氧化還原酶在多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的應(yīng)用進(jìn)展

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(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310014)

氧化還原酶是一類催化電子供體的電子轉(zhuǎn)移到電子受體的酶的總稱.根據(jù)電子供體的種類,氧化還原酶可分為22個(gè)亞類.因而,氧化還原酶可催化種類繁多的反應(yīng),而這些反應(yīng)往往需要輔酶的參與.作為生物催化劑,氧化還原酶具有高度的化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性,所催化的反應(yīng)具有條件溫和、速率快、產(chǎn)率高和副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn),適用于制備手性化合物[1].

在酶催化的多步反應(yīng)中,由第一種酶催化形成的中間體,自發(fā)進(jìn)行進(jìn)一步的反應(yīng)直到形成穩(wěn)定產(chǎn)物的過(guò)程,稱之為級(jí)聯(lián)反應(yīng).整個(gè)反應(yīng)在同一容器內(nèi)進(jìn)行,至少有一種酶參與催化.在過(guò)去的幾十年中,多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)已被大量開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于有機(jī)合成領(lǐng)域,例如藥物中間體的合成、生物能源的開(kāi)發(fā)和化妝品成分的加工等[2-5].多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)有相對(duì)簡(jiǎn)單的雙酶組合,也有高度復(fù)雜和專門化的多酶體系.近年來(lái),通過(guò)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)合成手性醇、胺和氨基酸已取得了顯著的進(jìn)展.一鍋法多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)具有以下優(yōu)點(diǎn):縮短反應(yīng)時(shí)間、降低產(chǎn)品回收過(guò)程的步驟和成本,改變可逆反應(yīng)的平衡使其有利于產(chǎn)物的生成,減少不穩(wěn)定中間產(chǎn)物的形成和積累等[6].因此,將多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)應(yīng)用到氧化還原酶催化合成手性醇當(dāng)中能夠結(jié)合兩者的優(yōu)勢(shì),具有很高的應(yīng)用價(jià)值.多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)可分為線性級(jí)聯(lián)、正交級(jí)聯(lián)、平行級(jí)聯(lián)和循環(huán)級(jí)聯(lián)四類[6-7].筆者主要介紹了氧化還原酶在不同多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)類型中的應(yīng)用.

1 氧化還原酶與線性級(jí)聯(lián)反應(yīng)

單一底物通過(guò)一種或多種中間體將多步反應(yīng)以一鍋法的方式轉(zhuǎn)化為單一產(chǎn)物的過(guò)程稱為線性級(jí)聯(lián)反應(yīng).線性級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以省略中間產(chǎn)物的分離,避免中間體的積累,尤其是當(dāng)中間產(chǎn)物不穩(wěn)定時(shí),級(jí)聯(lián)反應(yīng)使得反應(yīng)過(guò)程更有效.D -泛解酸內(nèi)酯(D -PL)是制備D -泛酸鈣的重要手性中間體[8],氧化還原酶和線性級(jí)聯(lián)反應(yīng)相結(jié)合在不對(duì)稱合成D -泛解酸內(nèi)酯上取得了良好的催化效果.Si等[9]通過(guò)Rhodococcuserythropolis中的L-泛解酸內(nèi)酯脫氫酶(LPLDH)催化L-泛解酸內(nèi)酯脫氫生成酮基泛解酸內(nèi)酯,中間產(chǎn)物酮基泛解酸內(nèi)酯(KPL)會(huì)自發(fā)水解成酮基泛解酸(KPA),之后在酮基泛解酸還原酶(KPR)和葡萄糖脫氫酶的雙酶作用下全部的酮基泛解酸被還原成D -泛解酸,D -泛解酸在酸性條件下最終閉環(huán)形成D -泛解酸內(nèi)酯.在該級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系中,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.768 mol/L時(shí),L-泛解酸內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化率為91.9%,當(dāng)濃度達(dá)到1.15 mol/L時(shí),轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%,其合成路徑為

另一個(gè)成功的例子是老黃酶(OYE)與羰基還原酶(CR)線性級(jí)聯(lián)催化環(huán)己烯酮兩步還原合成環(huán)己醇.Romano等[10]在釀酒酵母中共表達(dá)了老黃酶和羰基還原酶,首先由老黃酶對(duì)環(huán)己烯酮中的C=C雙鍵進(jìn)行反式氫化,隨后羰基還原酶催化羰基還原生成環(huán)己醇,產(chǎn)物得率達(dá)到了95%以上,其兩步還原過(guò)程為

2 氧化還原酶與正交級(jí)聯(lián)反應(yīng)

在正交級(jí)聯(lián)中,底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物時(shí)通過(guò)偶聯(lián)另一反應(yīng),從而實(shí)現(xiàn)輔酶/輔底物的再生或者進(jìn)一步消除副產(chǎn)物.最經(jīng)典的正交級(jí)聯(lián)是羰基還原酶偶聯(lián)脫氫酶從而實(shí)現(xiàn)輔酶再生,脫氫酶使NAD(P)+形成NAD(P)H,而NAD(P)H又在羰基還原酶催化的還原反應(yīng)中變成NAD(P)+.Zhao等[11]利用來(lái)自Saccharomycescerevisiae的羰基還原酶(SceCPR1)和Exiguobacteriumsibiricum的葡萄糖脫氫酶(EsGDH)構(gòu)建了雙酶共表達(dá)載體用于催化酮基泛解酸內(nèi)酯不對(duì)稱合成D -泛解酸內(nèi)酯.這兩種酶均屬于NADPH依賴的酶,通過(guò)添加輔底物葡萄糖實(shí)現(xiàn)了輔酶的有效再生;在該級(jí)聯(lián)反應(yīng)中,最終得率達(dá)91.6%,e.e.值達(dá)99.9%以上.羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶正交級(jí)聯(lián)實(shí)現(xiàn)有效的輔酶循環(huán)為

甲酸脫氫酶是另一種氧化還原反應(yīng)中構(gòu)建輔酶循環(huán)的常用酶,它能夠催化甲酸、甲酸銨等物質(zhì)脫氫形成CO2,同時(shí)使輔酶NAD+還原成NADH.Liu等[12]利用來(lái)自Bacilluscereus的亮氨酸脫氫酶(BcLeuDH)和來(lái)自Candidaboidinii的突變型甲酸脫氫酶(CbFDHA10C)在大腸桿菌中構(gòu)建了雙酶共表達(dá)系統(tǒng)，用于從苯甲酰甲酸合成L-苯甘氨酸,并在此基礎(chǔ)上提出了多酶調(diào)控表達(dá)的策略.通過(guò)共表達(dá)CbFDHA10C的1～4個(gè)拷貝并優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)中BcLeuDH的RBS序列,大腸桿菌BL21/pETDuet-rbs4leudh-3fdhA10C中BcLeuDH與CbFDH活力的比例調(diào)節(jié)為2∶1.使用該調(diào)控策略得到的細(xì)胞對(duì)于苯甲酰甲酸的催化活力達(dá)到了28.4 mg/(L·min·g),是不進(jìn)行表達(dá)調(diào)控的細(xì)胞的3.7倍.亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶正交級(jí)聯(lián)實(shí)現(xiàn)輔酶循環(huán)路徑為

正交級(jí)聯(lián)并不是實(shí)現(xiàn)輔酶循環(huán)的唯一方式.事實(shí)上,在線性級(jí)聯(lián)中通過(guò)氧化還原酶的巧妙組合也可實(shí)現(xiàn)輔酶循環(huán).Müller等[13]構(gòu)建了共表達(dá)P450單加氧酶和醇脫氫酶的全細(xì)胞線性級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系,并應(yīng)用于環(huán)辛烷二步氧化生成環(huán)辛酮.該體系為三酶共表達(dá)系統(tǒng),單加氧酶P450 BM3 19A12NADH能夠同時(shí)利用NADPH和NADH作為輔酶催化環(huán)辛烷生成環(huán)辛醇,而來(lái)自Lactobacillusbrevis的醇脫氫酶(Lb-ADH)和Rhodococcuserythropolis的醇脫氫酶(RE-ADH)的輔酶依賴性相反但都能催化環(huán)辛醇脫氫.因此,環(huán)辛烷二步氧化生成環(huán)辛酮的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了輔酶循環(huán),其路徑為

3 氧化還原酶與平行級(jí)聯(lián)反應(yīng)

在級(jí)聯(lián)反應(yīng)中,有兩種或多種底物通過(guò)不同的生物催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為兩種或多種產(chǎn)物,不同的催化反應(yīng)共用同一套輔酶或輔底物再生系統(tǒng),這種多酶催化體系稱之為平行級(jí)聯(lián)反應(yīng).平行級(jí)聯(lián)反應(yīng)與正交級(jí)聯(lián)反應(yīng)具有相似之處,兩者的差異在于前者的多個(gè)反應(yīng)得到的都是目的產(chǎn)物[6].例如在氧化還原反應(yīng)中,往往需要偶聯(lián)一個(gè)葡萄糖脫氫酶,使輔酶再生得以進(jìn)行.但其催化所得產(chǎn)物并不是目的產(chǎn)物而是副產(chǎn)物.Bisogno等[14]將外消旋醇的選擇性氧化和2-氯苯乙酮的不對(duì)稱還原過(guò)程相結(jié)合,同時(shí)反應(yīng)獲得兩種單一構(gòu)型的仲醇,反應(yīng)過(guò)程只需要一種脫氫酶.此外,通過(guò)使用立體選擇性相反的ADH(Prelog選擇性的Rhodococcusruber中的ADH-A和反Prelog選擇性的Lactobacillusbrevis中的LB-ADH),可以分別獲得相反構(gòu)型的醇,且e.e.值都保持在99%以上.外消旋醇的選擇性氧化與2氯苯乙酮不對(duì)稱還原相結(jié)合的平行級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程為

4 氧化還原酶與循環(huán)級(jí)聯(lián)反應(yīng)

循環(huán)級(jí)聯(lián)反應(yīng)是指不同構(gòu)型底物中的某一構(gòu)型選擇性地轉(zhuǎn)化成中間體,然后轉(zhuǎn)化成另一構(gòu)型,以此不斷改變同一化合物不同構(gòu)型的構(gòu)成比例.循環(huán)級(jí)聯(lián)反應(yīng)最常見(jiàn)的例子是胺、氨基酸、仲醇或α-羥基酸的去消旋化[7].在醇的去消旋中,通過(guò)將一種構(gòu)型的醇氧化成酮,然后酮再被還原成另一構(gòu)型的醇,這樣循環(huán)不斷消耗其中一種構(gòu)型而另一種構(gòu)型逐漸積累,理論產(chǎn)率可達(dá)100%.Li等[15]選擇來(lái)自CandidaparapsilosisCCTCC M203011的立體特異性羰基還原酶(SCR1)和來(lái)自ZygosaccharomycesrouxiiATCC14462的酮還原酶(KRD)構(gòu)建的(R,S)-1-苯基-1,2-乙二醇(PED)去消旋化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系.研究者探究了兩個(gè)酶的催化性質(zhì)并對(duì)催化條件進(jìn)行了優(yōu)化,當(dāng)SCR1/KRD活性比為1∶4,NADP+/NADPH摩爾比3∶1,在pH 7.0和30 ℃下反應(yīng)8 h,產(chǎn)物(R)-PED的產(chǎn)率為91.62%,e.e.值達(dá)到95.5%.外消旋1-苯基-1,2-乙二醇的去消旋化過(guò)程為

Xue等[16]選擇來(lái)自PseudomonasaeruginosaNUST中的FMN依賴型(S)-2-HADH催化(S)-羥基酸的脫氫,選擇來(lái)自LeuconostocmesenteroidesCCTCC M 2016063的2-酮酸還原酶(2-KAR)催化酮酸還原成D -羥基酸,同時(shí)利用來(lái)自Exiguobacteriumsibiricum的葡萄糖脫氫酶(GDH)實(shí)現(xiàn)輔酶再生.研究者分別構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28b-HADH和pCDFDuet-KAR-GDH并共同導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行三酶共表達(dá),利用該整細(xì)胞在35 ℃和pH 7.5下進(jìn)行循環(huán)級(jí)聯(lián)反應(yīng)催化多種2-羥酸化合物的去消旋化,轉(zhuǎn)化率高達(dá)98.5%.氧化還原酶催化2-羥基酸去消旋化的過(guò)程為

K?hler等[17]構(gòu)建了一個(gè)由ATHase,L-氨基酸氧化酶(LAAO),D -選擇性氨基酸氧化酶(DAAO)相結(jié)合的復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系并用于從L-賴氨酸合成L-哌啶酸.LAAO催化L-賴氨酸得到潛手性物質(zhì)經(jīng)ATHase還原得到哌啶酸的兩種構(gòu)型,DAAO選擇性氧化D -哌啶酸轉(zhuǎn)化回潛手性物質(zhì),以此逐漸提高L-哌啶酸的對(duì)映體過(guò)量值.在優(yōu)選的反應(yīng)條件下,底物的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了90%,產(chǎn)物e.e.值達(dá)到了86%.利用循環(huán)級(jí)聯(lián)反應(yīng)從L-賴氨酸生產(chǎn)L-哌啶酸的過(guò)程為

5 結(jié) 論

諸多實(shí)例表明多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)已在生物催化和有機(jī)合成領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力.多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)通常以一鍋法催化的方式進(jìn)行,免去了中間產(chǎn)物的分離提取過(guò)程,可以改變反應(yīng)平衡使其有利于產(chǎn)物的形成,提高能量和物質(zhì)的利用率,降低成本.當(dāng)中間產(chǎn)物為不穩(wěn)定的化合物時(shí),多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)尤其具有優(yōu)勢(shì).此外,平行級(jí)聯(lián)反應(yīng)提供了同時(shí)生產(chǎn)兩種手性化合物的可行方案,這將進(jìn)一步提高生物催化的效率.多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)可分為線性級(jí)聯(lián)、正交級(jí)聯(lián)、平行級(jí)聯(lián)和循環(huán)級(jí)聯(lián)等基本類型.然而實(shí)際構(gòu)建的多酶體系往往更為復(fù)雜,涉及不止一種級(jí)聯(lián)設(shè)計(jì)策略.例如輔酶循環(huán)是氧化還原酶催化體系的核心技術(shù)問(wèn)題之一,每一種級(jí)聯(lián)反應(yīng)都需要合適的輔酶循環(huán)解決方案.酶是多酶級(jí)聯(lián)體系的核心要素,而復(fù)雜的多酶級(jí)聯(lián)體系對(duì)其提出了更高的要求.氧化還原酶具有功能的多樣性、來(lái)源的廣泛性以及高度的專一性,它在級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的應(yīng)用將豐富多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的設(shè)計(jì)并最終服務(wù)于化學(xué)品的高效合成.