茶樹細胞色素P450基因CYP71A26與CYP71B34的克隆及差異表達特征分析

單睿陽，林鄭和，陳志輝，鐘秋生，游小妹，陳常頌

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茶樹細胞色素P450基因與的克隆及差異表達特征分析

單睿陽，林鄭和，陳志輝，鐘秋生，游小妹，陳常頌*

福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，福建 福安 355015

利用NCBI茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，以鐵觀音芽葉為材料，克隆了茶樹細胞色素P450基因6與的cDNA全長。與的cDNA全長分別為1?879?bp和1?764?bp，分別含有1?539?bp（編碼513個氨基酸）和1?533?bp（編碼511個氨基酸）的完整開發(fā)閱讀框。氨基酸序列比對結(jié)果顯示，CYP71A26與CYP71B34的同源性為42.47%，為2個亞家族基因。氨基酸結(jié)構(gòu)分析表明，2個基因均具有植物P450的螺旋C（Helix C）、螺線I（Helix I）、螺線K（Helix K）、“Meander”區(qū)域序列和血紅素結(jié)合域（Heme binding domain）的典型結(jié)構(gòu)。進化樹分析顯示，與在分子進化樹上分屬兩大分支，2個基因與其他物種親緣關(guān)系的遠近不同。三級結(jié)構(gòu)模擬與功能域分析顯示，CYP71A26與CYP71B34主要由N端的折疊和C端的螺旋結(jié)構(gòu)組成，且2個基因均具有一個P450蛋白結(jié)構(gòu)域（Pfam domain）。熒光定量PCR結(jié)果表明，與基因在不同茶樹害蟲為害的葉片中，分別表現(xiàn)出上調(diào)和下調(diào)表達的現(xiàn)象。而在冷熱環(huán)境下，與基因分別表現(xiàn)出下調(diào)和上調(diào)表達的現(xiàn)象。表明茶樹與基因均參與了生物（害蟲）與非生物（溫度）的脅迫響應(yīng)，但兩個基因表達相反，參與環(huán)節(jié)可能相反。

茶樹；細胞色素P450；克?。粊喖易寤?；脅迫；表達相反

細胞色素P450（Cytochrome P450，Cyt P450）是一類以血紅素為輔基的超家族酶系，該酶系多存在于生物體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum）、高爾基體（Golgi complex）和質(zhì)體（Plastid）等細胞器膜中。最早發(fā)現(xiàn)P450是在50年代，Axelrod[1]在研究肝臟時發(fā)現(xiàn)細胞微粒體中存在一些能夠參與氧化代謝的酶系，進而Garfinkel[2]發(fā)現(xiàn)該酶系能與一氧化碳（CO）結(jié)合，并在450?nm附近有最大吸收峰，故將其命名為細胞色素P450。到了60年代，Omura等[3]證實了該酶系屬于b型血紅色素蛋白（Haemoglobin）。70年代，開始對P450酶的純化及特異性抗體的制備進行了研究。80年代，開啟了對P450基因的克隆、分子鑒定以及功能的研究。近20年來，P450的研究取得了突飛猛進的發(fā)展。

在植物P450超家族基因簇中，最大的是CYPA71簇（簡稱植物A-type P450集團，又稱71 clan），這個基因簇基本上包含了超過半數(shù)的P450基因[4]，目前在水稻、玉米、擬南芥、番茄、大豆、松樹等植物中發(fā)現(xiàn)該基因簇具有復雜的生物學功能[5]。根據(jù)前人研究結(jié)果，大致可將這些功能歸為兩類：一類是起到內(nèi)源性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化合成功能，如在苯丙烷類（Phenylaprapanoid）、植物激素類（Phytohormone）、萜類（Terpene）、黃酮類（Flavonoid）、木質(zhì)素（Lignin）和生物堿（Alkaloid）等的物質(zhì)合成過程中起到重要的作用[6]。這些通過代謝途徑合成的內(nèi)源性物質(zhì)，有的可以作為毒素或者殺蟲劑，使植物對昆蟲、病原菌產(chǎn)生抗性。有的可以作為信號分子，激活植物對病菌的抗性。另一類是對外源性物質(zhì)的代謝解毒功能，它可催化外源物質(zhì)如殺蟲劑、除草劑和環(huán)境污染物等的代謝降解。例如，小麥對苯基脲類（Phenylureas）除草劑綠麥?。–hlortoluron）的代謝主要是通過P450的環(huán)甲基羥基化（Cyclomethylhydroxylation）所介導[7]。水稻對芐嘧磺?。˙ensulfuron-methyl，BSM）的降解主要通過P450的脫甲基（Demethylation）作用所催化[8]。

茶樹[(L.) O. Kuntze]屬多年生常綠木本植物，是我國重要的經(jīng)濟作物之一。選育抗蟲、抗病性強的茶樹新品種是茶樹育種的首要工作任務(wù)，而P450具有復雜的生物學功能，因而許多P450基因已被克隆并鑒定，并應(yīng)用于作物的遺傳育種。如從擬南芥中克隆得到的已被廣泛應(yīng)用，該基因所產(chǎn)生的植保素在作物抵抗病菌侵染過程中發(fā)揮重要的作用[9]。因而，篩選及研究茶樹P450基因的分子功能具有重要的意義。基于此，本研究利用NCBI已上傳的茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（Taxonomy ID：4442），從中篩選出了茶樹（GenBank登錄號：GARM01003853.1）與GenBank登錄號：KA281555.1）的2個基因片段，通過RT-PCR及RACE技術(shù)，克隆了該2個基因全長。通過生物信息學軟件和在線網(wǎng)站分析了該2個基因的理化性質(zhì)、氨基酸結(jié)構(gòu)、進化樹和功能域等信息。最后，檢測了該對基因在不同茶樹害蟲為害的葉片中及冷熱環(huán)境下的表達差異。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試劑

本試驗所使用的材料鐵觀音茶樹品種采集于福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所2號山品種茶園（北緯27°8′~27°13′40″，東經(jīng)119°32′11″~119°38′之間）。植物總RNA提取試劑盒RNAprep pure plant kit (dp441)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastKing RT Kit（With gDNase）、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和熒光定量試劑盒FastFire qPCR PreMix（SYBR Green）均購自天根生化科技（北京）有限公司；全長cDNA克隆試劑盒SMARTer?RACE 5′/3′Kit購自TaKaRa公司；dNTPs（各2.5?mmol·L-1）、Taq DNA聚合酶、DNase/RNase Free Water、DL2000 Marker、T4 DNA連接酶、pMD18-T、X-gal和IPTG等均購自Invitrogen公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞由本實驗室保存；克隆引物、定量引物的合成以及堿基序列的測序均由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 總RNA提取及cDNA模板的合成

取適量生長健壯、長勢均勻的鐵觀音嫩葉（一芽一葉），將其液氮冷凍后研磨成粉，按照植物總RNA提取試劑盒（RNAprep pure plant kit，dp441）說明書的操作步驟提取茶樹總RNA，再用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用超微量分光光度計（NanoDrop 2000）檢測RNA的純度。最后，以提取的總RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FastKing RT Kit，With gDNase）的操作步驟，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，即用于普通RT-PCR擴增的cDNA模板。

1.3 茶樹CYP71A26與CYP71B34基因中間片段的克隆

登入NCBI物種分類學數(shù)據(jù)庫（Taxonomy database），根據(jù)已登入的茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（Taxonomy ID：4442）信息，下載獲得茶樹的所有mRNA序列。該數(shù)據(jù)庫包含34萬多條不完整的核酸序列，且無詳細基因命名信息，因而無法迅速找到所要研究的目的基因序列，故需要通過Windows系統(tǒng)建立單機版的茶樹本地Blast數(shù)據(jù)庫，再以P450為關(guān)鍵詞，通過序列的分析比對獲得本研究所需的（GenBank登錄號：GARM01003853.1）與（GenBank登錄號：KA281555.1）基因序列。詳細建庫方法參照華大基因的“Windows系統(tǒng)下本地Blast的實現(xiàn)”（www.genomics.cn）說明書。

進而根據(jù)已獲得的茶樹與的基因序列，分別設(shè)計1對簡并引物71A-F1/R1與71B-F1/R1（表1），以反轉(zhuǎn)錄合成的茶樹cDNA為模板進行RT-PCR擴增。反應(yīng)條件為：94℃預變性3?min；94℃變性30?s，62℃退火45?s，72℃延伸1?min，共35個循環(huán)；72℃延伸10?min；4℃，保存。之后，將目的條帶進行回收并與載體pMD18-T進行連接，在大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中成功轉(zhuǎn)化后，挑取白斑培養(yǎng)成菌液并委托上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.4 茶樹CYP71A26與CYP71B34基因的5'及3'RACE擴增

在獲得茶樹與中間片段的基礎(chǔ)上，分別在5'端設(shè)計1對內(nèi)外鑲嵌引物71A-R2-inner與71A-R3-outer及71B-R2-inner與71B-R3-outer用于前端的5'RACE擴增，以及在3'端設(shè)計1對內(nèi)外鑲嵌引物71A-F2-inner與71A-F3-outer及71B-F2-inner與71B-F3-outer用于尾端的3'RACE擴增（表1）。5'RACE反應(yīng)條件為：94℃預變性3?min；94℃變性30?s，65℃退火30?s，72℃延伸90?s，共39個循環(huán)；72℃延伸10?min；4℃保存。3'RACE反應(yīng)條件為：94℃預變性3?min；94℃變性30?s，55℃退火30?s，72℃延伸90?s，共33個循環(huán)；72℃延伸10?min；4℃保存。最后將所獲得的各段序列進行拼接，獲得茶樹與的基因全長。

表1 本研究所用到的引物

注：F指正向引物，R指反向引物，inner指鑲嵌內(nèi)引物，outer指鑲嵌外引物。

Note: F represents positive primers, R represents negative primers, inner represents inside inlay primers, outer represents outside inlay primers, respectively.

1.5 茶樹CYP71A26與CYP71B34基因的生物信息學分析

利用DNAstar 8.0軟件對茶樹與的全長進行拼接；利用ProtParam在線工具（http://web.expasy.org/protparam）對編碼區(qū)蛋白的分子式及理化性質(zhì)等進行分析。利用Multalin 5.4.1在線網(wǎng)站（http://multalin. toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html）比對CYP71A26與CYP71B34蛋白的氨基酸結(jié)構(gòu)；三級結(jié)構(gòu)由Swiss Model網(wǎng)站（http://www. swissmodel.expasy.org）分析獲得；蛋白功能域及跨膜結(jié)構(gòu)由Smart在線網(wǎng)站（http://smart. embl-heidelberg.de）分析得到；系統(tǒng)進化樹由MEGA 5.0軟件的鄰位相連法（Neighbor- joining, NJ）構(gòu)建得到。

1.6 茶樹CYP71A26與CYP71B34基因的表達檢測

1.6.1 樣品處理及取樣

選取生長健壯，大小均勻的半年生茶苗，參照曹紅利等[10]的水培方法，于人工氣候室內(nèi)，于(23±0.5)℃，RH 70%，16L∶8D條件下，于小塑料柱形盆（直徑40?cm，高30?cm）中水培茶苗。水培營養(yǎng)液的全配方參照Ruan等[11]。待茶苗培養(yǎng)2~3周，茶樹生長穩(wěn)定后，進行處理取樣。

試驗處理分2組：（1）以鐵觀音為實驗材料，采集茶園常見害蟲茶尺蠖（）、小貫小綠葉蟬（）、茶橙癭螨（）和茶長卷葉蛾（），每盆茶苗接入適量蟲口量（每個蟲害處理3盆，共15盆），再將茶苗放入人工氣候箱中，于(24±1)℃，RH 75%，12L∶12D條件下為害48?h后，于為害部位剪取約1?g的一芽一葉新鮮茶樣，以未受害蟲為害的茶苗為對照，檢測與基因是否受蟲害所影響。（2）參照以上步驟，將鐵觀音茶苗放入4℃和36℃人工氣候箱中，分別于12、24、36、48?h取樣，以0?h未經(jīng)溫度脅迫的茶苗為對照，檢測與基因冷熱脅迫后的表達情況。

1.6.2 qRT-PCR表達檢測

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

熒光定量PCR每組設(shè)置3個重復，數(shù)據(jù)處理采用means±SE的計算方法，取平均值于GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software）軟件中進行作圖。每組數(shù)據(jù)的差異顯著性分析結(jié)果（<0.05）由SPSS 13.0軟件中的鄧肯氏（Duncan’s multiple range test）單因素方差（One-way ANOVA）分析方法獲得。

注：M1—M6泳道：DL2000 DNA Marker，1—2泳道：與的中間片段克隆，3—4泳道：與的5'RACE產(chǎn)物，5—6泳道：與的3'RACE產(chǎn)物。

Note: Lane M1-M6: DL2000 DNA Marker. Lane 1-2: Intermediate fragment cloned ofandgene. Lane 3-4: 5'RACE product ofandgene. Lane 5-6: 3'RACE product ofandgene.

圖1 茶樹和基因的cDNA全長克隆

Fig. 1 Cloning of the full length cDNA ofandgenesin

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CYP71A26與CYP71B34基因的全長克隆

利用茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中已知的與序列信息，通過RT-PCR技術(shù)克隆得到1?735?bp（圖1-泳道1）和1?154?bp（圖1-泳道2）的與中間序列。然后，通過5'RACE技術(shù)克隆得到309?bp（圖1-泳道3）和664?bp（圖1-泳道4）的與頭部序列。再通過3'RACE技術(shù)克隆得到452?bp（圖1-泳道5）和573?bp（圖1-泳道6）的6與尾部序列。最后，去除重復序列，拼接得到1?879?bp和1?764?bp的與全長序列。采用DNAstar對基因全長進行分析，結(jié)果表明與分別含有1?539?bp （編碼513個氨基酸）和1?533?bp（編碼511個氨基酸）的ORF序列。通過ProtParam網(wǎng)站進一步分析了編碼蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，茶樹CYP71A26與CYP71B34的蛋白分子式分別為C1772H2803N481O526S12和C2687H4161N701O738S23，分子量分別為39.65?kDa和58.83?kDa，理論等電點分別為5.19和7.99，以及包含354和510個氨基酸殘基數(shù)。

2.2 茶樹CYP71A26與CYP71B34基因的生物信息學分析

2.2.1 氨基酸結(jié)構(gòu)分析

為明確茶樹與基因的ORF序列特征，將這2個基因的氨基酸序列制成faste文檔，并導入Multalin 5.4.1在線網(wǎng)站進行比對分析。結(jié)果表明，與的同源性為42.47%，且2個基因均具有植物P450的典型結(jié)構(gòu)，其中包括1個螺旋C（Helix C）序列“WxxxR”，1個螺線I（Helix I）序列“(A/G)Gx(D/E)T(T/S)”，1個螺線K（Helix K）序列“ExxR”，1個“Meander”區(qū)域序列“PxxFxPxxF”和1個血紅素結(jié)合域（Heme binding domain）序列“FxxGxRxCx(G/A)”（圖2）。

2.2.2 系統(tǒng)進化樹分析

采用MEGA 4.0軟件中的鄰位相連法（Neighbor-joining，NJ），將茶樹與基因的開放閱讀框所推導的氨基酸序列與NCBI庫中其他物種和進行比對并下載構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹（圖3）。從圖3可以看出，與基因在分子進化樹上分屬兩大分支，分為兩大聚類（分別用“○”和“△”標注，其中“○”標注的為基因，“△”標注的為基因。進一步分析結(jié)果表明，茶樹與大戟科的蓖麻（）（XP_002511297.1）和麻瘋樹（）（XP_012079955.1）親緣關(guān)系較近，而與葡萄科的葡萄（）（CAN67678.19）親緣關(guān)系較遠。然而有趣的是，茶樹基因卻與葡萄科的葡萄（）（XP_002279272.2）親緣關(guān)系較近，而與大戟科的巴西橡膠樹（）（XP_021664607.1）親緣關(guān)系較遠。

2.2.3 三級結(jié)構(gòu)模擬與功能域分析

通過Swiss Model對茶樹與基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行模擬，結(jié)果表明，茶樹CYP71A26（圖4-A）與CYP71B34圖4-B）主要由N端的折疊（圖4中的紅色部分）和C端的螺旋結(jié)構(gòu)組成（圖4中的綠色部分）。另外，CYP71A26與CYP71B34蛋白三級模型的GMQE（Global Model Quality Estimation，全球性模型質(zhì)量估測）值分別為0.63和0.61（GMQE值在0~1之間，越接近1，建模質(zhì)量越好），表明建?？尚哦雀摺?/p>

注：紅色和黑色分別代表兩基因具有相同和不同的氨基酸序列，方框所圈氨基酸分別為：螺旋C、螺旋I、螺旋K、“Meander”區(qū)域和血紅素結(jié)合域序列。

注：圓圈和三角形分別代表不同植物的CYP71A26和CYP71B34基因，樹中所呈現(xiàn)的數(shù)字越大代表不同物種親緣關(guān)系越近。

通過SMART網(wǎng)站，進一步分析了茶樹CYP71A26與CYP71B34蛋白的功能結(jié)構(gòu)域（Functional domain structure）。結(jié)果表明，CYP71A26與CYP71B34均具有1個P450蛋白結(jié)構(gòu)域（Pfam domain），分別位于各自編碼序列的第37~505（圖5-A中的黑色部分）和39~496（圖5-B中的黑色部分）位點上。另外，CYP71A26蛋白含有1個由“FSLLHPFFLSLLPLFFFTLLLL”組成的低復雜度區(qū)域（Low complexity）（圖5-A中的紫色部分），位于編碼序列的第2~23位點上。以及CYP71B34蛋白含有1個跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)（Transmembrane structure）（圖5-B中的藍色部分），位于編碼序列的第7~29位點上。

注：紅色部分為N端的β折疊結(jié)構(gòu)，綠色部分為C端的α螺旋結(jié)構(gòu)。

注：數(shù)字代表氨基酸位置。Note: Numbers represent the amino acid position.

2.3 茶樹CYP71A26與CYP71B34基因的脅迫表達分析

2.3.1 不同蟲害脅迫的表達檢測

以鐵觀音為實驗材料，以未受蟲害取食的葉片為對照，研究茶尺蠖（）、茶橙癭螨（）、小貫小綠葉蟬（）和茶長卷葉蛾（）為害茶樹葉片48?h后，與基因的表達是否受蟲害所影響。結(jié)果顯示（圖6），受上述茶園害蟲為害后，茶樹基因分別上調(diào)了1.37、1.52、2.19和2.88倍，而茶樹基因分別下調(diào)了20.63%、8.26%、11.51%和69.23%。這表明，茶樹與基因分別受蟲害所誘導和抑制，表達相反。

2.3.2 冷熱脅迫的表達檢測

以鐵觀音為實驗材料，以常溫正常生長的茶樹為對照，研究茶樹與基因的表達是否受冷（4℃）、熱（36℃）脅迫所影響。結(jié)果顯示，茶樹基因在冷熱條件脅迫下表達量均呈下降的趨勢，且隨著時間的推移表達量下降越明顯，在48?h時分別下降了91.39%（冷）和87.06%（熱）（圖7-A）；相反的，茶樹基因在冷熱條件脅迫下表達量卻呈上升的趨勢，且隨著時間的推移表達量上升越顯著，在48?h時分別上升了20.22倍（冷）和7.63倍（熱）（圖7-B）。

圖6 不同害蟲取食茶樹后CYP71A26與CYP71B34基因的相對表達量

注：試驗以茶樹GAPDH基因為內(nèi)參，數(shù)據(jù)處理方法采用平均值±標準誤，每組試驗重復3次，柱上不同字母代表不同組數(shù)據(jù)間的顯著性差異（P<0.05）。

3 討論

P450廣泛存在于動植物體中，由于P450具有超家族特性，因而在命名時根據(jù)編碼氨基酸序列的相似性將其分類命名。若氨基酸同源性大于40%則為同一家族，大于40%小于55%則為同一亞家族基因，大于55%則為同一亞家族的不同異構(gòu)體[12]。雖然不同家族P450的氨基酸序列差異較大，但其三級結(jié)構(gòu)卻是類似的，均由N端的折疊和C端的螺旋構(gòu)成。不同P450的主要功能域位點相當保守，特別是與半胱氨酸（Cys）相連，起到接受電子的血紅色結(jié)合位點（Heme binding domain）、與氧原子或底物分子形成活性中心的螺線I（Helix I）、與血紅素形成電子拉鏈的螺旋C（Helix C）、具有穩(wěn)定血紅素核心結(jié)構(gòu)作用的螺線K（Helix K）和“Meander”區(qū)域序列[13]。本研究通過比對分析了茶樹與基因的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)兩基因的同源性為42.47%，且均具有上述保守序列結(jié)構(gòu)。進一步分析了該對基因的功能域，發(fā)現(xiàn)兩基因均具有1個P450蛋白結(jié)構(gòu)域，從而驗證了與為兩個經(jīng)典的亞家族P450基因。

系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，茶樹與大戟科親緣關(guān)系較近，與葡萄科親緣關(guān)系較遠，而基因卻與之相反。該現(xiàn)象可能與植物P450的堿基易變性有關(guān)。如前人研究結(jié)果表明，水稻基因具有調(diào)控花粉壁形成的功能，但該基因在第4個外顯子處經(jīng)常發(fā)生多堿基替換或缺少，導致天冬氨酸（Asp）轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼幔∕et）并造成纈氨酸（Val）的缺失[14]。而調(diào)控水稻枝梗延伸和小穗發(fā)育的1基因，經(jīng)常在第一個外顯子處發(fā)生堿基突變或缺失，導致提前出現(xiàn)終止密碼子[15]。因此，不同物種之間的與可能在進化過程中發(fā)生堿基突變，而導致氨基酸序列發(fā)生改變，從而導致該對基因的分子進化樹發(fā)生偏離。

P450酶系是自然界中最具催化活性的生物催化劑之一，但大多數(shù)植物P450基因在各組織中的表達量較低，特別是一些參與內(nèi)源信號分子代謝途徑的P450，很多需經(jīng)外界生物脅迫（如病蟲害）后才響應(yīng)表達。如Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，當煙草受蚜蟲（）為害后，煙草腺毛中能誘導表達1個特異的P450基因，該基因可催化腺毛分泌的西柏三烯一醇轉(zhuǎn)化為西柏三烯二醇，從而提高對蚜蟲的抗性。而受棉鈴蟲（）為害的棉花，能誘導P450催化苯丙烷類的物質(zhì)代謝，而產(chǎn)生香檸檬烯（Bergapten）和花椒毒素（Xanthotoxin），從而延緩該蟲的生長[17]。本研究選取了不同茶樹害蟲為害后的葉片做了表達檢測，發(fā)現(xiàn)2個基因均受不同蟲害所影響，但呈誘導表達，而基因則受抑制，表明2個基因均參與對害蟲的防御作用，但2個基因的調(diào)控路徑可能相反。

另外，許多P450酶系受外界非生物脅迫（如溫度）的響應(yīng)。如對冷熱脅迫后的多年生黑麥草（）進行RNA-seq測序分析，發(fā)現(xiàn)大量黑麥草P450基因響應(yīng)外界溫度脅迫，特別是最為敏感。進一步通過亞硫酸鹽測序法分析了的甲基化狀態(tài)，證明了該現(xiàn)象與基因外顯子的CG堿基甲基化有關(guān)[18]。本研究對冷熱脅迫后的茶樹做了表達檢測，發(fā)現(xiàn)茶樹基因不管在冷或熱脅迫下表達量均下降，而均上升，且隨著誘導時間的延長，基因的下降或上升越顯著，從而說明該對基因能夠響應(yīng)外界溫度的脅迫，但是否與CG堿基的甲基化有關(guān)有待進一步研究。

綜上所述，本研究克隆了茶樹與基因的全長。這2個基因均具有典型的P450序列及功能域，且為2個不同的亞家族基因。分析了該對基因的系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)兩基因的分子進化樹發(fā)生偏離。分析了該對基因在不同蟲害為害的葉片及冷熱脅迫后的表達差異，表明2個基因均參與了生物（害蟲）與非生物（溫度）的脅迫響應(yīng)，但2個基因表達方向相反，參與環(huán)節(jié)可能相反。

[1] Axelrod J. The enzymatic demethylation of ephedrine [J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 1955, 114(4): 430-438.

[2] Garfinkel D. Studies on pig liver microsomes I Enzymic and pigment composition of different microsomal fractions [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1958, 77(2): 493-509.

[3] Omura T, Sato R. A new cytochrome in liver microsomes [J]. Journal of Biological Chemistry, 1962, 237(4): 1375-1376.

[4] Schuler M A. Plant cytochrome P450 monooxygenases [J]. Critical Reviews in Plant Sciences, 1996, 15(3): 235-284.

[5] Zhao Y J, Cheng Q Q, Su P, et al. Research progress relating to the role of cytochrome P450 in the biosynthesis of terpenoids in medicinal plants [J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2014, 98(6): 2371-2383.

[6] 解敏敏. 煙草重要基因篇: 8. 煙草P450基因[J]. 中國煙草科學, 2015, 36(2): 118-120.

[7] Moore M T, Kr?ger R. Effect of three insecticides and two herbicides on rice () seedling germination and growth [J]. Archives of Environmental Contamination & Toxicology, 2010, 59(4): 574-581.

[8] Deng F, Hatzios K K. Characterization of cytochrome P450-mediated bensulfuron-methyl O-demethylation in rice [J]. Pesticide Biochemistry & Physiology, 2002, 74(2): 102-115.

[9] Zhou N, Tootle T L, Glazebrook J. Arabidopsis PAD3, a gene required for camalex in biosynthesis, encodes a putative cytochrome P450 monooxygenase [J]. The Plant Cell, 1999, 11(12): 2419-2428.

[10] 曹紅利, 王璐, 錢文俊, 等. 茶樹轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)控擬南芥對鹽脅迫響應(yīng)[J]. 作物學報, 2017, 43(7): 1012-1020.

[11] Ruan J, Gerendás J, H?rdter R, et al. Effect of nitrogen form and root-zone pH on growth and nitrogen uptake of tea () plants [J]. Annals of Botany, 2007, 99(2): 301-310.

[12] 曹運鵬, 程曦, 程俊, 等. 碭山酥梨細胞色素P450的基因組學分析[J]. 核農(nóng)學報, 2016, 30(2): 259-266.

[13] Gilardi G, Di Nardo G. Heme iron centers in cytochrome P450: structure and catalytic activity [J]. Rendiconti Lincei, 2017, 28(1): 159-167.

[14] 軒丹丹, 孫廉平, 張沛沛, 等. 水稻無花粉型核雄性不育突變體的鑒定與基因定位[J]. 中國水稻科學, 2017, 31(3): 247-256.

[15] 曾秀紅. 水稻簇生穗基因的精細定位[D]. 揚州: 揚州大學, 2009: 1-2.

[16] Wang E, Wang R, DeParasis J, et al. Suppression of a P450 hydroxylase gene in plant trichome glands enhances natural-product-based aphid resistance [J]. Nature Biotechnology, 2001, 19(4): 371-374.

[17] 戴素明, 周程愛, 謝丙炎, 等. 細胞色素P450表達在植物防御反應(yīng)中的作用[J]. 石河子大學學報, 2004, 22(7): 184-187.

[18] 代婭. 溫度脅迫下多年生黑麥草P450家族基因表達及LpCYP72A161甲基化差異分析[D]. 北京: 中國科學院大學, 2016: 1-2.

Molecular Cloning and Expression Analysis of Cytochrome P450andGenes in Tea Plants ()

SHAN Ruiyang, LIN Zhenghe, CHEN Zhihui, ZHONG Qiusheng, YOU Xiaomei, CHEN Changsong*

Tea Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fu′an, 355015, China

The full cDNA sequences of cytochrome P450 genes,andwere cloned fromTieguanyin leaves based on NCBI transcriptome database. The complete cDNA lengths ofandwere 1?879?bp and 1?764?bp, containing the open reading frames (ORF) of 1?539?bp and 1?533?bp, which encoded 513 and 511 amino acids, respectively. The alignment of amino acid sequences showed 42.47% of conservation between CYP71A26 and CYP71B34, which indicated that the two genes belonged to different subfamilies. The structure analysis showed that bothandcontained the classic P450 structure domains, such as helix C, helix I, helix K, Meander and heme binding domain. Phylogenetic tree analysis illustrated that there were two branches of molecular evolution for the two genes with different genetic relationship. Via predicting of their tertiary structures and functional domains, the results indicated that both genes were constituted by-pleated structure in N-terminal,-helix structure in C-terminal, and had a P450 protein structure domain (Pfam domain). qRT-PCR results showed that the expression of two genes in leaves showed opposite trends under pest damage treatments. Moreover, the decrease ofand increase ofin expression levels were detected under cold or thermal stresses. In total,andgenes were respond to biotic (like pest) and abiotic (like temperature) stresses, but the changing trends of the two genes were opposite, which might be correlated with opposite regulation systems.

, cytochrome P450, clone, subfamily gene, stress, expression opposite

TS272.2；Q52

A

1000-369X(2018)05-450-11

2017-12-08

2018-01-30

國家茶產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）、中國烏龍茶產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心專項（閩教科〔2015〕75號）、省財政廳項目（20151297）、福建省公益科研院所專項（2015R1012-10、2016R1011-3）

單睿陽，男，研究實習員，主要從事茶樹遺傳育種研究。

ccs6536597@163.com