釀酒葡萄品種遺傳多樣性的簡單序列重復(fù)分析和分子身份證的建立

馬文瑞，嚴(yán)密，劉業(yè)偉，江偉，全莉，王雪薇，武運*，薛潔*

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015) 3(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京，100083)

葡萄屬于葡萄科(Vitaceae)葡萄屬(VitisL.)，分布于世界溫帶、亞熱帶，不僅可以鮮食，還能釀酒、制汁和制干，是重要的經(jīng)濟(jì)作物[1-2]?，F(xiàn)在有一定栽培面積的優(yōu)良品種主要為赤霞珠、美樂、霞多麗等[3-5]。隨著我國葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展，每年還有新品種不斷引進(jìn)，因此進(jìn)行釀酒葡萄種質(zhì)資源鑒定保護(hù)和葡萄酒鑒偽是我國葡萄酒行業(yè)規(guī)范發(fā)展和質(zhì)量監(jiān)控的重要措施。

葡萄繁殖方式主要為無性繁殖，不同葡萄酒產(chǎn)區(qū)間互相引種，并對外來優(yōu)良新品種的引進(jìn)，出現(xiàn)同名異物，同物異名等品種混淆問題，又因葡萄種間雜交過程中產(chǎn)生中間型和過渡型雜種的概率較高[6]。面對葡萄品種間極其豐富的多樣性變異，傳統(tǒng)的鑒定方法已經(jīng)受到諸多限制，然而DNA指紋圖譜技術(shù)的發(fā)展解決了這一問題。該技術(shù)能夠從分子水平檢測基因組中的遺傳信息和序列多態(tài)性，兼?zhèn)涮禺愋院头€(wěn)定性都較高的特點，能夠快速對親緣關(guān)系較近的種質(zhì)個體進(jìn)行鑒定[7]。

簡單序列重復(fù) (simple sequence repeats, SSR)技術(shù)也稱微衛(wèi)星技術(shù)，是目前廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源鑒定、保護(hù)、遺傳多樣性分析和遺傳圖譜建立等方面的DNA指紋圖譜分析技術(shù)。該技術(shù)具有共顯性、靈敏度高、多態(tài)性高和重復(fù)性好等優(yōu)點，可為植物種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，建立品種SSR指紋圖譜提供便利[8-9]。溫景輝等人利用SSR標(biāo)記技術(shù)對20份葡萄原料進(jìn)行了種質(zhì)親緣關(guān)系分析，所有種質(zhì)總共分為4大類群，其中，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的類群是山葡萄與歐亞種、美洲雜種，親緣關(guān)系較近的類群是歐亞種與美洲種[10]。劉偉等人利用15對SSR引物對 21 種不同類型葡萄種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對其遺傳多樣性進(jìn)行了分析，SSR標(biāo)記技術(shù)能夠從分子水平上解析不同類型葡萄種質(zhì)的遺傳差異性，并能揭示材料間親緣關(guān)系[11]。王慧玲等人利用9對SSR引物對13個新葡萄品種進(jìn)行SSR分析，最終得到所有品種分子身份證，能夠?qū)⑺泄┰嚥牧嫌行^(qū)分[12]。樊秀彩等人篩選出能擴(kuò)增出父本特異性條帶的7對SSR引物對239株山葡萄和河岸葡萄的雜交后代進(jìn)行鑒定，161株后代具有父本的特異性條帶，另外，后代中還出現(xiàn)了新的條帶，表明雜交后代產(chǎn)生了豐富的變異[13]。

本研究選取新疆天山北麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)10個優(yōu)良紅白釀酒葡萄品種為試材，利用SSR標(biāo)記分析技術(shù)，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠擴(kuò)增片段圖譜，分析紅白釀酒葡萄品種之間的親緣關(guān)系，建立10個釀酒葡萄品種的分子身份證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取新疆天山北麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的10個優(yōu)良釀酒葡萄品種果實(表1)，置于-80 ℃冰箱貯藏備用。

表1 十個釀酒葡萄品種及其分子身份證編碼Table 1 Ten Vitis vinifera varieties and its molecular ID

10×PCR buffer[100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2]，dNTPs，TaqDNA聚合酶和6×Loading Buffer等購買于TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；D2000 DNA marker購買于天根生化科技(北京)有限公司；所有PCR引

物，毛細(xì)管電泳所用引物5′-FAM(藍(lán)色)標(biāo)記均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；HIDI，LIZ500購買于美國 ABI 公司；其他試劑均為分析純購自北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

測序列分析儀(3730XL)，美國 ABI 公司；VeritiTM96-Well Thermal Cycler 梯度PCR儀，美國ABI公司；垂直電泳槽(JY-CZ-BL)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；電泳儀(BG-Power600)，北京百晶生物技術(shù)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 1600)，天能科技(上海)有限公司；BioSpec-nano核酸蛋白檢測儀，德國Eppendorf公司；微量移液器，德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒葡萄品種總DNA提取及質(zhì)量檢測

根據(jù)葡萄特性，將傳統(tǒng)的十六烷基三甲基溴化銨法(hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)進(jìn)行改良，有效提高了葡萄總DNA的質(zhì)量。具體步驟參考齊玲倩等人的《水果果肉中總DNA提取方法的比較研究》[14]。使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的片段大小和質(zhì)量，并使用核酸蛋白儀檢測樣品總DNA的濃度和純度，將樣品濃度稀釋至40 ng/μL。

1.3.2 PCR擴(kuò)增和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

本研究根據(jù)葡萄公共遺傳圖譜NCBI，確定選用12對國際通用的SSR引物用于PCR擴(kuò)增，引物序列見表2。

表2 十二對SSR引物及其退火溫度Table 2 Twelve sequence and annealing temperature of SSR primer

注：F-上游引物；R-下游引物；Tm-退火溫度。

釀酒葡萄普通SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，采用25 μL反應(yīng)體系，其中包含有Mg2+濃度2.5 mmol/L，dNTPs為0.15 mmol/L，Taq酶為1.5 U，引物為0.5 μmol/L，DNA含量為40 ng/25 μL，剩余用雙蒸水補(bǔ)足[18]。

SSR-PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，退火溫度60 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。

SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，200 V，120 min。銀染顯色主要操作如下：染色 15 min，蒸餾水沖洗1～2次，顯色5 min，再次用蒸餾水沖洗1～2次，直至條帶清晰為止。

1.3.3 PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測

綜合1.3.2非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜結(jié)果和經(jīng)濟(jì)成本角度考慮，最終選取多態(tài)性良好，重復(fù)性較好的5對SSR引物進(jìn)行正向引物的5′-FAM標(biāo)記，它們分別是VrZAG62，VrZAG79， VVMD5，VVMD27和VVS2。

釀酒葡萄SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，采用25 μL反應(yīng)體系，其中包含有Mg2+濃度2.0 mmol/L，dNTPs為0.2 mmol/L，Taq酶為1.0 U，引物為0.5 μmol/L，DNA含量為40 ng/25 μL，剩余用雙蒸水補(bǔ)足。SSR-PCR反應(yīng)程序第一階段：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s， 60 ℃退火30 s ，72 ℃延伸30 s，共10個循環(huán)。第二階段：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共20個循環(huán)，最后72 ℃修復(fù)延伸6 min。

SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，采用毛細(xì)管電泳法進(jìn)行檢測。具體步驟如下：吸取990 μL HIDI和10 μL LIZ500進(jìn)行混勻，然后吸取10 μL混合物加入到96孔反應(yīng)板中；迅速將96孔板置于平板離心機(jī)中，離心到500×g結(jié)束；對照上機(jī)檢測表，在96孔板對應(yīng)的孔中加入相對應(yīng)的50 pg樣品；再次將96孔板置于平板離心機(jī)中，離心到500×g結(jié)束；使用封板膜密封96孔板，振蕩，再次離心到500×g結(jié)束；置于PCR儀中；變性程序為98 ℃，5 min，不加熱蓋，程序結(jié)束后立即冷卻96孔板；然后將96孔板置于平板離心機(jī)中，離心到2 000×g結(jié)束；最后將PCR產(chǎn)物使用ABI 3730XL全自動基因分析儀進(jìn)行檢測分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

SSR-PCR產(chǎn)物通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染后拍照，根據(jù)電泳圖譜多態(tài)性條帶并賦值分析。相同電泳遷移率下的清晰條帶賦值為“1”，無擴(kuò)增條帶的記為“0”，擴(kuò)增條帶不清晰將不進(jìn)行統(tǒng)計，最終得到0/1數(shù)據(jù)矩陣結(jié)果，再利用NTSYSpc2.10e軟件進(jìn)行后續(xù)分析，不同釀酒葡萄品種之間的遺傳相似系數(shù)利用NTSYSpc2.10e軟件得出結(jié)果。首先利用軟件中Similarity中的Qualitative Date功能計算不同品種間的遺傳相似系數(shù)，然后采用非加權(quán)類平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean, UPGMA)進(jìn)行聚類分析，最終利用Graphics功能得出聚類分析樹狀圖。根據(jù)SSR-PCR非變性聚丙烯酰胺凝膠圖譜，將所有品種不用引物的譜帶進(jìn)行有序編碼轉(zhuǎn)換，建立10個釀酒葡萄品種的分子身份證。根據(jù)每對引物對不同品種有效譜帶分子量大小，從小到大有序編碼為1～9，如果條帶數(shù)超過9條，依次增加A～Z進(jìn)行編碼。如果SSR引物在其中一個樣品中擴(kuò)增出多個等位片段，選擇分子量較小的分子量對其編碼[19]。

根據(jù)ABI 3730XL出現(xiàn)的峰圖與內(nèi)標(biāo)LIZ500 進(jìn)行比較，根據(jù)峰面積和出峰時間得出每個樣品在SSR位點的片段大小，使用Genemapper軟件分析樣品SSR數(shù)據(jù)，具體分析步驟參照尹玲等人的《我國新育成葡萄品種SSR指紋圖譜的建立》[20]。最終得出釀酒葡萄品種在SSR位點的熒光指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多態(tài)性分析

根據(jù)葡萄果實特性改良的 CTAB法提取總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白儀測定樣品DNA的質(zhì)量，結(jié)果顯示樣品的DNA 的濃度和純度已達(dá)到SSR分子標(biāo)記要求，并將所有樣品的DNA濃度稀釋至40 ng/μL。SSR-PCR的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜顯示，所有品種擴(kuò)增條帶清晰。本試驗利用12對SSR引物在供試材料中檢測到56個等位基因，SSR引物擴(kuò)增的條帶范圍為13～28條，平均17.75條。片段長度介于100～800 bp，200～500 bp擴(kuò)增片段較多。引物VVMD27擴(kuò)增出 13 條條帶，是擴(kuò)增條帶數(shù)最少的引物；VVMD8是擴(kuò)增條帶數(shù)最多的引物，多達(dá) 28 條。引物 VrZAG64擴(kuò)增片段分子量范圍最大，為150～800 bp；引物 VVS2擴(kuò)增片段分子量范圍最小，為140～340 bp。12對SSR引物共擴(kuò)增213條擴(kuò)增片段，均為多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率為 100%，具體見表3。

2.2 釀酒葡萄品種的遺傳相似系數(shù)分析

本研究根據(jù)圖譜結(jié)果，得出 0/1矩陣統(tǒng)計結(jié)果，對不同品種之間的遺傳距離進(jìn)行了計算，結(jié)果見表4。10個釀酒品種中，不同樣品間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.67～0.85之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.76。其中“赤霞珠”和“美樂”之間遺傳相似系數(shù)最高，為0.85，“小芒森”與“貴人香”，遺傳相似系數(shù)相對最低，為0.67。

表3 不同SSR引物對10個釀酒葡萄品種的SSR-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性比較Table 3 Comparison of the polymorphism of SSR-PCR amplified products of 10 Vitis vinifera varieties withdifferent SSR primers

2.3 不同釀酒葡萄品種的SSR聚類分析

以所有樣品的擴(kuò)增圖譜為基礎(chǔ)，根據(jù)0/1數(shù)據(jù)矩陣結(jié)果，使用NTSYSpc2.10e軟件進(jìn)行UPGMA法聚類分析得出 10個釀酒葡萄品種的聚類樹狀圖，見圖1。結(jié)果顯示10個樣品在遺傳相似系數(shù) 0.73處產(chǎn)生了分離，將所有10份試驗樣品分成 2類。

第 1個大類包含有所有的紅葡萄品種，占所有樣品的70%，當(dāng)遺傳相似系數(shù)是0.76時，又分成了3個亞類，第1個亞類是“赤霞珠”和“美樂”，第2個亞類是“蛇龍珠”和“品麗珠”，均為歐亞種，這4個品種相對較近，原因是“品麗珠”是“赤霞珠”，“美樂”和“蛇龍珠”的親本之一。第3個亞類是“西拉”，“馬瑟蘭”和“小芒森”，其親緣關(guān)系與第1和第2個亞類相對較遠(yuǎn)。

第2個大類包含白葡萄品種和麝香葡萄，在遺傳相似系數(shù) 0.78時，又分成了2個亞類，第1個亞類有“霞多麗”和“貴人香”，第2個亞類是“玫瑰香”，單獨為一個分支。

表4 十個釀酒葡萄品種的遺傳相似系數(shù)Table 4 Genetic diversity of 10 Vitis vinifera varieties

圖1 基于SSR標(biāo)記的10個釀酒葡萄品種聚類分析樹狀圖Fig.1 UPGMA dendrogram of 10 Vitis vinifera varieties based on SSR results

2.4 釀酒葡萄品種分子身份證構(gòu)建

12對引物對10個釀酒葡萄品種擴(kuò)增的等位基因譜帶大小分布范圍及賦值標(biāo)準(zhǔn)見表5。用篩選出的12對引物按照多樣性指數(shù)由低到高的順序進(jìn)行區(qū)分，其中前6對引物就可以區(qū)分所有的試驗樣品，并構(gòu)建了10個釀酒葡萄品種分子身份證編碼，具體見表1。在所有引物擴(kuò)增的結(jié)果中，每個品種最少有1個特異等位基因，如引物VrZAG79擴(kuò)增結(jié)果顯示，“赤霞珠”，“美樂”，“西拉”，“馬瑟蘭”和“霞多麗”均有1個特異等位基因。如引物VVS2擴(kuò)增結(jié)果顯示，“霞多麗”，“貴人香”，“玫瑰香”，“小芒森”，“蛇龍珠”，“西拉”和“馬瑟蘭”均有1個特異等位基因。

2.5 釀酒葡萄品種熒光標(biāo)記DNA指紋圖譜的建立

5對5′-FAM標(biāo)記的SSR引物VrZAG62，VrZAG79， VVMD5，VVMD27和VVS2，對所有供試品種進(jìn)行毛細(xì)管電泳?；诿總€引物 PCR 產(chǎn)物片段大小，根據(jù)毛細(xì)管電泳峰圖的峰型以及每個峰值的大小建立，10個不同釀酒葡萄品種基于5對SSR 引物的分子標(biāo)記圖譜，圖2為部分釀酒葡萄品種在熒光標(biāo)記VrZAG79位點上的毛細(xì)管電泳譜圖。

表5 不同SSR引物對10個釀酒葡萄品種的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小及賦值標(biāo)準(zhǔn)Table 5 Alleles size range amplified of 10 Vitis vinifera varieties by SSR and encoded standard

圖2 部分釀酒葡萄品種在熒光標(biāo)記VrZAG79位點上的毛細(xì)管電泳圖譜Fig.2 Capillary electrophoresis of VrZAG79 loci for some Vitis vinifera varieties

3 討論與結(jié)論

隨著分子標(biāo)記技術(shù)和基因測序技術(shù)的快速發(fā)展，隨機(jī)擴(kuò)增片段多態(tài)性(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP) 、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP) 、SSR、簡單序列重復(fù)區(qū)間(inter-simple sequence repeat, ISSR)和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)等分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于物種的起源、演化以及遺傳變異等相關(guān)研究，在水稻[21]、大麥[22]、玉米[23]、苦瓜[24]、杏[25]、桃[26]等許多材料上均有報道。相對于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)標(biāo)記技術(shù)，分子標(biāo)記技術(shù)對物種的親緣關(guān)系進(jìn)行分析更加直接準(zhǔn)確。SSR標(biāo)記是一種共顯性分子標(biāo)記，其檢測所需DNA量少，且耗時短，多態(tài)性好，重復(fù)性好，信息量大，能夠高效精準(zhǔn)地對親緣關(guān)系相對較近的品種或個體進(jìn)行分析鑒定，從而在葡萄種質(zhì)遺傳多樣性分析，葡萄品種資源保護(hù)鑒定和DNA指紋圖譜構(gòu)建等方面得到了較廣泛的應(yīng)用。但應(yīng)用 SSR標(biāo)記進(jìn)行紅白釀酒葡萄品種間的遺傳多樣性和指紋圖譜建立研究相對較少，同時由于釀酒葡萄種質(zhì)的親緣關(guān)系較近，仍有很多優(yōu)良種質(zhì)未得到評價與鑒定。本研究特選取紅白釀酒葡萄品種進(jìn)行品種間遺傳多樣性分析和分子身份證的建立[27]。

種質(zhì)資源的遺傳多樣性能夠反映個體在特定生長環(huán)境下基因的豐富程度，是品種種質(zhì)研究工作中的基礎(chǔ)，因此品種間親緣關(guān)系分析和指紋圖譜構(gòu)建對于品種選育，鑒定和保護(hù)有重要意義[28]。郭印山等人利用49對SSR引物對20 份葡萄材料進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，研究數(shù)據(jù)顯示，遺傳相似系數(shù)為0.672時，所有葡萄品種分為3大類群。第1大類包括2份歐美雜種和1份美洲種；第2大類為8份歐亞種葡萄品種；第三大類包括2份山歐雜種和2份山葡萄品種[29]。董志剛等人采用SSR標(biāo)記技術(shù)對15份葡萄種質(zhì)進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果顯示，將其分成兩大類，第1大類是山歐雜種，第2大類是歐亞種和歐美雜種[30]。由以上前人研究結(jié)果可見，歐亞種和美洲種這2個葡萄種質(zhì)類群的親緣關(guān)系相對較近，而山葡萄與二者親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。本試驗以10個紅白釀酒葡萄品種為試材，利用SSR標(biāo)記探討紅白釀酒葡萄品種的親緣關(guān)系，聚類分析結(jié)果顯示，所有試驗釀酒葡萄品種親緣關(guān)系較近，在遺傳相似系數(shù) 0.73處產(chǎn)生了分離，將所有樣品分成 2類，第1大類包含所有紅葡萄品種，第2大類包含所有白葡萄品種。其中小芒森聚為第1大類，原因可能是其親本之一為紅葡萄品種。

利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建葡萄品種的 DNA 指紋圖譜，可為保護(hù)優(yōu)良葡萄品種種質(zhì)資源、鑒定和檢測葡萄品種及其葡萄酒真實性和純度提供了客觀科學(xué)的參考依據(jù)。DNA指紋圖譜分析常用的方法為特征譜帶法和引物組合法，兩者結(jié)合則大大提高了鑒別效率。成冰等人利用14對SSR引物對13個釀酒白葡萄品種進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示特異性條帶率為25.00%，其中，VrZAG79條帶總數(shù)，多態(tài)性條帶和特異性條帶均為最多，且所有品種的遺傳差異性較大。2個引物VrZAG62和VVIb66可分別鑒定所有試驗品種[31]。杜晶晶等人利用9對引物對80份葡萄種質(zhì)資源進(jìn)行分子身份證編碼，并能夠區(qū)分所有品種，表明 SSR 標(biāo)記技術(shù)可以高效鑒定葡萄品種[19]。尹玲等人對國內(nèi)24個新葡萄品種，利用6對SSR熒光標(biāo)記引物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，能夠明確區(qū)分所有供試品種，并建立其指紋圖譜[20]。本試驗利用6對SSR引物對10個紅白釀酒葡萄品種進(jìn)行等位基因賦值并構(gòu)建了供試材料的分子身份證編碼，其中，10個品種均有特征性引物，VVS2是7個品種的特征性引物。同時篩選出5對多態(tài)性高，穩(wěn)定性好的SSR引物熒光標(biāo)記并進(jìn)行毛細(xì)管電泳，得出10個釀酒葡萄品種的SSR標(biāo)記的熒光圖譜。

本試驗利用12對SSR引物對10個釀酒葡萄品種進(jìn)行了遺傳多樣性研究，由親緣關(guān)系遠(yuǎn)近將其分成2個類群。并依據(jù)所有樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜，選用6對引物對所有試驗材料進(jìn)行了分子身份證編碼，研究表明 SSR標(biāo)記從分子水平上解析了紅白釀酒葡萄品種的遺傳多樣性，一定程度上對釀酒葡萄品種選育，鑒定和保護(hù)有重要意義。同時，采用了5＇-FAM熒光標(biāo)記 SSR引物和毛細(xì)管電泳技術(shù)，最終得出的10個釀酒葡萄品種的SSR熒光圖譜，有利于豐富國際葡萄品種數(shù)據(jù)庫，也對葡萄品種及其葡萄酒真實性和純度的檢測提供了參考依據(jù)。