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    萬(wàn)珂增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究*

    2018-10-18 09:03:22胡煒劉丹陳曲王嵬
    關(guān)鍵詞:自體前列腺癌引物

    胡煒,劉丹,陳曲,王嵬

    (遼寧省錦州市中心醫(yī)院 腫瘤科,遼寧 錦州 121001)

    人類的先天性免疫系統(tǒng)中,自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)為其重要組成部分,尤其在腫瘤免疫治療中,更發(fā)揮了重要作用。NK細(xì)胞可以通過(guò)各種有效的殺傷機(jī)制,殺傷同系、同種或異種瘤細(xì)胞,包括釋放穿孔素和顆粒酶、通過(guò)死亡受體調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡等[1-3]。NK細(xì)胞表面具有活化性受體和抑制性受體,兩者間的平衡狀態(tài)是其能否發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)的決定因素[4]。抑制性受體主要是殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體,可以特異性地與細(xì)胞表面的人白細(xì)胞抗原-I(human leucocyte antige-I,HLA-I)類分子結(jié)合,參與NK細(xì)胞的活化過(guò)程,抑制由活化性受體激發(fā)的細(xì)胞毒性作用。有研究證明,蛋白酶體抑制劑—萬(wàn)珂(化學(xué)名硼替佐米)通過(guò)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞上表達(dá)的死亡配體—腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)連接到死亡受體4(death receptors 4,DR4)和DR5,引起腫瘤細(xì)胞的凋亡[5]。然而在前列腺癌細(xì)胞中,萬(wàn)珂致敏NK細(xì)胞殺傷腫瘤是否也是通過(guò)腫瘤細(xì)胞的抑制性配體實(shí)現(xiàn),還未見報(bào)道。本研究用2種激素依賴性和激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株LNCaP和DU145為模型,探討萬(wàn)珂是否可以致敏NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的作用及其作用機(jī)制。NK細(xì)胞。經(jīng)Ficoll-Paque Plus密度梯度離心,吸取界面層的外周血單個(gè)核細(xì)胞,用預(yù)冷Reaction buffer將單個(gè)核細(xì)胞的濃度調(diào)整為1×108個(gè)/ml,加入生物素化的抗體,混勻,孵育15 min,在混懸液中加入50μl磁珠,再次混勻,繼續(xù)孵育15 min,將對(duì)細(xì)胞混懸液進(jìn)行洗滌。將洗滌后的混懸液轉(zhuǎn)移至磁場(chǎng)中,帶磁力的細(xì)胞移至磁場(chǎng)中,6 min后吸除上清液,剩余NK細(xì)胞。將剩余的NK細(xì)胞在含10%胎牛血清和500 u/ml重組人白介素-2的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,活化NK細(xì)胞。采用FITC-CD3和PE-CD56鼠抗人單抗標(biāo)記NK細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀分析CD3-CD56+細(xì)胞百分比以檢測(cè)NK的純度。本實(shí)驗(yàn)純化的細(xì)胞中NK細(xì)胞>85%。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    萬(wàn)珂(美國(guó)Millennium Pharmaceuticals公司),NK分離試劑盒(美國(guó)RD公司RPMI 1640,胎牛血清(天津?yàn)笊镉邢薰荆鹊鞍酌福绹?guó)HyClone公司),熒光標(biāo)記抗體藻紅蛋白(Phycoerethrin,PE)標(biāo)記的抗人DR5抗體、抗人Fas抗體、抗人HLAABC抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司,Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司),實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR)試劑盒(日本TaKaRa公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) DU145、LNCaP細(xì)胞培養(yǎng)使用RPMI 1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中含10%胎牛血清,2種細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng),用胰酶進(jìn)行消化傳代,待細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。經(jīng)各種因素處理后可進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

    1.2.2 NK細(xì)胞的分離及鑒定 取健康志愿者抗凝外周血20 ml,按NK細(xì)胞分離試劑盒說(shuō)明書操作,分離

    1.2.3 Annexin-V/PI法 20 nmol/L萬(wàn)珂處理DU145和LNCaP細(xì)胞48 h,記數(shù)細(xì)胞后,在每孔種植相同數(shù)量的細(xì)胞,細(xì)胞貼壁24 h。NK細(xì)胞以1∶1效靶比與腫瘤細(xì)胞共孵育6 d。收集所有細(xì)胞,用Annexin-V/PI法測(cè)定細(xì)胞的凋亡率。

    1.2.4 流式細(xì)胞儀 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的DU145、LNCaP細(xì)胞,不同濃度(0、10和20 nmol/L)萬(wàn)珂處理2種前列腺癌細(xì)胞株24 h,分別收集各組DU145、LNCaP細(xì)胞,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗2次,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10個(gè)5/ml,取500μl細(xì)胞懸液,加入PE標(biāo)記的HLA-ABC抗體20μl,避光孵育20 min。冷PBS洗細(xì)胞1次,將細(xì)胞重懸于0.5 ml PBS中,流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞表面HLA-ABC蛋白的表達(dá)。使用WinMDI軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    1.2.5 qRT-PCR 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的DU145、LNCaP細(xì)胞,不同濃度(0、10和20 nmol/L)萬(wàn)珂處理2種前列腺癌細(xì)胞株24 h,分別收集各組DU145、LNCaP細(xì)胞。采用Trizol法抽提細(xì)胞總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度及含量,選用OD260/OD280比值為1.8~2.0的RNA標(biāo)本用于下一步反應(yīng)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,合成cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)。分別向PCR管中加入SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5μl,cDNA 模 板 2μl,ddH2O 8.5μl,以及正反向引物各 lμl。HLA-C 正向引物 :5'-TCCTGGTTGTCCTAGCTGTC-3',反向引物 :5'-CAGGC-TTTACAAGTGATGAG3-';甘油醛-3-磷酸脫 氫 酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GADPH)正向引物:5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3',反向引物:5'-GAAG-ATGGTGATGGGATTTC3-'。引物均由大連寶生生物工程公司有限公司合成。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火30 s,共45個(gè)循環(huán),60℃收集熒光5 s,99℃、1 min,50℃、1 min,以0.5℃/s的速度升溫到99℃,對(duì)熒光進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)做熔解曲線分析。采用qRT-PCR儀進(jìn)行檢測(cè),以HLA-C與GADPH相對(duì)濃度比值反映目的基因mRNA的表達(dá)。用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組比較用t檢驗(yàn),多組比較用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較用Tukey-HSD檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 萬(wàn)珂提高前列腺癌細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷的敏感性

    2.1.1 DU145細(xì)胞 未處理組、萬(wàn)珂組、NK細(xì)胞組及其共同預(yù)處理組的DU145細(xì)胞凋亡率分別為(21.698±2.658)%、(34.945±2.245)%、(23.972±2.952)%和(41.831±2.965)%,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.240,P=0.000)。進(jìn)一步兩兩比較,萬(wàn)珂、NK細(xì)胞共同預(yù)處理的DU145細(xì)胞凋亡率較僅萬(wàn)珂或NK細(xì)胞預(yù)處理高(P<0.05)。見圖1。

    圖1 萬(wàn)珂致敏NK細(xì)胞對(duì)DU145細(xì)胞凋亡的影響 (±s)

    2.1.2 LNCaP細(xì)胞 未處理組、萬(wàn)珂組、NK細(xì)胞組及其共同預(yù)處理組的LNCaP細(xì)胞凋亡率分別為(23.663±2.204)%、(25.992±1.743)%、(29.729±2.581)%和(30.310±1.638)%,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.922,P=0.013)。進(jìn)一步兩兩比較,萬(wàn)珂、NK細(xì)胞共同預(yù)處理組的LNCaP細(xì)胞凋亡率與萬(wàn)珂組、NK細(xì)胞組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。處理過(guò)的DU145細(xì)胞凋亡率比LNCaP細(xì)胞更高。提示NK細(xì)胞能有效提高激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞凋亡率,且NK細(xì)胞與萬(wàn)珂的聯(lián)合應(yīng)用較單獨(dú)應(yīng)用凋亡率更高。見圖2。

    圖2 萬(wàn)珂致敏NK細(xì)胞對(duì)LNCaP細(xì)胞凋亡的影響 (±s)

    2.2 萬(wàn)珂對(duì)DU145細(xì)胞HLA-I類分子mRNA和蛋白表達(dá)的影響

    2.2.1 HLA-C mRNA 0、10和20 nmol/L萬(wàn)珂處理后DU145細(xì)胞HLA-C mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(1.017±0.107)、(0.892±0.152) 和(0.753±0.116),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.256,P=0.034)。進(jìn)一步兩兩比較,10 nmol/L萬(wàn)珂處理后DU145細(xì)胞HLA-C mRNA表達(dá)水平與0和20 nmol/L萬(wàn)珂組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);20 nmol/L萬(wàn)珂處理后DU145細(xì)胞HLA-C mRNA表達(dá)水平較0 nmol/L萬(wàn)珂組下調(diào)(P<0.05)。見圖3。

    圖3 不同濃度萬(wàn)珂對(duì)DU145細(xì)胞HLA-C mRNA表達(dá)水平的影響 (±s)

    2.2.2 HLA-ABC蛋白 0和20 nmol/L萬(wàn)珂處理后DU145細(xì)胞HLA-C-ABC蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(65.842±0.178)和(38.220±0.389),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12531.758,P=0.000),20 nmol/L萬(wàn)珂處理后DU145細(xì)胞HLA-ABC蛋白表達(dá)水平較0 nmol/L萬(wàn)珂組下調(diào)。見圖4。

    圖4 不同濃度萬(wàn)珂對(duì)DU145細(xì)胞HLA-ABC蛋白表達(dá)水平的影響

    2.3 萬(wàn)珂對(duì)LNCap細(xì)胞HLA-I類分子mRNA和蛋白表達(dá)的影響

    2.3.1 HLA-C mRNA 0、10和20 nmol/L萬(wàn)珂處理后LNCap細(xì)胞HLA-C mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(1.027±0.101)、(0.930±0.140) 和(0.861±0.130),經(jīng)單因素方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.345,P=0.329)。見圖 5。

    2.3.2 HLA-ABC蛋白 0、10和20 nmol/L萬(wàn)珂處理后LNCap細(xì)胞HLA-ABC蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(2.831±0.428)和(2.110±0.551),經(jīng)t檢驗(yàn),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.221,P=0.147)。見圖6。

    圖5 不同濃度萬(wàn)珂對(duì)LNCaP細(xì)胞HLA-C mRNA表達(dá)的影響 (±s)

    圖6 不同濃度萬(wàn)珂對(duì)LNCaP細(xì)胞HLA-ABC蛋白表達(dá)的影響

    3 討論

    近年來(lái),前列腺癌的發(fā)病率越來(lái)越高。激素依賴性的前列腺癌患者可以用去勢(shì)方法治療,而激素非依賴性的前列腺癌對(duì)激素抑制治療和化療無(wú)效,患者生存率非常低,所以急切期待著新的治療模式產(chǎn)生。

    蛋白酶體抑制作用引發(fā)的抗腫瘤凋亡活性的精確機(jī)制非常難分析,似乎是多因素的。26S蛋白酶體能對(duì)大量的細(xì)胞通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。有研究表明,蛋白酶體抑制參與活化核轉(zhuǎn)錄因子κB[6-7],降低死亡區(qū)域蛋白樣白介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白的表達(dá),增加DR5的表達(dá),通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的凋亡通路活化Caspase-3[8-9],累積前凋亡蛋白Bik等大范圍的細(xì)胞效應(yīng)。而NK細(xì)胞也有TRAIL和Fas配體,其可以在靶細(xì)胞中觸發(fā)凋亡。

    曾經(jīng)有人假設(shè)成熟的NK細(xì)胞表達(dá)≥1種自體HLA-I類抑制性受體,特別是HLA-C和Bw4分子[10]。當(dāng)抑制信號(hào)占主導(dǎo)時(shí),HLA-I類抑制性受體能夠保護(hù)健康細(xì)胞不被NK細(xì)胞破壞[11]。而在相對(duì)情況下,NK細(xì)胞能積極地溶解腫瘤細(xì)胞而不顯示這些抑制性受體。自體HLA分子使NK細(xì)胞失活是惡性腫瘤細(xì)胞逃逸宿主NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的一個(gè)潛在機(jī)制[12]。

    在正常的環(huán)境中,前列腺癌細(xì)胞表達(dá)自體HLA分子,使自體的NK細(xì)胞失活,這可能是腫瘤免疫逃逸機(jī)制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。這也有助于解釋在實(shí)體腫瘤的治療中獲得性輸注自體NK細(xì)胞相對(duì)缺乏活性[13]。本研究結(jié)果表明,萬(wàn)珂處理DU145細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表面表達(dá)的HLA-ABC蛋白和HLA-C mRNA降低。這證明萬(wàn)珂能夠克服前列腺癌細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的抑制,使獲得性輸注NK細(xì)胞的治療更有效,從而使其應(yīng)用更廣??墒沁@些改變卻沒(méi)有在LNCaP細(xì)胞上出現(xiàn)。還有研究表明,殘留的宿主淋巴細(xì)胞的有效排斥反應(yīng)限制了NK細(xì)胞輸注的持久性,這也減少了治療的有效性。而萬(wàn)珂能夠通過(guò)特異性清除有自體反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞,從而潛在促進(jìn)NK細(xì)胞的持久性[14]。這些效應(yīng)證明,萬(wàn)珂增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗腫瘤活性。

    綜上所述,萬(wàn)珂抑制腫瘤細(xì)胞上HLA-ABC的表達(dá),從而促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別和殺傷。而這種效應(yīng)在激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞上表現(xiàn)更明顯,證明萬(wàn)珂能成為一種有效的藥物,增強(qiáng)腫瘤免疫治療的效果,尤其為激素非依賴性前列腺癌的生物治療提供新希望。

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