基于高通量測(cè)序和可培養(yǎng)方法的勐海發(fā)酵普洱茶細(xì)菌多樣性分析

張欣，姚粟*，白飛榮，田海霞，趙婷，馬躍，劉海新，李頌，郝彬秀，王春玲

1 (中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,北京,100015) 2 (中國(guó)茶葉有限公司，北京，102209)

勐海是云南地理標(biāo)志產(chǎn)品普洱茶的重要發(fā)祥地和產(chǎn)區(qū)[1-2]。發(fā)酵普洱茶是采用“渥堆發(fā)酵技術(shù)”，以地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)的云南大葉種為原料，經(jīng)殺青、揉捻、曬干制成曬青毛茶，再經(jīng)人工灑水，渥堆微生物發(fā)酵之后而成的后發(fā)酵茶類，具有獨(dú)特的風(fēng)味和顯著的保健功能，深受大眾喜愛[3-5]。

微生物是普洱茶后發(fā)酵的核心，對(duì)普洱茶的品質(zhì)產(chǎn)生至關(guān)重要的影響。不同原料、不同環(huán)境和不同的工藝造就了微生物的多樣性變化，通過微生物的代謝，產(chǎn)生多種生化產(chǎn)物，形成了普洱茶多樣化的風(fēng)味[6]。目前，關(guān)于普洱茶發(fā)酵微生物的研究多集中在真菌，如黑曲霉、青霉、木霉等[7-10]，對(duì)普洱茶發(fā)酵中細(xì)菌的研究較少。姚靜等人從普洱茶渥堆發(fā)酵過程中分離到芽胞桿菌屬、克雷伯氏菌屬、短桿菌屬、假單胞菌屬等7個(gè)屬的細(xì)菌[11]。王輝等人發(fā)現(xiàn)大理南澗鳳凰沱茶廠普洱茶堆中存在歐文氏菌屬、無色桿菌屬、芽胞桿菌屬、類芽胞桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬、短桿菌屬、葡萄球菌屬等優(yōu)勢(shì)細(xì)菌[12]。

對(duì)普洱茶微生物種類的研究主要依靠傳統(tǒng)的平板分離、純化等可培養(yǎng)的方法。但傳統(tǒng)方法存在數(shù)據(jù)不完整，不能全面揭示發(fā)酵過程中微生物的群落組成。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR-DGGE、克隆文庫(kù)等非培養(yǎng)技術(shù)[13-15]開始用于普洱茶發(fā)酵微生物群落研究。Illumina高通量測(cè)序是近年來新興起來的基于宏基因組的深度測(cè)序技術(shù)，能直接反映微生物群落構(gòu)成和多樣性，為環(huán)境、傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物解析提供了新的工具，具有通量高、全面、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)[16-17]。

本文基于高通量測(cè)序的非培養(yǎng)技術(shù)，并結(jié)合傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法對(duì)勐海普洱茶發(fā)酵各階段細(xì)菌種類、群落多樣性進(jìn)行了研究，旨在揭示普洱茶發(fā)酵過程中細(xì)菌群落組成和變化規(guī)律，為普洱茶生產(chǎn)工藝的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶葉樣品

普洱茶樣品采集自云南勐海百中堂茶莊(經(jīng)緯度E 100°27′13″，N 21°58′57″；海拔1 136 m；環(huán)境溫度19～30 ℃，濕度45%～97%)同一發(fā)酵茶堆的9個(gè)發(fā)酵節(jié)點(diǎn)，具體信息見表1。取樣方法：利用取樣釬在發(fā)酵堆5個(gè)位點(diǎn)(四周及中央)的表面和內(nèi)部(表面下約20 cm處)各取約200 g發(fā)酵茶樣品，置于取樣袋中充分混勻，冷鏈運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，將樣品分成兩等份，1份4 ℃保存，用于可培養(yǎng)方法分離菌種，1份-80 ℃保存，用于基因組DNA提取和高通量測(cè)序。

表1 樣品編號(hào)及描述Table 1 Numbers and description of samples

1.1.2 試劑與儀器

試劑：胰酪胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基,美國(guó)BD公司；磁珠基因組提取試劑盒，美國(guó)Omega Bio-Tek公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；PCR MasterMix、DL 2000 Marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

儀器：高速冷凍離心機(jī)(5424R)，德國(guó)Eppendorf公司；PCR儀(TRIO48)，德國(guó)Biometra公司；電泳儀(EC250-90)，美國(guó)BIO-RAD公司；恒溫培養(yǎng)箱(GHP-9160)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；測(cè)序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成；Illumina Miseq高通量測(cè)序由深圳華大基因科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 茶葉樣品可培養(yǎng)細(xì)菌的分離與鑒定

1.2.1.1 茶葉樣品可培養(yǎng)細(xì)菌的分離

將茶樣按四分法縮分后準(zhǔn)確稱取25 g，置于225 mL滅菌生理鹽水中，150 r/min振蕩1 h，制成10倍稀釋液，取1 mL 稀釋液于9 mL滅菌生理鹽水的試管中，依次稀釋后制成 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度梯度稀釋液，選取10-3、10-4、10-5、10-6四個(gè)稀釋度，用移液器分別吸取0.l mL稀釋液涂布于TSA平板培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度3個(gè)平行，于(28±1)℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落大小、形態(tài)和顏色等表型特征挑選優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行平板劃線分純，獲得純菌種，并于-80 ℃甘油管冷凍保藏備份。

1.2.1.2 茶葉樣品可培養(yǎng)細(xì)菌的分子鑒定

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取優(yōu)勢(shì)菌株DNA，以通用引物：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[18]擴(kuò)增菌株16S rDNA序列，再經(jīng)EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定[19]。反應(yīng)條件及序列數(shù)據(jù)比對(duì)分析參照ZHANG等人的方法[20]。

1.2.2 茶葉樣品的Illumina高通量測(cè)序分析

1.2.2.1 茶葉樣品DNA提取及高通量測(cè)序

液氮研磨結(jié)合磁珠法DNA提取試劑盒提取不同工藝階段茶葉樣品DNA，每個(gè)樣品重復(fù)提取3次并混勻。用微量核酸蛋白分析儀檢測(cè)DNA濃度及純度。采用細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[21]。利用Illumina高通量測(cè)序儀對(duì)茶樣DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.2.2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

利用Illumina MiSeq 2×250 bp paired-end 測(cè)序后，下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過濾，去除低質(zhì)量的reads，用高質(zhì)量的Clean data進(jìn)行后續(xù)分析[22]。通過軟件FLASH，將reads通過reads之間的Overlap關(guān)系拼接成Tags[23]。通過軟件USEARCH在97%的相似度下將Tags聚成操作分類單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)[24]。通過R(v3.1.1)語言中的VennDiagram包繪制Venn圖(不考慮OTU豐度，只考慮OTU有無)，給出樣品間共有OTU個(gè)數(shù)。通過軟件RDP classifer(v2.2)將OTU代表序列在數(shù)據(jù)庫(kù)(Greengene V201305; RDP Release9 201203)中比對(duì)，進(jìn)行OTU物種注釋[25]。通過軟件QIIME(v1.80)對(duì)樣品進(jìn)行組成差異分析并計(jì)算樣品間距離，以判斷各樣品物種組成的差異性[26]。基于OTU和物種注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種多樣性以及樣品間物種差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉樣品可培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的分離與鑒定

采用平板稀釋法，選擇合適稀釋度涂布的平板，根據(jù)菌落形態(tài)、大小、顏色等表型特征，挑取不同單菌落，再經(jīng)平板劃線分純，共獲得76株細(xì)菌菌株。經(jīng)16S rDNA序列測(cè)定及比對(duì)分析，獲得優(yōu)勢(shì)菌株的種屬名稱。部分優(yōu)勢(shì)菌株的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)見圖1，不同茶樣獲得優(yōu)勢(shì)菌株的16S rDNA鑒定結(jié)果見表2，序列登錄號(hào)MG557666～MG557688。

9個(gè)樣品分離到細(xì)菌18個(gè)屬，30個(gè)種，共計(jì)76株。分離到的優(yōu)勢(shì)菌主要分布在微桿菌屬(Microbacteriumsp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)、小短桿菌屬(Brachybacteriumsp.)、考克氏菌屬(Kocuriasp.)、泛菌屬(Pantoeasp.)、芽胞桿菌屬(Bacillussp.)等。發(fā)酵起始階段曬青毛茶原料(G2)溶出大量?jī)?nèi)生菌，分離到的細(xì)菌種類較多。隨著發(fā)酵開始，環(huán)境微生物和暴露的內(nèi)生細(xì)菌在外界溫濕度條件下，選擇性增殖，此消彼長(zhǎng)。渥堆發(fā)酵開始后至發(fā)酵7 d(G3、G4)，主要優(yōu)勢(shì)菌逐漸集中在泛菌屬(Pantoeasp.)、Pluralibactergergoviae和假單胞菌屬(Pseudomonassp.)。發(fā)酵15 d(G5)優(yōu)勢(shì)菌群轉(zhuǎn)變?yōu)槲U菌屬(Microbacteriumsp.)和葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)，并穩(wěn)定維持到發(fā)酵完成(G10)，提示這2種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌對(duì)于普洱茶后發(fā)酵的作用需要重點(diǎn)研究。另外，16S rDNA鑒定結(jié)果表明，分離到的微桿菌屬(Microbacteriumsp.)優(yōu)勢(shì)菌株均為新種，小短桿菌屬(Brachybacteriumsp.)、考克氏菌屬(Kocuriasp.)和泛菌屬(Pantoeasp.)也分布有新種，這些發(fā)酵普洱茶中發(fā)現(xiàn)的潛在新種資源在國(guó)際上尚屬首次，對(duì)其功能和分類研究具有重要意義。

圖1 部分優(yōu)勢(shì)菌株的菌落形態(tài)(a)及顯微形態(tài)(b)Fig.1 Colony morphology and microscopic morphology of some dominant strains

表2 不同茶樣分離的優(yōu)勢(shì)菌種Table 2 The dominant species isolated from different tea samples

樣品編號(hào)菌落總數(shù)/(CFU·g-1)優(yōu)勢(shì)菌種G21.5×105Kocuria palustris、Kocuria koreensis、Pantoea sp.、Oceanobacillus iheyensis、Brevibacterium sp.、Brachybacteri-um sp.、Bacillus sp.、Brevundimonas sp.、Paracoccus yeei、Pseudomonas sp.G36.3×108Pantoea sp.、Pluralibacter gergoviae、Pseudomonas sp.、Brachybacterium sp.、Klebsiella sp. G45.0×109Pantoea sp.、Pluralibacter gergoviae、Pseudomonas sp.G56.5×109Listeria grayi、Kocuria koreensis、Microbacterium sp.、Staphylococcus sp.、Alcaligenes sp.、Serratia sp.、Mi-crococcus sp. G62.3×109Microbacterium sp.、Staphylococcus sp.、Brachybacterium sp.G7/Microbacterium sp.、Staphylococcus sp.、Brachybacterium sp.G8/Microbacterium sp.、Staphylococcus sp.、Brachybacterium sp.G9/Microbacterium sp.、Staphylococcus sp.、Paracoccus communisG103.3×109Kocuria koreensis、Microbacterium sp.、Staphylococcus sp.

2.2 茶葉樣品的Illumina高通量測(cè)序分析

2.2.1 OTU統(tǒng)計(jì)及物種注釋

利用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)9個(gè)發(fā)酵時(shí)間節(jié)點(diǎn)的茶樣DNA PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)軟件拼接、過濾等處理后，9個(gè)樣品共獲得246 297條序列。在97%相似度下將其聚類用于物種分類的OTU(Operational Taxonomic Units)， 9個(gè)樣品共產(chǎn)生212個(gè)OTU。OTU的venn圖(圖2)直觀展示了樣品間OTU的重疊情況。通過分析，G2、G4、G5、G6和G7共有的OTU為22；G6、G7、G8、G9和G10共有的OTU為77；G7、G8、G9和G10共有的OTU為88；G8、G9和G10共有的OTU為89，分別占這3個(gè)樣品細(xì)菌OTU的62%、66%和75%；G9和G10共有的OTU為95，占這2個(gè)樣品細(xì)菌OTU的70%和80%。說明隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物群落構(gòu)成趨于穩(wěn)定。

圖2 OTU venn分析Fig.2 OTU venn analysis

將OTU代表序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，進(jìn)行物種注釋。9個(gè)樣品的細(xì)菌主要分布在61個(gè)屬，28個(gè)科，4個(gè)門(放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria))。

2.2.2 發(fā)酵不同階段的菌落構(gòu)成及豐度

根據(jù)OTU在發(fā)酵不同階段的每個(gè)樣品的豐度信息，計(jì)算出每個(gè)OTU在各個(gè)樣品中的相對(duì)豐度(即各種細(xì)菌物種所占樣品細(xì)菌總數(shù)的比例)。結(jié)果如圖3和表3所示。

其中屬水平豐度>5%的有12個(gè)屬：乳桿菌屬(Lactobacillussp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)、考克氏菌屬(Kocuriasp.)、土地桿菌屬(Pedobactersp.)、草螺菌屬(Herbaspirillumsp.)、短桿菌屬(Brevibacteriumsp.)、歐文氏菌屬(Erwiniasp.)、泛菌屬(Pantoeasp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、芽胞桿菌屬(Bacillussp.)、腸桿菌屬(Enterobactersp.)和小短桿菌屬(Brachybacteriumsp.)。

圖3 樣品屬水平的物種profiling堆積柱狀圖Fig.3 Profiling stack column of the sample at the levelof the genus

表3 發(fā)酵不同階段各樣品優(yōu)勢(shì)菌屬及豐度Table 3 Dominant genera and abundance of samples in different stages of fermentation

樣品編號(hào)OTU數(shù)目?jī)?yōu)勢(shì)菌種及豐度G2111Lactobacillus sp.(15%); Staphylococcus sp.(11%); Kocuria sp.(9%); Pedobacter sp.(9%); Herbaspirillum sp.(8%); Brevibacterium sp.(7%); Brachybacterium sp. (4%)G350Erwinia sp.(58%); Pantoea sp. (23%); Pseudomonas sp. (13%)G439Erwinia sp.(38%); Pantoea sp. (32%); Pseudomonas sp. (29%)G599Bacillus sp. (26%); Brevibacterium sp. (17%); Staphylococcus sp. (15%); Enterobacter sp. (11%); Kocuria sp. (10%); Brachybacterium sp. (7%); Microbacterium sp. (1%)G6105Bacillus sp.(46%); Brevibacterium sp. (12%); Staphylococcus sp. (10%); Kocuria sp. (6%); Brachybacterium sp. (3%); Microbacterium sp. (2%)G7179Staphylococcus sp.(17%); Bacillus sp.(15%); Kocuria sp. (11%); Brevibacterium sp. (11%); Brachybacterium sp. (4%)G8143Staphylococcus sp.(23%); Bacillus sp.(18%);Brevibacterium sp. (15%); Kocuria sp. (14%);Brachybacterium sp. (7%)G9135Staphylococcus sp.(25%); Kocuria sp. (19%); Brevibacterium sp. (15%); Bacillus sp.(17%); Brachybacterium sp. (3%)G10119Kocuria sp. (31%); Staphylococcus sp.(23%); Brevibacterium sp. (15%); Bacillus sp.(10%); Brachybacterium sp. (4%)

曬青毛茶原料樣品(G2)菌落構(gòu)成較為豐富，包括乳桿菌屬(Lactobacillussp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)、考克氏菌屬(Kocuriasp.)、土地桿菌屬(Pedobactersp.)、草螺菌屬(Herbaspirillumsp.)及短桿菌屬(Brevibacteriumsp.)。渥堆發(fā)酵開始后(G3、G4)，革蘭氏陰性的歐文氏菌、泛菌屬和假單胞菌大量繁殖，占90%以上。渥堆發(fā)酵15 d至發(fā)酵完成(G5至G10)，葡萄球菌、芽胞桿菌、考克氏菌、短桿菌成為整個(gè)發(fā)酵中、后期的優(yōu)勢(shì)菌群，優(yōu)勢(shì)菌種此消彼長(zhǎng)。而短桿菌和小短桿菌在整個(gè)過程中相對(duì)維持穩(wěn)定(分別約占菌群15%和5%)。發(fā)酵中期(發(fā)酵15 d(G5)、發(fā)酵21 d(G6))，芽胞桿菌最為優(yōu)勢(shì)。發(fā)酵后期(發(fā)酵29～41 d(G7、G8、G9))，芽胞桿菌優(yōu)勢(shì)度逐漸下降，葡萄球菌躍升為最優(yōu)勢(shì)菌，考克氏菌逐漸增加。發(fā)酵完成(G10)，葡萄球菌維持穩(wěn)定，芽胞桿菌優(yōu)勢(shì)度繼續(xù)下降，考克氏菌進(jìn)一步增殖，成為最優(yōu)勢(shì)菌種。

2.2.3 樣品間物種組成差異分析

根據(jù)各樣品差異性的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，對(duì)樣品進(jìn)行Beta多樣性(Beta diversity)分析，比較樣品間在物種多樣性方面存在的差異大小，見圖4。采用Bray-Curtis距離作為衡量群落之間差異性的指標(biāo)，Bray-Curtis距離值在0～1之間，值越大表示樣品間的差異越大。 由圖4可知，發(fā)酵前期樣品(G3、G4)差異最小，發(fā)酵中期樣品(G5、G6)組成相似，發(fā)酵后期樣品(G7、G8、G9和G10)聚為一支，組成相似。

圖4 樣品Beta多樣性熱圖Fig.4 Beta diversity heatmap of samples

3 討論

通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法，從勐海普洱茶發(fā)酵不同節(jié)點(diǎn)的9個(gè)樣品中共分離得到18個(gè)屬，30個(gè)種，其中優(yōu)勢(shì)菌屬有微桿菌屬(Microbacteriumsp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)、小短桿菌屬(Brachybacteriumsp.)、考克氏菌屬(Kocuriasp.)、泛菌屬(Pantoeasp.)和芽胞桿菌屬(Bacillussp.)等。16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)這些優(yōu)勢(shì)屬中分布有一定數(shù)量的新種，這在以往的普洱茶研究中尚未見報(bào)道。深入研究和挖掘這些新種在微生物分類學(xué)和發(fā)酵普洱茶微生物資源的保護(hù)方面具有積極意義。

通過高通量測(cè)序方法，9個(gè)樣品共解析到細(xì)菌61個(gè)屬，212個(gè)OTU，包含了培養(yǎng)方法分離到的菌種對(duì)應(yīng)的屬級(jí)分類單元，可見與傳統(tǒng)方法相比，高通量測(cè)序更全面地揭示了發(fā)酵普洱茶樣品的細(xì)菌群落構(gòu)成。高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析顯示：曬青毛茶原料的菌落構(gòu)成較為豐富，包括乳桿菌屬(Lactobacillussp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)、考克氏菌屬(Kocuriasp.)等；而發(fā)酵前期以革蘭氏陰性的歐文氏菌屬(Erwiniasp.)、泛菌屬(Pantoeasp.)和假單胞菌屬(Pseudomonassp.)為主；而發(fā)酵中后期芽胞桿菌屬(Bacillussp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)、短桿菌屬(Brevibacteriumsp.)、考克氏菌屬(Kocuriasp.)及小短桿菌屬(Brachybacteriumsp.)為優(yōu)勢(shì)菌群穩(wěn)定存在，約占樣品群落組成的75%。

本研究對(duì)勐海百中堂茶廠普洱微生物的研究與其他學(xué)者的研究結(jié)論具有一定的一致性同時(shí)又有獨(dú)特性。歐文氏菌、假單胞菌、芽胞桿菌、微桿菌等均為常見的植物內(nèi)生菌，隨著渥堆發(fā)酵的進(jìn)行，溫濕度、含氧量、原料基質(zhì)理化特征發(fā)生變化，優(yōu)勢(shì)菌群也隨之改變。王輝[12]等人對(duì)云南南澗鳳凰沱茶廠發(fā)酵普洱茶的研究中發(fā)現(xiàn)：除了葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)、芽胞桿菌屬(Bacillussp.)、短桿菌屬(Brevibacteriumsp.)等優(yōu)勢(shì)菌外，歐文氏菌屬(Erwiniasp.)在整個(gè)發(fā)酵不同階段不同茶樣層間均表現(xiàn)優(yōu)勢(shì)。而本研究?jī)H在發(fā)酵前期發(fā)現(xiàn)歐文氏菌屬(Erwiniasp.)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(38%～58%)。姚靜[11]等人通過分離培養(yǎng)法，發(fā)現(xiàn)芽胞桿菌屬(Bacillussp.)在普洱茶發(fā)酵中所占比例遠(yuǎn)大于其他細(xì)菌，處絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位。葛慈斌[27]等人的研究發(fā)現(xiàn)多種芽胞桿菌是普洱茶發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)菌群。芽胞桿菌能夠適應(yīng)不同的環(huán)境條件，可兼性厭氧生長(zhǎng)，在高溫缺氧條件下以芽胞的形式存活，因此在整個(gè)普洱茶發(fā)酵加工過程中優(yōu)勢(shì)存在。研究表明芽胞桿菌又是產(chǎn)生多種生物酶類的重要來源，其分泌的多酚氧化酶能夠?qū)ⅫS烷醇類及其糖苷類底物轉(zhuǎn)化為如雙黃烷醇、茶黃素、茶紅素等，在黑茶風(fēng)味和成色的形成中起著重要作用[28]。葡萄球菌是發(fā)酵中后期的優(yōu)勢(shì)菌種，具有有氧呼吸和無氧發(fā)酵的能力，能提高過氧化氫酶活力，促進(jìn)耗氧，抑制酸敗微生物。據(jù)報(bào)道，S.carnosus、S.sciuri、S.xylosus、S.kloosii等葡萄球菌具有產(chǎn)大量支鏈醛、甲基酮和脂肪酸乙酯等芳香成分、硝酸鹽還原和蛋白酶降解等能力[29-35]。據(jù)國(guó)際乳品聯(lián)合會(huì)發(fā)布的歐美各國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的微生物名單(IDF 455-2012)，其中有多種葡萄球菌(S.carnosus、S.cohnii、S.condimenti、S.equorum、S.fleurettii、S.piscifermentans、S.saprophyticus、S.sciuri、S.succinus、S.vitulinus、S.warneri和S.xylosus)作為肉類、乳制品和豆類的發(fā)酵菌種，并有悠久的安全食用歷史。本研究在發(fā)酵普洱茶中也分離到其中的S.sciuri和S.xylosus這2種葡萄球菌，其中S.xylosus也已于2016年被列入我國(guó)《可用于食品的菌種名單》。研究發(fā)現(xiàn)這些發(fā)酵食品中的葡萄球菌具有產(chǎn)芳香風(fēng)味、硝酸鹽還原和蛋白酶降解等能力[29-32]。本研究分離到的S.kloosii最早由SCHLEIFER等人于1984年發(fā)現(xiàn)并命名[36]，在許多發(fā)酵食品，如豆豉[37]、豆醬[38]、Inyu(黑豆醬)[29]、Miso[39]發(fā)酵過程中均有分離到該菌種。陳廷濤發(fā)現(xiàn)在傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中也有S.gallinarum[37]。本研究分離到的其他優(yōu)勢(shì)菌屬在一些傳統(tǒng)發(fā)酵食品中也有報(bào)道，如Kocuriakoreensis在韓國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵海產(chǎn)品(comb pen shell)中被發(fā)現(xiàn)[40]，Microbacteriumgubbeenense存在于斑點(diǎn)成熟奶酪的表層[41]。此外，Brachybacteriumzhongshanense報(bào)道具有纖維素分解能力[42]。其他優(yōu)勢(shì)菌種短桿菌屬、微桿菌屬、考克氏菌屬菌種多以新種的形式存在，其在發(fā)酵過程中的作用有待進(jìn)一步研究。鑒于安全性考慮，發(fā)酵普洱茶中的這些優(yōu)勢(shì)菌種的功能、酶學(xué)特性及安全性評(píng)價(jià)是下一步研究的重點(diǎn)。