河南省設(shè)施保護地蔬菜根結(jié)線蟲種類調(diào)查及鑒定

蔡毓新，唐艷領(lǐng)，史宣杰，楊 凡

（1.河南省慶發(fā)種業(yè)有限公司 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所 鄭州 450002）

蔬菜根結(jié)線蟲是一類嚴(yán)重危害黃瓜、番茄、芹菜等蔬菜且具有廣泛寄主范圍的植物寄生線蟲。在我國常見的主要有南方根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲等4類[1]。每年因蔬菜根結(jié)線蟲造成的作物減產(chǎn)可達30%～50%，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致絕收[2]。據(jù)統(tǒng)計，全球每年因為蔬菜根結(jié)線蟲病造成的經(jīng)濟損失可達數(shù)千億美元。河南省是中國重要的農(nóng)業(yè)大省，是我國重要的蔬菜生產(chǎn)地區(qū)。近年來，由于種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，蔬菜的供需量不斷增加，使得保護地蔬菜復(fù)種指數(shù)越來越高，根結(jié)線蟲危害越來越嚴(yán)重，從而造成蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)不斷下降。筆者對河南省不同縣市的蔬菜保護地區(qū)進行采樣分析，通過形態(tài)鑒別法和PCR分子技術(shù)進行根結(jié)線蟲種類鑒定，旨在明確該地區(qū)蔬菜根結(jié)線蟲的種類和分布，為當(dāng)?shù)厥卟烁Y(jié)線蟲病的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 線蟲危害調(diào)查

2016—2017年對河南省主要蔬菜生產(chǎn)產(chǎn)區(qū)進行土壤采樣和線蟲病害調(diào)查。土壤采樣地點主要有新鄉(xiāng)市、周口市、安陽市、駐馬店市等17個地區(qū)。采樣點、寄主、設(shè)施類型、種植年限等具體見表1。按照隨機取樣的方法，根據(jù)地塊大小，采用5點法，每點選取5株蔬菜進行分析，計算根結(jié)指數(shù)。

病情分級標(biāo)準(zhǔn)：0級：根系無根結(jié)；1級：根系1%～5%有根結(jié)；2級：根系6%～20%有根結(jié)；3級：根系21%～40%有根結(jié)；4級：根系41%～70%有根結(jié)；5級：根系71%以上有根結(jié)。

根結(jié)指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×該病級值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級值）×100。

表1 河南省主要蔬菜保護地根結(jié)線蟲的采集信息

1.2 線蟲分離鑒定

采用改良貝曼漏斗法對根際土壤進行線蟲分離。根樣需要先剪碎研磨，解剖植物根部進行分離線蟲或卵塊。將分離的成熟雌蟲置于載玻片上，用手術(shù)刀切下包含完整的會陰花紋角質(zhì)膜，加蓋玻片于顯微鏡下觀察會陰花紋的形態(tài)特征。

1.3 線蟲DNA提取

從根結(jié)分離得到單條成熟雌蟲，置于單個PCR管中且-20℃冷凍保存。取出冷凍保存的裝有雌蟲的 PCR 管，加入 10×Buffer PCR 3 μL，600 μg·mL-1蛋白酶K 3 μL；振蕩使雌蟲蟲體破碎，混合；加入14 μL ddH2O，將整個體系補足至 20 μL；放入-20 ℃冰箱中處理10 min；65℃下溫育1.5 h后，95℃下處理 10 min；取處理好的提取液，13 000 r·min-1離心2 min；取上清液于另一個PCR管中。獲得單個線蟲的DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 線蟲DNA檢測

利用線蟲通用引物D2A、D3B擴增各個線蟲28SrDNA-D2/D3區(qū)片段，引物序列如表2所示：

表2 擴增線蟲28S rDNA-D2/D3區(qū)片段通用引物序列

PCR擴增程序為：94℃ 5 min，94℃ 50 s、50℃ 1 min、72℃ 2 min、30個循環(huán)，72℃ 10 min。PCR擴增總體系如表3所示。

電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物：擴增完成后，取5 μL擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓110 V，電流110 mA，30 min。EB染色，EP凝膠成像系統(tǒng)觀測，并拍照記錄。

表3 PCR反應(yīng)體系

1.5 PCR分子鑒定

PCR擴增線蟲特異性片段：采用4對不同的特異性引物MI-F/MI-R（南方根結(jié)線蟲），Mh-F/Mh-R（北方根結(jié)線蟲），F(xiàn)jav/Rjav（爪哇根結(jié)線蟲），F(xiàn)ar/Rar（花生根結(jié)線蟲）對線蟲的特異性片段進行PCR擴增，4對引物的序列分別為如表4所示，擴增體系見表5。

表4 線蟲特異性引物序列

PCR擴增程序為：（1）南方根結(jié)線蟲：94℃2 min，94℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72℃ 1 min、45 個循環(huán)，72℃7 min；（2）爪哇根結(jié)線蟲：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min、45 個循環(huán)，72 ℃ 7 min；（3）北方根結(jié)線蟲94℃ 2 min，94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃1 min、45個循環(huán)，72℃7 min；（4）花生根結(jié)線蟲 94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min、45個循環(huán)，72℃7 min。

電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物：擴增完成后，取5 μL擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀測。

表5 PCR反應(yīng)體系

1.6 南方根結(jié)線蟲生理小種鑒定

用鑒別寄主試驗方法鑒定南方根結(jié)線蟲的小種。按照Taylor等所采用的煙草（NC.95）、棉花（Deltapine16）、辣椒（California Wonder）、西瓜（Charleston Grey）、花生（Florrunner）和番茄（Rutgers）6 個鑒別寄主上的表現(xiàn)，主要區(qū)別在對煙草（NC.95）、棉花（Deltapine16）2個寄主的感染性不同（表6）。

表6 南方根結(jié)線蟲生理小種在棉花和煙草寄主上的寄生情況

首先將煙草（NC.95）、棉花（Deltapine16）穴盤育苗，穴內(nèi)裝有滅菌的草炭土∶蛭石=1∶1(體積比)，出苗30 d后移栽到裝有滅菌的沙∶土=2∶1的小盆中，盆深10 cm，盆上口直徑15 cm，裝沙土1 100 g，移栽1周后接種線蟲，每盆保苗1株。所有寄主接種根結(jié)線蟲的量均為5 000個卵/盆，接種45 d扣盆調(diào)查每株根系上根結(jié)數(shù)量，每20盆為1個處理，3次重復(fù)。根結(jié)的分級標(biāo)準(zhǔn)為：無根結(jié)的為0級；1～2個根結(jié)的為1級；3～10個根結(jié)的為2級；11～30個根結(jié)的為3級；31～100個根結(jié)的為4級，100個以上的根結(jié)為5級。0、1級為不親和，用“－”表示；2～5級為親和，用“+”表示。根據(jù)線蟲在上述寄主上的表現(xiàn)確定南方根結(jié)線蟲的小種。

2 結(jié)果與分析

2.1 根結(jié)線蟲危害性

調(diào)查結(jié)果表明，新鄉(xiāng)、駐馬店等地區(qū)黃瓜、番茄等蔬菜受根結(jié)線蟲的危害嚴(yán)重，被調(diào)查菜田的株發(fā)病率均在50%以上，其中新鄉(xiāng)市牧野區(qū)段莊地區(qū)黃瓜、番茄植株發(fā)病率高達85%以上，根結(jié)指數(shù)達到47.3以上，同時還伴有枯萎病、青枯病及細(xì)菌性流膠病等病害的復(fù)合發(fā)生；駐馬店上蔡黃埠鎮(zhèn)地區(qū)甜瓜植株發(fā)病率高達93%，根結(jié)指數(shù)達到49.8（圖1，表7）。經(jīng)過調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)根結(jié)線蟲病害嚴(yán)重主要和施用未腐熟的雞糞有關(guān)，從外地引進的根結(jié)線蟲卵和幼蟲。同時發(fā)現(xiàn)，根結(jié)線蟲病害發(fā)生的嚴(yán)重程度與保護地種植年限密切相關(guān)，年限越長，根結(jié)線蟲的病害越嚴(yán)重。老棚區(qū)根結(jié)指數(shù)明顯大于新棚區(qū)。這可能是由于保護地內(nèi)高溫高濕的環(huán)境條件，加上作物復(fù)種指數(shù)高，連作栽培普遍，造成蔬菜根結(jié)線蟲病呈逐年加重趨勢。

圖1 黃瓜根結(jié)線蟲（A）和番茄根結(jié)線蟲（B）危害情況

表7 河南省主要蔬菜保護地根結(jié)線蟲危害調(diào)查結(jié)果

2.2 根結(jié)線蟲形態(tài)學(xué)鑒定

對雌蟲會陰花紋進行顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)雌蟲會陰花紋呈橢圓形，背弓高，背弓頂部圓平，背紋緊密；花紋背面和側(cè)面的線紋呈波浪形或鋸齒狀，側(cè)線不明顯等特征，初步認(rèn)為寄生黃瓜和番茄的根結(jié)線蟲種類主要是南方根結(jié)線蟲（圖2）。

圖2 南方根結(jié)線蟲會陰花紋

2.3 線蟲分子鑒定

根據(jù)對線蟲D2A-D3B區(qū)域進行PCR擴增，只有采用特異性引物MI-F/MI-R擴增，才有特異性條帶產(chǎn)生，片段大小為990 bp（圖3）。

圖3 PCR擴增結(jié)果

2.4 南方根結(jié)線蟲生理小種鑒定

調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙草、棉花除了個別處理的植株有1～2個根結(jié)外，發(fā)病程度很低，各處理之間無顯著差異，和黃瓜或番茄等蔬菜的發(fā)病程度及根結(jié)指數(shù)有顯著性差異。根據(jù)南方根結(jié)線蟲在煙草、棉花和番茄上的寄生情況和反應(yīng)表型，本次調(diào)查的根結(jié)線蟲種群屬于南方根結(jié)線蟲1號小種。

3 討論與結(jié)論

筆者調(diào)查了河南省17個地區(qū)的設(shè)施保護地內(nèi)番茄、黃瓜、甜瓜的主要根結(jié)線蟲種群，采集的線蟲樣本經(jīng)分離后進行DNA提取檢測，用形態(tài)學(xué)鑒定法和鑒別寄主試驗方法對根結(jié)線蟲進行鑒定。試驗結(jié)果表明，侵染河南省設(shè)施保護地內(nèi)番茄、黃瓜、甜瓜的主要根結(jié)線蟲種群屬于南方根結(jié)線蟲1號小種。

對根結(jié)線蟲進行研究和防治的基礎(chǔ)是種類鑒定。筆者本次調(diào)查采集的地點主要在保護地，溫濕度大，良好的氣候條件為南方根結(jié)線蟲繁殖提供了環(huán)境基礎(chǔ)。保護地常年種植蔬菜，復(fù)種指數(shù)高，也加重了根結(jié)線蟲發(fā)生的危害[3]。南方根結(jié)線蟲有1號、2號、3號和4號小種，其中1號為優(yōu)勢小種[4]。李春杰等[5]在對黑龍江省大慶市蔬菜根結(jié)線蟲調(diào)查時也發(fā)現(xiàn)，大棚內(nèi)感染番茄和黃瓜的南方根結(jié)線蟲是1號小種，姚玉榮等[6]對危害天津6個主要溫室蔬菜產(chǎn)區(qū)的根線線蟲進行種類鑒定，也發(fā)現(xiàn)全部為南方根結(jié)線蟲。本試驗結(jié)論與前人研究結(jié)論相符。

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，運用PCR技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類及同工酶分析等方法，能夠快速、準(zhǔn)確地鑒定根結(jié)線蟲的種類，而且鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠[7]。筆者通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法相結(jié)合，進一步證實了河南省17個縣市設(shè)施保護地根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲1號小種，確定出了優(yōu)勢種群。在這次調(diào)查中并未發(fā)現(xiàn)根結(jié)線蟲合并侵染的情況，可能由于采集的地區(qū)不全面，樣本不豐富，在以后的工作中需要不間斷定時監(jiān)測，對河南省保護地蔬菜根結(jié)線蟲病害選育抗病品種有重要意義，同時為根結(jié)線蟲病害的防治工作提供科學(xué)依據(jù)。