高通量測(cè)序技術(shù)在環(huán)境微生物領(lǐng)域的應(yīng)用與進(jìn)展

艾 鑠， 張麗杰,b， 肖芃穎， 張曉鳳， 邢志林

(重慶理工大學(xué) a.化學(xué)化工學(xué)院; b.藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 重慶 400054)

環(huán)境微生物決定了自然生態(tài)功能的強(qiáng)弱和特性，在能量流動(dòng)、物質(zhì)循環(huán)和系統(tǒng)穩(wěn)定性維持等方面起著舉足輕重的作用[1-2]，對(duì)環(huán)境污染評(píng)估、污染治理、環(huán)境修復(fù)以及特種功能微生物篩選等領(lǐng)域具有指導(dǎo)意義。而微生物的群落結(jié)構(gòu)及其多樣性是微生物生態(tài)學(xué)和環(huán)境科學(xué)研究的重點(diǎn)內(nèi)容，對(duì)于開發(fā)生物資源，闡明微生物群落與其生境的關(guān)系，揭示群落結(jié)構(gòu)與功能的聯(lián)系，從而指導(dǎo)微生物群落結(jié)構(gòu)功能的定向調(diào)控具有重要價(jià)值。

微生物群落結(jié)構(gòu)研究最早采用的是傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法，該方法存在著分辨率低、需培養(yǎng)等缺點(diǎn)。依照已有的培養(yǎng)技術(shù)和方法，只能對(duì)自然界中不到1%的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，如海水中為0.001%～0.1%，淡水中約為0.25%，土壤中約為0.3%[3]。隨后的熒光原位雜交(FISH)、末端限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(T-RFLP)、變形梯度凝膠電泳(DGGE)、基因芯片技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)雖能夠繞開分離和培養(yǎng)步驟，但受到樣品大小、采集等因素的影響[4]，且許多微生物需在分離培養(yǎng)后才能透徹地對(duì)其研究，這導(dǎo)致僅有1%～10%的環(huán)境微生物可以進(jìn)行分析，依舊阻礙了環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的深入研究[5]。而當(dāng)今廣泛使用的第二代測(cè)序技術(shù)(second generation sequencing,NGS)以及第三代測(cè)序技術(shù)(third generation sequencing,TGS)能夠克服上述分子生物學(xué)技術(shù)的缺點(diǎn)，且因其具有測(cè)序通量高、成本低、定量準(zhǔn)的特點(diǎn)使其在生命科學(xué)領(lǐng)域中得到研究者們的肯定。據(jù)報(bào)道，科學(xué)家第一次進(jìn)行人類基因組測(cè)序花費(fèi)了40億元，耗時(shí)10年。而在2008年，利用第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)人類全基因組進(jìn)行測(cè)序，花費(fèi)不到100萬美元，耗時(shí)3個(gè)月[6]。2012年，美國(guó)Life Technologies公司使用新的高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)人類全基因組進(jìn)行測(cè)序僅需1天的時(shí)間，花費(fèi)1 000美元[7]。

作為微生物生態(tài)學(xué)和環(huán)境工程學(xué)研究的重點(diǎn)領(lǐng)域，高通量測(cè)序技術(shù)使得直接研究自然狀態(tài)下微生物種群結(jié)構(gòu)成為了現(xiàn)實(shí)。同時(shí)高通量測(cè)序技術(shù)有助于在礦山、廢水、海洋、土壤、大氣等差異性環(huán)境樣本研究中獲得了更加完整的DNA。這不僅有利于深入挖掘環(huán)境微生物的種類，還把對(duì)環(huán)境微生物的認(rèn)識(shí)從物種水平上升到基因功能研究水平，極大地拓展了對(duì)環(huán)境微生物的認(rèn)識(shí)[8-9]。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研可知，截止2014年，國(guó)內(nèi)知網(wǎng)和國(guó)外Sciencedirect數(shù)據(jù)庫中高通量測(cè)序技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)量分別約為700篇和3 000篇，但其中高通量測(cè)序技術(shù)與環(huán)境微生物的相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)量分別僅占1.7%、2.1%，其余部分主要為人類學(xué)、植物學(xué)和動(dòng)物學(xué)等方面。而全面介紹高通量測(cè)序技術(shù)在不同環(huán)境介質(zhì)中應(yīng)用的綜述文章還未見報(bào)道。

據(jù)此，為了更全面地了解高通量測(cè)序技術(shù)在環(huán)境微生物中的應(yīng)用，筆者首先對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行了概述，然后從典型環(huán)境介質(zhì)出發(fā)，結(jié)合最新成果和課題組研究進(jìn)展，對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)在大氣和空氣中的微生物變化、海洋微生物多樣性、污水生物處理以及土壤功能微生物等方面的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)，以期為環(huán)境微生物領(lǐng)域的嶄新研究及工藝優(yōu)化提供理論指導(dǎo)。

1 高通量測(cè)序技術(shù)及發(fā)展現(xiàn)狀

20世紀(jì)70年代Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Maxam等發(fā)明的Maxam-Gilbert化學(xué)降解法的出現(xiàn)拉開了第一代測(cè)序技術(shù)的序幕[10]，隨后又出現(xiàn)了熒光標(biāo)記法和毛細(xì)管電泳技術(shù)[11]。然而雙脫氧核苷酸末端終止法和化學(xué)降解法操作步驟繁瑣，且不能自動(dòng)化，而熒光標(biāo)記法和毛細(xì)管電泳技術(shù)在成本和耗時(shí)方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足基礎(chǔ)學(xué)發(fā)展的需要。在隨后的30多年，生物測(cè)序技術(shù)取得了重大進(jìn)展，特別是2005年出現(xiàn)的邊合成邊測(cè)序的454技術(shù)、2007年出現(xiàn)的邊合成邊測(cè)序的Illumina技術(shù)以及邊連接邊測(cè)序的SOLID技術(shù)[12]。以高通量為特點(diǎn)的第二代測(cè)序技術(shù)逐步成熟并商業(yè)化，其發(fā)展趨勢(shì)如圖1所示。以紅色為代表的454測(cè)序平臺(tái)的發(fā)展速度最快，從2005年到2011年其讀長(zhǎng)從100 bp增加到800 bp，測(cè)序通量從35 Mb增加到700 Mb；以黃色為代表的Illumina測(cè)序平臺(tái)從2007年到2011年其讀長(zhǎng)從35 bp增加到150 bp，測(cè)序通量從30 Gb增加到600 Gb；以藍(lán)色為代表的SOLID測(cè)序平臺(tái)從2007年到2010年其讀長(zhǎng)從35 bp增加到85 bp，測(cè)序通量從13 Gb增加到320 Gb。這些技術(shù)是將片段化的基因進(jìn)行接頭連接形成單鏈，然后用不同的方式進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)生更多的單分子序列。隨后通過引物雜交和酶的延伸實(shí)現(xiàn)序列的測(cè)定，檢測(cè)每一步反應(yīng)所產(chǎn)生的信號(hào)來獲得測(cè)序數(shù)據(jù)，最后由計(jì)算機(jī)分析獲得完整的序列信息[13]。

2008年第三代測(cè)序技術(shù)浮出了水面，如Helicos biosciences的tSMSTM技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)[14]。第三代與第二代測(cè)序技術(shù)的特性比較如表1所示?？傮w而言，由于第三代測(cè)序技術(shù)采用單分子測(cè)序，具有更快的數(shù)據(jù)讀取速度，讀長(zhǎng)普遍增加，運(yùn)行時(shí)間大大縮短，且測(cè)序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15]。PacBio(SMRT)最長(zhǎng)讀長(zhǎng)可達(dá)到4 500 bp，比讀長(zhǎng)最長(zhǎng)的Roche 454平臺(tái)增長(zhǎng)了 3 700 bp，其最短運(yùn)行時(shí)間為0.5 h，比耗時(shí)短的Ion PGM減少了2.5 h。且PacBio(SMRT)也運(yùn)用了邊合成邊測(cè)序的思想[16]，模板與DNA聚合酶結(jié)合，4種堿基(即是dNTP)用4色熒光來標(biāo)記，在堿基配對(duì)階段，加入不同的堿基,會(huì)發(fā)出不同的光，根據(jù)光的波長(zhǎng)和峰值來確定堿基類型。而表中Oxford Nanopore是利用電信號(hào)和一種具有共價(jià)分子接頭的特殊納米孔來測(cè)序[16]，DNA堿基通過納米孔時(shí)，會(huì)使電荷發(fā)生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強(qiáng)度，電子設(shè)備通過檢測(cè)這些變化來鑒定所通過的堿基?？梢?，第三代測(cè)序技術(shù)比第二代測(cè)序技術(shù)在測(cè)序原理上也有較大的提升。但由于第三代測(cè)序技術(shù)還不成熟，國(guó)內(nèi)外測(cè)序公司運(yùn)用較少，華大基因等國(guó)內(nèi)主要測(cè)序公司均以Illumina的HiSeq和MiSeq測(cè)序儀為主要測(cè)序平臺(tái)。

紅色：454測(cè)序平臺(tái)；黃色：Illumina測(cè)序平臺(tái)；藍(lán)色：SOLID測(cè)序平臺(tái)

表1 典型高通量測(cè)序平臺(tái)特性比較

2 高通量測(cè)序技術(shù)在氣體微生物中的應(yīng)用

近年來，由于人類健康、空氣污染及環(huán)境質(zhì)量等問題逐年增長(zhǎng)，大氣微生物漸漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。研究者已在大氣微生物的來源、大氣微生物污染與評(píng)價(jià)、環(huán)境因素對(duì)大氣微生物的影響和大氣微生物粒譜范圍等方面進(jìn)行了大量研究。而如今，大氣微生物進(jìn)入了群落多樣性的新研究領(lǐng)域。

2.1 室內(nèi)空氣微生物群落多樣性研究

該領(lǐng)域研究的目的主要是通過分析室內(nèi)空氣微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性推測(cè)對(duì)人類健康的影響。相關(guān)研究目前還處在初級(jí)階段，國(guó)內(nèi)的相關(guān)報(bào)道還較少。Hewitt等[25]通過對(duì)環(huán)境微生物的rRNA基因序列進(jìn)行焦磷酸測(cè)序研究了3個(gè)大都市辦公室里的微生物多樣性，研究表明男女性之間的辦公室微生物豐度具有較大差異。該實(shí)驗(yàn)同時(shí)運(yùn)用了培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法和高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定細(xì)菌豐度，突出了高通量測(cè)序評(píng)估微生物多樣性快速和徹底的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)研究者們?cè)诙喾N測(cè)序方法的結(jié)合使用方面有了一定的啟示作用。同年，Hewitt等還發(fā)現(xiàn)了人類對(duì)空間的占用會(huì)提高空氣微生物的濃度，這可能使人們對(duì)暴露于室內(nèi)的某些感染與非感染的細(xì)菌產(chǎn)生不良健康后果[26]。該實(shí)驗(yàn)充分展現(xiàn)了高通量測(cè)序技術(shù)在研究細(xì)菌基因組和進(jìn)化種群特征方面的應(yīng)用。此外，地理位置、建筑設(shè)計(jì)類型、采集器的選擇及空氣采集時(shí)間長(zhǎng)短等因素都會(huì)影響微生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化[27]，從而通過決定微生物組成和多樣性來理解其生態(tài)和進(jìn)化關(guān)系。Hoisington等[28]利用高通量測(cè)序研究了采集器的選擇及不同采集時(shí)間內(nèi)室內(nèi)微生物的變化關(guān)系，以此來評(píng)估室內(nèi)微生物因不同條件因素而產(chǎn)生的差異，這在室內(nèi)微生物多樣性研究方面具有一定的參考價(jià)值。同時(shí)，一些研究者還對(duì)禽畜生活的室內(nèi)環(huán)境微生物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)豬場(chǎng)建筑物中的微小氣候變化，特別是空氣流速、PM2.5和總懸浮顆粒的變化會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)菌豐度及多樣性的變化，并發(fā)現(xiàn)冬季時(shí)六四環(huán)素耐藥基因出現(xiàn)的頻率比夏季高。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的更加成熟，室內(nèi)微生物群落多樣性研究可為人類健康提供更多的參考依據(jù)。

2.2 室外大氣微生物群落多樣性研究

由細(xì)菌、放線菌、霉菌、病毒和孢子等生命活性物質(zhì)微粒組成的空氣微生物以微生物氣溶膠的形式游離于大氣環(huán)境中，是大氣生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。近幾年，國(guó)內(nèi)外許多研究者通過微生物氣溶膠對(duì)地球底層大氣和對(duì)流層上部等環(huán)境微生物的群落組成、多樣性、時(shí)空動(dòng)力學(xué)以及其對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的影響等方面展開了研究[29]。大氣中的主要微生物類型為細(xì)菌，且微生物的環(huán)境來源(如土壤、水體、植物)和季節(jié)變化是影響微生物群落結(jié)構(gòu)變化的兩大主要因素[30]。Robert等[31]利用定量PCR和Illumina技術(shù)對(duì)意大利米蘭城市地區(qū)的大氣中細(xì)菌群落進(jìn)行了研究，研究表明在冬季時(shí)細(xì)菌的豐度低于其他季節(jié)，細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌包括Actinobacteridae(放線菌亞綱)、Clostridiales(梭菌目)和Sphingobacteriales(鞘脂桿菌目)，且大量微生物來源于土壤和植物中。Natasha DeLeon-Rodriguez等[32]研究加勒比海上層空氣的微生物群落，研究表明細(xì)菌為加勒比海上層空氣中的主要微生物類型，颶風(fēng)氣溶膠中具有大量的新細(xì)胞，其中有17種細(xì)菌分類群利用C1-C4化合物作為生長(zhǎng)源。

近年來，北京霧霾天氣受到研究者的高度重視，2013年清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院和醫(yī)學(xué)院的研究人員利用Illumina HiSeq2000對(duì)霧霾空氣微生物宏基因組進(jìn)行測(cè)序研究。該研究在種的分類水平上對(duì)細(xì)菌、真菌、古菌和dsDNA病毒等空氣微生物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)霧霾空氣中約有1 300種微生物。其中PM2.5樣品中細(xì)菌讀數(shù)占86.1%，真核生物讀數(shù)占13%，古菌讀數(shù)占0.8%，病毒讀數(shù)占0.1%，而PM10樣品中細(xì)菌讀數(shù)占80.8%，真核生物讀數(shù)占18.3%，古菌讀數(shù)占0.8%，病毒讀數(shù)占0.1%，且大量微生物與土壤相關(guān)(圖2)。此外，這些微生物中雖大多數(shù)對(duì)人類不致病，但確定了幾種呼吸道過敏原和病原微生物的序列[33]。室外(特別是城市)大氣微生物結(jié)構(gòu)及多樣性的研究，對(duì)深入理解城市空氣污染及其影響因素具有重要意義。尤其是高通量測(cè)序技術(shù)與宏基因組的完美結(jié)合，能夠進(jìn)一步推進(jìn)空氣環(huán)境治理研究，為大氣環(huán)境的污染治理提供了更豐富的生物信息。

從上述可知，高通量測(cè)序技術(shù)在氣體微生物中的應(yīng)用已有一些報(bào)道，也體現(xiàn)出了高通量測(cè)序技術(shù)在群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究等方面發(fā)揮的巨大作用，但大多數(shù)只對(duì)氣體微生物直接的群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究，而對(duì)于高通量測(cè)序技術(shù)在大氣微生物功能菌的篩選等方面的應(yīng)用還未見報(bào)。

圖2 收集的PM樣品特性

3 高通量測(cè)序技術(shù)在水環(huán)境微生物中的應(yīng)用

3.1 原生環(huán)境中微生物多樣性變化研究

海洋微生物因在多種生源要素和能量傳遞方面的重要化學(xué)循環(huán)作用而成為研究者的主要研究領(lǐng)域。研究表明，在相同的水生環(huán)境中，不同深度的優(yōu)勢(shì)微生物類群各不相同。譬如，北極水域表層水體微生物多樣性的優(yōu)勢(shì)種為藍(lán)藻，深層水體(200～1 500 m)豐度最高的優(yōu)勢(shì)種為變形菌門[34]。此外，微生物群落結(jié)構(gòu)除隨時(shí)空變化外，還受溫度、pH值等其他環(huán)境條件影響。Maugeri等在Illumina測(cè)序技術(shù)的輔助下研究意大利Panarea島淺海熱液系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的組成及優(yōu)勢(shì)菌，研究表明沉積物和流體中具有不同的群落結(jié)構(gòu)，其優(yōu)勢(shì)菌分別為Rhodovulum(小紅卵菌屬)和Chlorobium(綠菌屬)，且所獲得序列的原核生物對(duì)淺海熱系統(tǒng)中的C、Fe和S循環(huán)起著關(guān)鍵作用[35]。不同溫度下海洋熱帶地區(qū)中沉積物和海水中原核微生物群落結(jié)構(gòu)及組成不同，研究發(fā)現(xiàn)Panarea島嶼的一個(gè)活躍的水熱地區(qū)在低溫和高溫的微生物群落的優(yōu)勢(shì)菌都為細(xì)菌，微量菌都為古生菌，且不同溫度下的樣品具有不同優(yōu)勢(shì)菌屬的數(shù)量比[36]。董逸等[37]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)我國(guó)黃東海典型海域進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)及環(huán)境變化對(duì)其影響的研究。研究表明：前5個(gè)月中，每月各水層具有相似的群落結(jié)構(gòu)，而后6個(gè)月卻具有不同的微生物群落結(jié)構(gòu)，其中溫度和鹽度對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化影響顯著。可見，除DNA測(cè)序技術(shù)中Sanger 測(cè)序法在海洋微生物中得到廣泛應(yīng)用外，如今，高通量測(cè)序方法也越來越多地應(yīng)用于海洋微生物生態(tài)學(xué)的研究。高通量測(cè)序技術(shù)能夠揭示海洋中極低豐度的微生物，發(fā)現(xiàn)更多新微生物類群，但在各分類階元都存在不能確定的分類信息。對(duì)此，可將熒光定量、克隆等技術(shù)與高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合，或?qū)⒍喾N高通量技術(shù)結(jié)合使用，盡可能地減少測(cè)序結(jié)果的不確定性。

3.2 次生環(huán)境水體中微生物的多樣性研究

隨著城市生活垃圾的積累及工業(yè)生產(chǎn)中的廢水排放，水污染問題越來越嚴(yán)重[38]。水污染造成了水體營(yíng)養(yǎng)負(fù)荷增加，破壞了藻類、無脊椎動(dòng)物和魚類群落結(jié)構(gòu)，同時(shí)也極大地影響了水中微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)。

2008年，研究人員就開展了利用磷焦測(cè)序研究污水處理廠的抗生素抗性質(zhì)粒的研究[39]。到目前為止，已有許多關(guān)于廢水處理廠微生物及飲用水系統(tǒng)微生物方面的應(yīng)用研究運(yùn)用了高通量測(cè)序技術(shù)[40]。Man等[41]利用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)研究具有不同處理方法的污水處理廠中的微生物群落。研究表明，Proteobacteria(變形桿菌)和Bacteroidetes(擬桿菌)是樣品中的優(yōu)勢(shì)菌群，處理方法的差異可能改變微生物的群落結(jié)構(gòu)。Zhang等[42]通過高通量測(cè)序技術(shù)研究了光合細(xì)菌作為添加劑對(duì)廢水處理系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響。研究表明，添加光合細(xì)菌的樣品組比對(duì)照組具有更高的微生物多樣性，且能夠改善水質(zhì)量。

Daisuke等[43]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)Kathmandu Valley地區(qū)的淺層地下水生物污染進(jìn)行了研究，結(jié)果表明11個(gè)地下水樣品中有10個(gè)受到大腸桿菌的嚴(yán)重污染，此外DNA微陣列分析結(jié)果還揭示了37個(gè)病原種類的存在。Xiao等[44]利用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)研究了農(nóng)村生活污水以及制革廠、服裝廠和紐扣廠的排放污水對(duì)河流微生物生態(tài)系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明，農(nóng)村生活污水的細(xì)菌豐度最高，而制革廠的細(xì)菌豐度最低，且4種樣品中存在相似的微生物種類，可知不同廢水會(huì)潛在地影響河流生態(tài)系統(tǒng)的自然變化，導(dǎo)致河流生物同質(zhì)化。同年，他們對(duì)特定豬場(chǎng)和農(nóng)場(chǎng)飯店旁的河流微生物生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行了研究[36]，發(fā)現(xiàn)豬場(chǎng)和農(nóng)場(chǎng)飯店排放的污水使河流沉積物及河水的細(xì)菌多樣性和豐度都顯著降低，且豬場(chǎng)污染物對(duì)河流群落多樣性的影響較大。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，將會(huì)有更多的水體環(huán)境問題得以揭示，譬如消毒副產(chǎn)物對(duì)飲用水的生物多樣性影響、湖水中重金屬的遷移轉(zhuǎn)化問題等，相關(guān)成果也會(huì)為水處理系統(tǒng)的優(yōu)化設(shè)計(jì)提供有益的指導(dǎo)。

4 高通量測(cè)序技術(shù)在土壤微生物中的應(yīng)用

土壤微生物在分解轉(zhuǎn)化各種有機(jī)物和地球化學(xué)循環(huán)方面起著重要的作用[45]，其物種結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性和功能特性亦受到研究者的廣泛關(guān)注。據(jù)估計(jì)，每克土壤中最多可含有大約100億個(gè)微生物個(gè)體[46]，微生物種類和數(shù)量因土壤類型、季節(jié)變化、土層厚度與層次不同而發(fā)生變化，高通量測(cè)序技術(shù)為土壤多樣性的研究及土壤生態(tài)功能方面的研究提供了重要的技術(shù)支撐。

4.1 微生物群落的土壤理化性質(zhì)響應(yīng)

人類的生產(chǎn)生活改變了土壤本身的理化性質(zhì)，造成土壤微生物群落演變。早期研究表明，草地和林地為土壤微生物提供充足能源，當(dāng)草地或林地變?yōu)楦睾?，其微生物量相?duì)減少[47]。McGuire等[48]利用高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)再生的原始森林土壤中真菌的群落結(jié)構(gòu)和功能變化顯著。而長(zhǎng)期施肥則會(huì)改變土壤氮源和碳源的利用量，使得土壤微生物在土壤垂直梯度上具有明顯的群落結(jié)構(gòu)差異[49]。卞碧云等[50]利用高通量測(cè)序技術(shù)研究氮肥對(duì)氨氧化微生物的影響，研究表明氮肥量的不同會(huì)使氨氧化細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的差異，氨氧化古菌微生物群落結(jié)構(gòu)基本穩(wěn)定，而“活躍的”氨氧化細(xì)菌和古菌都會(huì)發(fā)生明顯變化，其中氮肥用量增加會(huì)對(duì)“活躍的”氨氧化細(xì)菌中Nitrosospira.splNsp 65-like group類群和Nitrosococcus watsonii sp.nov類群的生長(zhǎng)分別產(chǎn)生抑制和促進(jìn)作用。

借助高通量測(cè)序技術(shù)能夠多種環(huán)境因素同時(shí)分析，直觀全面地反映土壤微生物與生態(tài)條件的相互關(guān)系和影響，從而明細(xì)微生物群落結(jié)構(gòu)的演變規(guī)律，豐富環(huán)境生態(tài)學(xué)知識(shí)，進(jìn)而探索更有效的土壤管理方法，為人類合理利用土壤資源提供了有利依據(jù)。

SD：東萊蕪；GD：廣東深圳；SH：上海老港；CQ：重慶長(zhǎng)生橋；OM：有機(jī)質(zhì)；TN：總氮；TP：總磷；硝態(tài)氮；銨態(tài)氮

4.2 高通量測(cè)序技術(shù)在土壤功能微生物篩選方面的應(yīng)用

土壤微生物長(zhǎng)期在特定環(huán)境下具有了某些特定的功能，是環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)中C、N和其他養(yǎng)分流的關(guān)鍵。研究表明氨氧化細(xì)菌控制著消化作用的主要步驟，對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的保持和移動(dòng)性起著重要的作用，且氨氧化細(xì)菌在高底物和高營(yíng)養(yǎng)條件負(fù)責(zé)了大部分的氨氧化反應(yīng)[56]。在高通量測(cè)序技術(shù)的輔助下，研究者還對(duì)土壤中功能微生物進(jìn)行了深入探究。徐瑛等[57]將脫硫菌的篩選與新一代高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)土壤中Pseudomonas(假單胞菌屬)、Ochrobactrum(蒼白桿菌屬)等多種脫硫功能菌。Kim等[58]在實(shí)驗(yàn)室模擬垃圾填埋場(chǎng)甲烷降解的覆蓋層，通過基于DNA和RNA的核糖體標(biāo)簽焦磷酸測(cè)序?qū)?xì)菌群落進(jìn)分析研究，研究表明甲烷氧化菌活躍區(qū)域RNA占80%，而DNA占20%。DNA與RNA的比較表明只基于DNA的分析可能會(huì)低估甲烷氧化菌的活躍成分。課題組從礦化垃圾中富集混合菌群，并利用其靜息細(xì)胞進(jìn)行了共代謝降解三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)的研究，結(jié)果表明該菌群對(duì)TCE有較強(qiáng)的親和力和耐受性，且TCE降解符合Monad模型[59]。隨后，課題組利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)TCE馴化后典型垃圾填埋場(chǎng)覆蓋土中功能微生物進(jìn)行了屬分類水平下的生物群落結(jié)構(gòu)變化分析，結(jié)果見圖4。研究發(fā)現(xiàn)覆蓋土中Methylocystis(甲基孢囊菌屬)、Methylobacillus(甲基菌屬)、Methylophilaceae_uncultured(嗜甲基菌屬)、Arthrobacter(節(jié)桿菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)等多種共代謝TCE功能菌。此外，課題組開展了銅離子濃度對(duì)三氯乙烯好氧生物降解影響的研究。如表2所示，銅離子濃度的變化影響了覆蓋層混合菌群的結(jié)構(gòu)和活性，進(jìn)而影響了TCE降解機(jī)制。隨著銅離子濃度的增加，II型甲烷氧化菌Methylocystaceae百分含量(36.1%到75.42%)顯著增大，這說明了共代謝降解TCE成為了主要降解機(jī)制，而直接以TCE為碳源的Lactococcus(乳球菌屬)、Methylophilus(嗜甲基菌屬)、Bacillus(芽孢桿菌屬)等功能微生物的百分含量都顯著降低，甚至消失[60]。

利用高通量測(cè)序技術(shù)，能夠獲得土壤中微生物物種、結(jié)構(gòu)、功能以及遺傳多樣性等方面的豐富信息，可根據(jù)樣品本身的群落結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)功能菌的篩選方案，避免了傳統(tǒng)篩菌的盲目性。尤其是填埋場(chǎng)這種次生環(huán)境，在生活垃圾穩(wěn)定化過程中蘊(yùn)含了大量的功能微生物菌群，利用高通量測(cè)序技術(shù)能夠探索出覆蓋土功能菌篩選的新方法，相關(guān)成果將極大地拓展填埋場(chǎng)覆蓋土層功能微生物的工程應(yīng)用前景。

圖4 屬分類水平下覆蓋土微生物群落結(jié)構(gòu)變化

表2 銅離子處理覆蓋土混合菌的高通量測(cè)序結(jié)果

5 展望

高通量測(cè)序技術(shù)客觀地揭示了環(huán)境微生物的群落結(jié)構(gòu)、多樣性及進(jìn)化關(guān)系，使得微生物宏轉(zhuǎn)錄組和宏基因組等方面的基本研究策略發(fā)生變化，研究步驟得以簡(jiǎn)化，研究周期得以縮短，并且能夠獲得更加豐富的數(shù)據(jù)。同時(shí)，它的發(fā)展為環(huán)境微生物在物質(zhì)循環(huán)、生態(tài)系統(tǒng)調(diào)節(jié)及污染處理等方面的深入研究提供了機(jī)遇，也為極端環(huán)境下(如耐重金屬、PoPs持續(xù)性有機(jī)污染物)的功能微生物在耐受性馴化、代謝機(jī)理研究等方面提供了有力支撐。然而高通量測(cè)序技術(shù)也存在著一些缺點(diǎn)。

1) 它可能會(huì)高估或低估一些微生物類群的相對(duì)豐度及多樣性等，例如高通量測(cè)序針對(duì)環(huán)境中所有的DNA樣品，死的生物也可能被檢測(cè)到。將高通量測(cè)序技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)的結(jié)合仍然具有很大的空間。

2) 高通量測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)分析難，這種海量數(shù)據(jù)使得生物信息學(xué)分析面臨挑戰(zhàn)，加大了土壤學(xué)或微生物學(xué)研究者對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果分析的難度，新統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和分析軟件的開發(fā)成為當(dāng)前的迫切需求。

3) 高通量測(cè)序儀價(jià)格昂貴，動(dòng)輒幾百萬元， 一般的小型實(shí)驗(yàn)室難以承受。

雖然高通量測(cè)序技術(shù)過程中依然存在一些問題，但是其檢測(cè)快、通量高和信息豐富等特點(diǎn)，使其在微生物研究中的應(yīng)用具有獨(dú)特優(yōu)越性。所以應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎地解釋分子技術(shù)所產(chǎn)生的微生物信息數(shù)據(jù)，結(jié)合多種分析方法得到更準(zhǔn)確的結(jié)論。而海量數(shù)據(jù)的處理使得環(huán)境微生物學(xué)從生物學(xué)領(lǐng)域延伸到數(shù)學(xué)、自動(dòng)化、計(jì)算機(jī)等許多科學(xué)領(lǐng)域，這必將拓展更多的新興研究領(lǐng)域，更好地發(fā)揮高通量測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。