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc, ECM）大量積累及降解失調(diào)。多種因素導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞活化，并分泌促纖維化細(xì)胞因子，使膠原合成增加是肝纖維化的主要病理過(guò)程。目前，常用的抗肝纖維化藥物有秋水仙堿、復(fù)方甘草酸苷、還原型谷胱甘肽等，但無(wú)理想的治療肝纖維化藥物。水飛薊素是治療肝損傷的傳統(tǒng)藥物。研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素能改善實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的程度，具有肝保護(hù)作用[1-3]。肝龍膠囊是抗肝炎的新藥，其藥用成分主要為美洲大蠊提取物。美洲大蠊提取物能抑制大鼠肝星狀細(xì)胞的增殖并減少ECM的產(chǎn)生[4-5]。許多研究表明，美洲大蠊提取物具有抗肝纖維化的作用[6-7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素單獨(dú)使用時(shí)效果不明顯，會(huì)有腹瀉、消化不良等不良反應(yīng)。肝龍膠囊單獨(dú)使用時(shí)抗肝纖維化作用不明顯。因此，本研究選取肝龍膠囊聯(lián)合水飛薊素進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，以期為肝龍膠囊增強(qiáng)水飛薊素抗肝纖維化作用，提供藥理學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株

人正常肝細(xì)胞（human hepatic stellate cell line,L-02）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)（HTCC01），人肝星狀細(xì)胞系（human hepatic stellate cell line, LX-2）購(gòu)自中南大學(xué)細(xì)胞庫(kù)（HTCC-4）。

1.2 藥品及試劑

肝龍膠囊（昆明賽諾制藥有限公司，批號(hào)13032402），水飛薊素膠囊（天津天士力圣特制藥有限公司，批號(hào)15041601），Ⅲ型前膠原（procollagen Ⅲ,PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-collagen, Ⅳ-C）、層粘連蛋白（laminnin, LN）、透明質(zhì)酸（hyaluronic acid, HA）、I型膠原（collagen type I, Col-I）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（欣博盛生物科技有限公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)1618862），DMEM高糖培養(yǎng)基粉末（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)1710802），Trizol（上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司，批號(hào) SL24223904），2×Taq PCR MasterMix（上海 Thermo Scientific公司，批號(hào) 002222377），DNA Marker D2000（北京天根生化科技有限公司，批號(hào)H7104），Biowest瓊脂糖（北京基因科技有限公司，批號(hào)111760），焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate, DEPC）（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)729b028）。

1.3 主要儀器與設(shè)備

Synergy HT多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司），Thermo Scientific Series型二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司），2720型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司），G：Box 凝膠成像系統(tǒng)（英國(guó) Syngene公司），DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠），核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將LX-2細(xì)胞從-80℃超低溫冰箱中取出復(fù)蘇，用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)用0.2%胰蛋白酶消化傳代，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 細(xì)胞給藥濃度篩選 選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的L-02、LX-2細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的密度種板，按1×104個(gè)/孔接種于96孔板，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，使其完全貼壁。將肝龍膠囊（A）和水飛薊素（C）分別以7.5和3.5 mg/ml的濃度以二倍比向下稀釋5個(gè)濃度進(jìn)行交叉給藥。采用MTT法測(cè)細(xì)胞的存活率，選取藥物對(duì)L-02細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用時(shí)的濃度作為聯(lián)用藥的最佳濃度。存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（陰性組OD值-空白組OD值）×100%。以該最佳濃度的二倍比浮動(dòng)2個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表1）。

表1 肝龍膠囊和水飛薊素進(jìn)行交叉給藥的濃度

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附法 細(xì)胞給藥處理結(jié)束后，取上清，2 000 r/min離心20 min。將上清液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的96孔板內(nèi)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)Col-I、PCⅢ、Ⅳ-C、LN、HA、TGF-β1水平的變化。

1.4.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR） 采用 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Col-1和TIMP-1 mRNA的表達(dá)。①LX-2細(xì)胞內(nèi)總RNA的提取、鑒定和濃度測(cè)定。采用Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，取2μl總RNA，用0.1%DEPC稀釋20倍，用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)純度和濃度，總RNA純度以A260/A280 在1.80～2.00為合格，合格后將總RNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩＂诳俁NA逆轉(zhuǎn)錄。按照逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，取1μg模板RNA和1μl Oligo（dt）18引物、10μl DEPC滅菌水置于EP管中離心混勻，65℃孵育5 min，冰浴2 min后離心，置于冰上。依次加入4μl 5×Reaction Buffer、1μl RibolockTMRibonuelease Inhibitor、2μl 10 mmol/L dNTP mix和1μl RevertAidTMM-MuLv逆轉(zhuǎn)錄酶。輕彈管壁使其混勻，瞬時(shí)離心3 s，將反應(yīng)體系置于42℃孵育60 min，70℃終止反應(yīng)5 min，冰上冷卻；將合成好的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩＂跴CR擴(kuò)增Col-I、TIMP-1基因和內(nèi)參β-actin基因。以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，25μl反應(yīng)體系內(nèi)加入8.5μl滅菌超純水，12.5μl 2×Taq PCR Master Mix，正向引物和反向引物各1μl，2μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列和反應(yīng)條件見(jiàn)表2。④瓊脂糖凝膠電泳。取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果用Gel-pro 4.0軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度、面積掃描，以β-actin為內(nèi)參行半定量分析，其比值用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表2 PCR引物序列、反應(yīng)條件及產(chǎn)物大小

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.023，P=0.000），L-02細(xì)胞存活率隨著水飛薊素濃度的降低而逐漸升高。見(jiàn)圖1。

2 結(jié)果

圖1 水飛薊素單用對(duì)L-02細(xì)胞存活率的影響 （±s）

2.1 水飛薊素單用與聯(lián)合肝龍膠囊對(duì)L-02細(xì)胞存活率的影響

2.1.1 水飛薊素單用 MTT結(jié)果顯示，C3、C4、C5組的L-02細(xì)胞存活率分別為（0.48±0.05）%、（0.52±0.11）%和（0.70±0.12）%，經(jīng)單因素方差

2.1.2 水飛薊素聯(lián)合肝龍膠囊 A4C3、A4C4、A4C5、A5C3、A5C4、A5C5、A6C3、A6C4、A6C5 組的 L-02細(xì)胞存活率分別為（0.54±0.12）%、（0.67±0.13）%、（0.73±0.20）%、（0.67±0.09）%、（0.76±0.13）%、（0.79±0.15）%、（0.74±0.02）%、（0.82±0.10）%和（0.89±0.32）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=54.369，P=0.024）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，當(dāng)肝龍膠囊濃度為0.469和0.938 mg/ml時(shí)，與不同濃度水飛薊素聯(lián)用均可使L-02細(xì)胞存活率升高；當(dāng)肝龍膠囊濃度＜0.938 mg/ml時(shí)，與不同濃度水飛薊素聯(lián)用均可使L-02細(xì)胞存活率先升高再降低，之后又升高。見(jiàn)圖2。

圖2 水飛薊素聯(lián)合肝龍膠囊對(duì)L-02細(xì)胞存活率的影響（±s）

2.1.3 水飛薊素單用與聯(lián)合肝龍膠囊 C3、C4、C5、A4C3、A4C4、A4C5、A5C3、A5C4、A5C5、A6C3、A6C4、A6C5組的L-02細(xì)胞存活率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.575，P=0.015）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，與單獨(dú)用藥相比，0.469 mg/ml肝龍膠囊聯(lián)合0.438 mg/ml水飛薊素對(duì)L-02細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用。見(jiàn)圖1、2。

2.2 肝龍膠囊聯(lián)合水飛薊素對(duì)LX-2細(xì)胞中Col-I、PCⅢ、Ⅳ-C、LN、HA、TGF-β1水平的影響

24、48和72 h時(shí)，各組LX-2細(xì)胞中LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、Col-I水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；24和48 h時(shí)，各組LX-2細(xì)胞中TGF-β1水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；72 h時(shí)，各組LX-2細(xì)胞中TGF-β1水平比較，經(jīng)方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，肝龍膠囊聯(lián)合水飛薊素可使LX-2細(xì)胞中TGF-β1、LN、HA、Col-I水平降低，而對(duì)PCⅢ存在雙向調(diào)節(jié)的作用，高濃度時(shí)抑制，低濃度時(shí)促進(jìn)；肝龍膠囊聯(lián)合水飛薊素致LX-2細(xì)胞中LN、HA、Col-I、TGF-β1水平降低的作用優(yōu)于水飛薊素單用（P＜0.05）；肝龍膠囊聯(lián)合水飛薊素與水飛薊素單用的PCⅢ、Ⅳ-C水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3、4。

表3 水飛薊素單用與聯(lián)用肝龍膠囊對(duì)LX-2細(xì)胞LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C含量的影響 （n =6，ng/ml，±s）

表3 水飛薊素單用與聯(lián)用肝龍膠囊對(duì)LX-2細(xì)胞LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C含量的影響 （n =6，ng/ml，±s）

注：1）與陰性組比較，P ＜0.05；2）與C3、C4、C5組比較，P ＜0.05

LN HA PCⅢ Ⅳ-C 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h A4C3 19.3±1.31）2）30.9±2.31）2）16.1±0.61）2）0.56±0.11）2）3.26±0.91）2）3.79±0.51） 22.4±2.9 11.1±1.21） 4.8±0.61） 5.1±0.91） 16.0±0.81） 18.6±1.9 A4C4 19.6±3.11）2） 34.8±5.3 35.1±5.1 1.25±0.21）2） 5.52±1.3 5.82±1.52） 28.4±6.5 16.6±3.61） 22.8±5.2 12.3±2.41） 17.9±1.6 19.1±1.9 A4C5 23.3±2.42） 40.8±4.5 31.2±3.21）2）2.94±0.62）6.76±0.82）5.96±0.92） 28.4±2.6 30.6±3.8 18.1±0.6 14.6±1.31） 19.9±1.7 19.8±1.6 A5C3 20.4±2.02）24.8±1.52） 35.8±1.6 1.04±0.21）2）3.97±0.52）3.52±0.42） 17.0±1.9 19.9±1.6 22.0±2.1 3.35±0.31）16.8±1.41） 15.8±1.5 A5C4 26.1±2.1 32.3±3.1 33.6±1.8 1.97±0.32） 4.36±0.2 4.29±0.42） 19.9±0.4 24.9±1.5 21.1±1.4 8.36±0.91） 18.5±0.6 19.5±0.7 A5C5 31.1±3.8 38.1±3.4 39.6±4.6 2.66±0.32）5.52±0.62） 4.7±0.42） 20.7±0.6 12.5±0.7 12.5±0.9 16.8±0.81） 17.3±0.8 17.9±1.2 A6C3 20.5±2.02） 33.2±3.2 38.1±1.8 1.79±1.72）4.36±0.62） 7.02±1.3 7.3±0.61） 17.4±0.2 21.6±2.3 7.32±0.51） 17.7±1.6 15.2±0.4 A6C4 25.3±2.8 34.3±5.2 39.2±4.8 2.49±0.6 4.66±0.9 5.52±1.1 7.9±0.31） 21.6±3.5 20.3±3.4 17.4±0.9 21.5±2.0 16.5±3.0 A6C5 36.5±3.2 36.5±3.6 47.7±4.5 3.67±3.4 7.61±0.9 8.11±0.7 9.9±0.91） 23.2±2.4 27.1±2.1 17.9±0.7 14.5±1.51） 22.1±2.6 C3 23.7±3.1 36.4±4.2 36.4±4.61） 4.99±0.6 7.56±0.9 7.9±0.8 6.5±0.71） 16.6±1.8 20.8±2.3 8.7±1.81） 16.9±0.91）16.9±1.91）C4 27.5±2.5 36.5±6.1 41.4±8.6 4.69±0.9 6.86±2.0 9.22±2.3 7.2±0.81） 20.9±2.8 19.6±3.5 18.5±2.9 17.2±2.71） 16.7±4.0 C5 37.9±3.9 40.9±3.4 49.1±8.9 5.07±1.4 9.01±2.0 9.51±1.8 10.5±2.11） 23.8±1.8 27.7±2.6 19.0±3.5 19.8±2.7 20.6±2.5陰性組 25.1±3.1 35.3±5.3 43.8±1.8 2.51±0.6 5.01±0.9 7.76±1.1 18.7±0.9 17.9±1.3 19.9±3.1 21.32±2.1 20.27±2.0 19.8±1.5 F值 5.096 4.786 13.079 28.808 85.139 74.044 47.510 23.134 9.272 40.401 4.129 3.204 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.001 0.006組別

表4 水飛薊素單用與聯(lián)合肝龍膠囊對(duì)LX-2細(xì)胞Col-I、TGF-β1含量的影響 （n =6，±s）

表4 水飛薊素單用與聯(lián)合肝龍膠囊對(duì)LX-2細(xì)胞Col-I、TGF-β1含量的影響 （n =6，±s）

注：1）與陰性組比較，P ＜0.05；2）與C3、C4、C5組比較，P ＜0.05

Col- I /（ng/ml） TGF-β1/（pg/ml）24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h A4C3 14.68±1.61）2） 13.7±2.31）2） 14.6±2.41）2） 960.2±23.12） 1023.6±9.8 1 833.7±132）A4C4 16.7±2.41）2） 12.2±3.11）2） 14.9±3.61）2） 981.9±24 965.2±151） 1 863.6±352）A4C5 19.1±1.31）2） 17.0±1.22） 17.7±21） 867.1±421）2） 941.9±631） 1 789.0±202）A5C3 17.0±2.51）2） 14.4±2.11）2） 17.8±2.61） 991.9±33 883.7±321） 1 965.2±242）A5C4 20.39±0.9 15.7±0.81）2） 19.4±0.61） 930.3±512） 950.2±361） 2 000.2±452）A5C5 23.2±0.9 15.9±0.81）2） 18.9±1.31） 978.5±511） 1 008.5±38 2 028.5±492）A6C3 21.7±1.3 17.1±0.61） 19.4±0.81） 1 046.8±46 991.9±34 2 106.7±432）A6C4 23.5±0.2 20.3±0.11） 21.5±1.11） 995.2±32 888.7±241） 2 193.2±43 A6C5 27.5±16 20.7±2.01） 20.9±1.41） 1 088.4±34 1 349.7±46 2 576.2±52 C3 24.9±3.4 20.3±2.9 22.6±3.41） 1 058.8±35 1 003.9±421） 2 118.7±48 C4 25.7±6.2 22.5±4.3 23.7±3.81） 1 022.2±61 1 045.5±33 2 220.2±39 C5 28.9±6.2 22.1±5.3 22.3±4.01） 1 092.1±36 1 383.7±26 2 610.2±41陰性組 23.9±2.5 37.2±3.4 46.3±1.6 951.9±41 1 288.1±26 1 835.7±58 F值 12.169 103.908 71.549 174.676 2415.158 1.355 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.249組別

2.3 Col-I、TIMP-1、β-actin基因擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物

對(duì)Col-I、TIMP-1、β-actin基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4 水飛薊素單用與聯(lián)用肝龍膠囊對(duì)LX-2細(xì)胞中Col-I和TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響

24、48和72 h時(shí)，各組LX-2細(xì)胞中Col-I和TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，水飛薊素在單獨(dú)用藥情況下隨著濃度的升高，對(duì)Col-I mRNA表達(dá)的抑制作用逐漸增強(qiáng)。水飛薊素對(duì)TIMP-1 mRNA的影響存在濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。水飛薊素與A5組聯(lián)合作用24 h時(shí)的Col-I mRNA表達(dá)水平與陰性組比較無(wú)抑制作用，但在72 h效果較好。水飛薊素與肝龍膠囊聯(lián)合使用時(shí)，在較高濃度的情況下對(duì)Col-I mRNA的抑制作用也是遠(yuǎn)期效果較好，且優(yōu)于單藥使用；較低濃度的聯(lián)合對(duì)Col-I mRNA無(wú)抑制作用；當(dāng)肝龍膠囊濃度不變時(shí)，只有與低濃度的水飛薊素聯(lián)合對(duì)TIMP-1 mRNA的影響在24 h時(shí)不如單獨(dú)用藥，其他濃度組合均優(yōu)于單獨(dú)用藥，且以遠(yuǎn)期效果最佳（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 水飛薊素單用與聯(lián)用肝龍膠囊對(duì)LX-2細(xì)胞Col-I和TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響 （n =6，±s）

表5 水飛薊素單用與聯(lián)用肝龍膠囊對(duì)LX-2細(xì)胞Col-I和TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響 （n =6，±s）

注：1）與陰性組比較，P ＜0.05；2）與C3、C4、C5組比較，P ＜0.05

Col-I mRNA TIMP-1 mRNA 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h A4C3 0.54±0.12 0.42±0.111） 0.26±0.051） 0.23±0.021）2） 0.22±0.031） 0.18±0.051）A4C4 0.61±0.21 0.39±0.141）2） 0.26±0.071）2） 0.29±0.061）2） 0.27±0.041） 0.19±0.041）A4C5 0.55±0.16 0.35±0.071）2） 0.29±0.021）2） 0.44±0.11 0.23±0.021） 0.17±0.021）2）A5C3 0.87±0.25 0.67±0.17 0.24±0.051）2） 0.25±0.031）2） 0.13±0.021）2） 0.19±0.051）A5C4 0.84±0.22 0.70±0.18 0.24±0.031）2） 0.39±0.07 0.37±0.09 0.21±0.051）A5C5 0.83±0.17 0.49±0.16 0.40±0.082） 0.36±0.04 0.30±0.031） 0.17±0.031）A6C3 0.55±0.06 0.57±0.09 0.56±0.10 0.27±0.021）2） 0.27±0.061） 0.15±0.051）A6C4 0.66±0.11 0.76±0.21 1.19±0.32 0.39±0.1 0.21±0.071）2） 0.28±0.071）A6C5 0.63±0.14 0.66±0.13 0.64±0.18 0.60±0.17 0.35±0.08 0.38±0.09 C3 0.64±0.14 0.54±0.1 0.39±0.021） 0.29±0.081） 0.23±0.05 0.17±0.071）C4 0.74±0.13 0.57±0.1 0.42±0.081） 0.39±0.09 0.34±0.06 0.28±0.07 C5 0.72±0.08 0.76±0.05 0.80±0.29 0.33±0.04 0.29±0.08 0.29±0.02陰性組 0.71±0.20 0.73±0.15 0.69±0.09 0.51±0.13 0.54±0.12 0.52±0.08 F值 135.564 286.062 1281.955 434.306 480.806 869.578 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000組別

3 討論

慢性肝病嚴(yán)重威脅著人們的生活健康，全世界＞10 000萬(wàn)人是乙型肝炎病毒的感染者。慢性肝病將發(fā)展為肝纖維化，肝纖維化是肝臟持續(xù)受損后的一種愈合反應(yīng)，表現(xiàn)為ECM合成與降解失衡，減少ECM的產(chǎn)生可以阻止肝纖維化的發(fā)展[8]。肝纖維化時(shí)，ECM大量合成，其中Col-I是最主要的膠原成分，而TIMP-1是抑制Col-I降解的主要酶?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs） 與 TIMPs調(diào) 節(jié)ECM的合成和降解，TIMPs可抑制MMPs的表達(dá),使ECM降解減少[9]。目前，診斷肝纖維化程度的金標(biāo)準(zhǔn)為肝組織活檢，但該標(biāo)準(zhǔn)存在許多缺陷，因此PCⅢ、Ⅳ-C、LN、HA 4項(xiàng)指標(biāo)在臨床上具有重要的意義[10]。TGF-β1在肝纖維化過(guò)程中起最關(guān)鍵的作用。這6項(xiàng)指標(biāo)在肝纖維化過(guò)程中大量生成，因此監(jiān)測(cè)藥物對(duì)肝臟纖維化4項(xiàng)指標(biāo)和Col-I、TGF-β1水平的影響，即可大致對(duì)肝纖維化做出療效觀察或預(yù)后判斷。

水飛薊素和肝龍膠囊都是抗肝纖維化的藥物。水飛薊素是一種天然多酚類(lèi)黃酮化合物，是從藥用植物水飛薊或奶薊果實(shí)中提取的有效成分，由水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊丁組成，是重要的保肝藥。水飛薊素具有強(qiáng)大的抗氧化、抗肝細(xì)胞凋亡、抗炎[11]、抗腫瘤[12]、肝細(xì)胞保護(hù)作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素還具有抗肝纖維化作用，能降低慢性乙肝患者血清中LN、HA、Ⅳ-C的含量，具有較好的抗肝纖維化療效[13]。肝龍膠囊是治療慢性乙型肝炎的中藥，對(duì)大鼠酒精性肝損傷具有防治作用[14]。夏超等[15]研究表明，肝龍膠囊主要的藥用成分美洲大蠊提取物能降低血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C的水平，下調(diào)肝組織中肌動(dòng)蛋白和TGF-β1蛋白的表達(dá)，同時(shí)能減輕肝臟損傷程度。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝龍膠囊聯(lián)合水飛薊素可使LX-2細(xì)胞中LN、HA、Col-I水平降低，從而減少蛋白聚糖多聚體、膠原蛋白、基底膜等生成。但肝龍膠囊聯(lián)合水飛薊素對(duì)PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1在高濃度聯(lián)合條件下抑制效果較好，且在24 h時(shí)有抑制作用，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，又呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，這可能是由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，使已分泌的TGF-β1、Ⅳ-C等因子進(jìn)一步活化LX-2細(xì)胞，令其活化擴(kuò)大化，而生成更多的TGF-β1、Ⅳ-C等因子。

另外，在較高濃度情況下，肝龍膠囊聯(lián)合水飛薊素對(duì)Col-I mRNA抑制作用的遠(yuǎn)期效果優(yōu)于單藥使用，但較低濃度的聯(lián)合作用不佳；對(duì)TIMP-1 mRNA的影響均優(yōu)于單獨(dú)用藥；兩者聯(lián)合作用于TIMP-1 mRNA時(shí)效果優(yōu)于單獨(dú)用藥，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性。肝龍膠囊聯(lián)合水飛薊素可以有效地提高M(jìn)MPs的活性，下調(diào)TIMP-1的表達(dá)，加速ECM的降解，從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化。TGF-β1是肝星狀細(xì)胞激活的主要因子，可通過(guò)抑制MMPs產(chǎn)生和促進(jìn)TIMPs合成，使ECM增加。在本實(shí)驗(yàn)中，肝龍膠囊聯(lián)合水飛薊素較水飛薊素單用減少TGF-β1的產(chǎn)生，抑制TIMP-1 mRNA的表達(dá)，使ECM降解。因此，肝龍膠囊聯(lián)合水飛薊素抗肝纖維化的作用優(yōu)于水飛薊素單獨(dú)使用，肝龍膠囊起到協(xié)同增效的作用。

本實(shí)驗(yàn)尚存在許多不足，所用細(xì)胞為人源細(xì)胞，與原代細(xì)胞存在較大差異，體內(nèi)外影響因素較大，因此下一步研究可以從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面進(jìn)行。肝龍膠囊聯(lián)合水飛薊素抗肝纖維化作用的機(jī)制也不明確，需要進(jìn)一步研究。