• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    溶氧對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響及其控制

    2018-10-16 05:42:14,
    發(fā)酵科技通訊 2018年3期
    關(guān)鍵詞:羥脯氨酸糖酸溶氧

    , , ,

    (1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457;2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,天津 300457;3.吉林大學(xué) 生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,吉林 長春 130022)

    羥脯氨酸是脯氨酸羥基化后的產(chǎn)物[1],它有四種立體異構(gòu)體,分別為順式-3-羥脯氨酸、反式-3-羥脯氨酸、順式-4-羥脯氨酸和反式-4-羥脯氨酸,其中反式-4-羥脯氨酸(文中均稱為L-羥脯氨酸)在自然界中較為常見,并且被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品和美容等行業(yè).L-羥脯氨酸可以用于合成消炎藥、碳青霉烯類等化學(xué)藥物的合成[2-3];可以作為手性催化劑催化許多不對稱反應(yīng)[4];還可以作為化妝品添加劑用來改善飲料風(fēng)味.目前國內(nèi)生產(chǎn)L-羥脯氨酸的主要方法是從膠原中提取,但生物提取法具有成本高、收率低和污染嚴(yán)重等弊端[5];化學(xué)合成法同樣具有成本高的缺點(diǎn)[6].隨著代謝工程等技術(shù)的不斷發(fā)展,以及微生物發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸所展現(xiàn)出來的優(yōu)勢[7-8],使得發(fā)酵法成為一種最具前景的L-羥脯氨酸生產(chǎn)方法.

    采用發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸時(shí),溶氧是限制大腸桿菌高密度發(fā)酵的一個(gè)關(guān)鍵因素,不適宜的溶氧水平會對菌體代謝產(chǎn)生影響,從而影響目的產(chǎn)物的積累.L-羥脯氨酸發(fā)酵生產(chǎn)需要消耗大量的氧氣[9],過低的溶氧水平會限制L-羥脯氨酸的高效生產(chǎn),同時(shí)會導(dǎo)致副產(chǎn)物乙酸的大量積累,對菌體生長和蛋白表達(dá)產(chǎn)生抑制作用.而過高的氧含量會加快細(xì)胞內(nèi)部酶的氧化過程,造成菌體提前衰老,最終導(dǎo)致產(chǎn)量下降.因此,研究了不同溶氧水平對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響,并提出一種分階段溶氧控制策略,對L-羥脯氨酸工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義.

    1 材料與方法

    1.1 菌 種

    Escherichiacoli4HYP,由天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏.

    1.2 培養(yǎng)基

    1.2.1 斜面培養(yǎng)基

    蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO40.4 g/L,NaCl 10 g/L,瓊脂20 g/L.

    1.2.2 種子培養(yǎng)基

    葡萄糖30 g/L,酵母粉6 g/L,檸檬酸0.5 g/L,(NH4)2SO41 g/L,KH2PO42 g/L,VB11 mg/L,VH0.3 mg/L.

    1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

    發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L,(NH4)2SO41 g/L,酵母粉3 g/L,檸檬酸0.5 g/L,KH2PO44 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,MnSO4·H2O 10 mg/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L,VB15 mg/L,VH0.2 mg/L.

    1.3 培養(yǎng)方法

    1.3.1 菌種活化

    在無菌條件下,用接種環(huán)取2環(huán)菌種接種于斜面培養(yǎng)基上,恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)12 h后,將其接種于250 mL茄形瓶中,37 ℃培養(yǎng)12 h.

    1.3.2 種子培養(yǎng)

    在無菌條件下,用無菌水將活化好的菌種進(jìn)行懸浮,再將其接種于5 L發(fā)酵罐中,自動控制溫度為37 ℃,pH 7.0~7.2,通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量控制溶氧在25%~30%,待菌體OD600大約達(dá)到15時(shí),準(zhǔn)備接入發(fā)酵培養(yǎng)基.

    1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

    在30 L發(fā)酵罐中,以發(fā)酵培養(yǎng)基10%的接種量進(jìn)行接種,接種后發(fā)酵液體積為14 L.控制培養(yǎng)溫度為37 ℃,通過自動流加25%的氨水溶液控制pH為7.0~7.2,通過對攪拌轉(zhuǎn)速、通風(fēng)量和罐壓的調(diào)節(jié)使溶氧保持在相應(yīng)的水平,當(dāng)培養(yǎng)基中底糖耗盡時(shí),以一定的脈沖比自動流加80%的葡萄糖溶液,將發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛瓤刂圃?%左右.發(fā)酵過程中,每隔2 h取樣、測樣、記錄數(shù)據(jù).

    1.4 分析方法

    1.4.1 溶氧及pH的檢測

    溶氧是采用發(fā)酵罐連接的溶氧電極進(jìn)行檢測;pH是采用發(fā)酵罐連接的pH電極和精密pH試紙(6.4~8.0)進(jìn)行檢測[10].

    1.4.2 菌體濃度的檢測

    見參考文獻(xiàn)[11].

    1.4.3 L-羥脯氨酸和乙酸含量的檢測

    見參考文獻(xiàn)[12].

    1.4.4 糖酸轉(zhuǎn)化率的計(jì)算方法

    糖酸轉(zhuǎn)化率=

    2 結(jié)果與分析

    為了研究不同溶氧水平對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響,分別使發(fā)酵溶氧維持在10%~20%,20%~30%和30%~40%,對發(fā)酵過程中菌體生長情況、L-羥脯氨酸產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率和副產(chǎn)物乙酸積累量進(jìn)行考察,確定L-羥脯氨酸發(fā)酵的最佳供氧方式.

    2.1 溶氧對菌體生長和L-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響

    在不同的溶氧水平下進(jìn)行L-羥脯氨酸的發(fā)酵,發(fā)酵過程中菌體生長情況如圖1所示,L-羥脯氨酸產(chǎn)量如圖2所示.

    圖1 不同溶氧水平對菌體生長的影響Fig.1 Effect of different levels of dissolved oxygen on the growth of bacteria

    圖2 不同溶氧水平對L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effect of different levels of dissolved oxygen on L-hydroxyproline production

    溶氧對氨基酸發(fā)酵有很大影響,溶氧過高會抑制菌體生長,并加速菌體衰老,過低也會對菌體代謝產(chǎn)生影響[13].由圖1和圖2可知:采用不同的溶氧水平進(jìn)行L-羥脯氨酸發(fā)酵時(shí),發(fā)酵過程中菌體生長和產(chǎn)物積累情況差異明顯.從菌體生長情況來看,當(dāng)發(fā)酵過程中溶氧維持在10%~20%時(shí),菌體OD600為115.1,隨著溶氧提高到20%~30%,菌體OD600顯著提高,達(dá)到了125.4,而將溶氧繼續(xù)提高至30%~40%后,菌體OD600大幅下降,僅為96.4,與溶氧水平在20%~30%的OD600相比,降低了23.1%.從L-羥脯氨酸積累情況來看,10%~20%的溶氧水平難以滿足菌體產(chǎn)酸需要,此時(shí),L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度只有32.4 g/L;當(dāng)發(fā)酵溶氧維持在30%~40%時(shí),發(fā)酵前24 h,菌體表現(xiàn)出較高的產(chǎn)酸能力,但24 h之后,由于較高的溶氧使菌體早衰,導(dǎo)致產(chǎn)酸速率下降,發(fā)酵結(jié)束時(shí),L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度為36.5 g/L;當(dāng)采用20%~30%的溶氧進(jìn)行發(fā)酵時(shí),L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度最高,達(dá)到42.0 g/L,較10%~20%溶氧下的質(zhì)量濃度提高了29.6%.

    2.2 溶氧對糖酸轉(zhuǎn)化率和乙酸積累量的影響

    重組大腸桿菌發(fā)酵過程中,乙酸是主要的代謝副產(chǎn)物,它的積累會抑制菌體生長和重組蛋白的表達(dá),而供氧不足是乙酸產(chǎn)生的一個(gè)主要原因[14].實(shí)驗(yàn)過程中,不同溶氧水平對糖酸轉(zhuǎn)化率和乙酸質(zhì)量濃度的影響如圖3所示.

    圖3 不同溶氧水平對糖酸轉(zhuǎn)化率和乙酸質(zhì)量濃度的影響Fig.3 Effect of different levels of dissolved oxygen on the glucose conversion rate and accumulation of acetic acid

    由圖3可知:分別采用10%~20%,20%~30%和30%~40%的溶氧進(jìn)行發(fā)酵時(shí),當(dāng)溶氧在20%~30%時(shí),糖酸轉(zhuǎn)化率最高,為19.8%,此條件下的乙酸質(zhì)量濃度為2.8 g/L;當(dāng)溶氧為10%~20%時(shí),因溶氧無法滿足菌體生長和產(chǎn)酸需要,糖酸轉(zhuǎn)化率有所下降,與20%~30%溶氧條件下的糖酸轉(zhuǎn)化率相比,下降了6.7%,并且此時(shí)較低的溶氧限制了菌體的呼吸,使得乙酸質(zhì)量濃度達(dá)到5.4 g/L;當(dāng)溶氧為30%~40%時(shí),乙酸質(zhì)量濃度最低,僅有1.4 g/L,但該溶氧條件下的糖酸轉(zhuǎn)化率最低,為16.3%.因此,在三種不同的溶氧水平范圍內(nèi),20%~30%的溶氧最有利于L-羥脯氨酸發(fā)酵.

    2.3 分階段溶氧控制策略的提出及驗(yàn)證

    微生物發(fā)酵的目的在于使底物的消耗盡可能多的轉(zhuǎn)化為目的產(chǎn)物[15].為了提高整個(gè)發(fā)酵過程中L-羥脯氨酸的產(chǎn)率,在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上提出分階段溶氧控制策略,即在發(fā)酵前期(0~8 h),將溶氧維持在20%~30%;發(fā)酵中期(8~24 h),菌體快速增殖和產(chǎn)酸需要消耗大量的氧氣,此階段將溶氧控制在30%~40%;發(fā)酵后期(24~32 h),菌體代謝減弱,耗氧量減少,將溶氧降至20%~30%.按照該溶氧控制策略進(jìn)行發(fā)酵,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4,5所示.

    由圖4可知:采用分階段溶氧控制策略進(jìn)行L-羥脯氨酸發(fā)酵時(shí),發(fā)酵32 h,菌體OD600達(dá)到128.7,與溶氧為20%~30%的恒定供氧發(fā)酵相比,菌體總量稍有增長,L-羥脯氨酸產(chǎn)量達(dá)45.3 g/L,提高了7.9%.由圖5可知:分階段供氧下糖酸轉(zhuǎn)化率為20.7%,乙酸積累量為1.7 g/L,與20%~30%的恒定供氧發(fā)酵相比,糖酸轉(zhuǎn)化率提高了4.5%,乙酸積累量減少了39.3%.可見,采用分階段溶氧控制策略既有利于菌體生長,促進(jìn)產(chǎn)物高效合成,又能夠有效降低副產(chǎn)物乙酸的形成,使整個(gè)發(fā)酵過程表現(xiàn)出良好的狀態(tài).

    圖4 分階段溶氧控制策略下OD600和L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度Fig.4 The OD600and L-hydroxyproline production under the strategy of staged dissolved oxygen control

    圖5 不同溶氧控制方法對糖酸轉(zhuǎn)化率和乙酸質(zhì)量濃度的影響Fig.5 Effect of different dissolved oxygen control methods on the glucose conversion rate and accumulation of acetic acid

    3 結(jié) 論

    溶氧對氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)具有重要影響,發(fā)酵液中溶氧水平的高低會直接影響微生物體內(nèi)的酶活和代謝,進(jìn)而影響菌體生長和產(chǎn)物積累[16].研究了不同溶氧水平對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響,結(jié)果表明:10%~20%的溶氧水平不能滿足L-羥脯氨酸的發(fā)酵需要,并且會導(dǎo)致副產(chǎn)物乙酸的大量積累;30%~40%的溶氧較高,會使菌體提前衰老,導(dǎo)致L-羥脯氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率偏低;而將溶氧維持在20%~30%時(shí),菌體OD600、L-羥脯氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率較高.在確定了不同溶氧水平下的發(fā)酵情況后,提出一種分階段溶氧控制策略,即發(fā)酵前期(0~8 h),溶氧維持在20%~30%;發(fā)酵中期(8~24 h),溶氧控制在30%~40%;發(fā)酵后期(24~32 h),溶氧維持在20%~30%.結(jié)果表明:采用分階段溶氧控制策略使L-羥脯氨酸發(fā)酵整個(gè)過程表現(xiàn)出良好的狀態(tài),發(fā)酵32 h,菌體OD600為128.7,L-羥脯氨酸產(chǎn)量達(dá)45.3 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到20.7%,乙酸積累量僅有1.7 g/L.

    猜你喜歡
    羥脯氨酸糖酸溶氧
    高效液相色譜法測定紡織品中的羥脯氨酸含量
    越酸的水果,維生素C 的含量越高?
    ‘玫瑰香’和‘紅地球’葡萄雜交后代果實(shí)糖酸性狀遺傳傾向分析
    河北果樹(2021年4期)2021-12-02 01:14:38
    7月增氧有學(xué)問,如何在對蝦養(yǎng)殖中后期做好溶氧管理?
    物聯(lián)網(wǎng)監(jiān)控獲得的溶解氧曲線與池塘水質(zhì)指標(biāo)的內(nèi)在關(guān)系
    增氧泵如何合理使用?
    α-酮戊二酸對L-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響
    中國釀造(2018年7期)2018-08-10 02:16:48
    一種發(fā)電機(jī)定子冷卻水低溶氧控制方法探討
    高效液相色譜法檢測醬油中羥脯氨酸的含量研究
    不同砧穗組合對寒富蘋果果實(shí)品質(zhì)的影響
    山西果樹(2014年6期)2015-03-12 20:40:56
    91成年电影在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 蜜桃在线观看..| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产色视频综合| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲av美国av| 1024香蕉在线观看| 久久狼人影院| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲专区字幕在线| 搡老熟女国产l中国老女人| 热re99久久国产66热| 大片电影免费在线观看免费| 电影成人av| 亚洲av电影在线进入| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 99在线人妻在线中文字幕 | 国产精品成人在线| 亚洲美女黄片视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 在线观看www视频免费| 日本一区二区免费在线视频| 视频区图区小说| 无人区码免费观看不卡 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 欧美日韩福利视频一区二区| 又大又爽又粗| 精品国产一区二区三区四区第35| 日韩欧美国产一区二区入口| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产精品免费视频内射| 757午夜福利合集在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品国产乱子伦一区二区三区| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲情色 制服丝袜| 久久影院123| 欧美久久黑人一区二区| 国产成人av激情在线播放| 中文字幕最新亚洲高清| 91大片在线观看| 黄片播放在线免费| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 免费在线观看日本一区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲av成人一区二区三| 精品国产国语对白av| 香蕉久久夜色| 一区二区三区乱码不卡18| 黑人操中国人逼视频| 无限看片的www在线观看| 国产精品久久久久成人av| 高清欧美精品videossex| 在线观看舔阴道视频| 在线观看舔阴道视频| 成人永久免费在线观看视频 | 欧美日本中文国产一区发布| 99在线人妻在线中文字幕 | 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美激情极品国产一区二区三区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 99在线人妻在线中文字幕 | 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美 日韩 精品 国产| 蜜桃国产av成人99| 麻豆乱淫一区二区| 成人特级黄色片久久久久久久 | 日韩视频在线欧美| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久久欧美国产精品| 91精品三级在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲久久久国产精品| 精品亚洲成a人片在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 伦理电影免费视频| 最近最新中文字幕大全电影3 | 激情视频va一区二区三区| 亚洲色图av天堂| 日日爽夜夜爽网站| 国产男女内射视频| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产精品久久久久久精品古装| 欧美日韩亚洲高清精品| 日本五十路高清| 99re在线观看精品视频| 久久久欧美国产精品| 日本黄色日本黄色录像| 成人亚洲精品一区在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 最近最新免费中文字幕在线| 男人操女人黄网站| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲avbb在线观看| 久久久精品94久久精品| 精品国产乱子伦一区二区三区| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 欧美乱码精品一区二区三区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 12—13女人毛片做爰片一| 99久久人妻综合| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 免费在线观看完整版高清| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久久久久久久久久久大奶| 国产熟女午夜一区二区三区| 午夜老司机福利片| 精品久久蜜臀av无| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | www日本在线高清视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 天堂俺去俺来也www色官网| 丝瓜视频免费看黄片| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产一区二区在线观看av| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 免费在线观看完整版高清| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产老妇伦熟女老妇高清| 黄色丝袜av网址大全| 精品国产乱码久久久久久小说| 日本a在线网址| 日韩欧美三级三区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久久久网色| 久久影院123| 老司机午夜福利在线观看视频 | 成人国语在线视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| √禁漫天堂资源中文www| 在线观看免费高清a一片| 一区二区三区国产精品乱码| 欧美日韩国产mv在线观看视频| av免费在线观看网站| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲综合色网址| 中文字幕最新亚洲高清| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 一本综合久久免费| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 婷婷成人精品国产| 无遮挡黄片免费观看| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产免费现黄频在线看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 最近最新中文字幕大全免费视频| 69精品国产乱码久久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品少妇久久久久久888优播| 岛国在线观看网站| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲av美国av| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产成人影院久久av| 亚洲伊人久久精品综合| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲中文字幕日韩| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久亚洲真实| 视频区图区小说| 黄色丝袜av网址大全| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品福利观看| 久久人人97超碰香蕉20202| avwww免费| 久久久水蜜桃国产精品网| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 最黄视频免费看| 一级片'在线观看视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 高清欧美精品videossex| 久久婷婷成人综合色麻豆| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 午夜福利乱码中文字幕| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 最黄视频免费看| 91大片在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 不卡一级毛片| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲,欧美精品.| 69av精品久久久久久 | www.熟女人妻精品国产| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 欧美乱妇无乱码| 最近最新免费中文字幕在线| 精品福利永久在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 他把我摸到了高潮在线观看 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 91麻豆av在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲免费av在线视频| 黄片播放在线免费| 精品福利观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 黄色视频不卡| 亚洲五月婷婷丁香| 人妻久久中文字幕网| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产成人av教育| 黄色a级毛片大全视频| 午夜两性在线视频| 啦啦啦免费观看视频1| 午夜福利免费观看在线| 青草久久国产| 国产片内射在线| 欧美日韩av久久| 国产真人三级小视频在线观看| 日韩视频一区二区在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲成人国产一区在线观看| 精品福利永久在线观看| 久久久久视频综合| 亚洲av成人一区二区三| 18禁观看日本| www.999成人在线观看| 免费观看a级毛片全部| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产精品免费一区二区三区在线 | 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲av电影在线进入| 美女主播在线视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲专区国产一区二区| 男女无遮挡免费网站观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 欧美黄色淫秽网站| 精品国产国语对白av| 中文字幕制服av| 老汉色av国产亚洲站长工具| 69精品国产乱码久久久| 两个人看的免费小视频| 97人妻天天添夜夜摸| 免费少妇av软件| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 精品国产一区二区久久| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲熟女毛片儿| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产亚洲精品久久久久5区| 精品久久久久久电影网| 欧美乱码精品一区二区三区| 老熟女久久久| 久久国产精品大桥未久av| 午夜老司机福利片| 国产成人免费无遮挡视频| 男人舔女人的私密视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 日本一区二区免费在线视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲全国av大片| 美女高潮到喷水免费观看| 欧美精品一区二区免费开放| 搡老乐熟女国产| 老司机在亚洲福利影院| 搡老岳熟女国产| 18禁美女被吸乳视频| 国产单亲对白刺激| 又黄又粗又硬又大视频| 国产深夜福利视频在线观看| 国产精品二区激情视频| 国产福利在线免费观看视频| 欧美成人免费av一区二区三区 | 成人国产av品久久久| 成年动漫av网址| 久久99一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9 | av片东京热男人的天堂| 一区二区三区乱码不卡18| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 99精品久久久久人妻精品| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 欧美在线黄色| 亚洲国产看品久久| 欧美激情 高清一区二区三区| 18在线观看网站| 在线播放国产精品三级| 一级a爱视频在线免费观看| 国产主播在线观看一区二区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久久久国产一级毛片高清牌| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 涩涩av久久男人的天堂| 国产精品一区二区在线观看99| 视频区图区小说| 在线观看舔阴道视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲成人手机| 男人舔女人的私密视频| 久久久久视频综合| 国产精品国产高清国产av | www.自偷自拍.com| av有码第一页| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产99久久九九免费精品| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 日本a在线网址| 亚洲情色 制服丝袜| av线在线观看网站| 天天操日日干夜夜撸| 久久青草综合色| 嫩草影视91久久| 黄色视频,在线免费观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 我要看黄色一级片免费的| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久久国产一区二区| 成年版毛片免费区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 99riav亚洲国产免费| 黄色a级毛片大全视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 五月开心婷婷网| 后天国语完整版免费观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 老司机影院毛片| 欧美精品一区二区大全| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 中文欧美无线码| 亚洲性夜色夜夜综合| 高清毛片免费观看视频网站 | 久久久久久免费高清国产稀缺| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产麻豆69| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美激情 高清一区二区三区| 人人妻人人澡人人看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 老司机亚洲免费影院| 午夜福利欧美成人| 一级,二级,三级黄色视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 好男人电影高清在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 婷婷丁香在线五月| 少妇 在线观看| videosex国产| 亚洲成国产人片在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美日韩av久久| 啦啦啦 在线观看视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | www.999成人在线观看| 无人区码免费观看不卡 | 叶爱在线成人免费视频播放| 大片电影免费在线观看免费| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产一区二区激情短视频| 国产激情久久老熟女| 不卡一级毛片| 黄色视频,在线免费观看| 多毛熟女@视频| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 国产欧美日韩一区二区三| 69精品国产乱码久久久| 黑人操中国人逼视频| 午夜福利一区二区在线看| 欧美日韩福利视频一区二区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 好男人电影高清在线观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 丰满迷人的少妇在线观看| 午夜免费成人在线视频| 老鸭窝网址在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 国产在线观看jvid| 日韩大码丰满熟妇| 在线观看舔阴道视频| 搡老岳熟女国产| 日本av免费视频播放| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲精品一二三| 99热国产这里只有精品6| a级毛片黄视频| 美女高潮到喷水免费观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 不卡一级毛片| 久久精品国产亚洲av高清一级| 午夜免费鲁丝| 丁香欧美五月| 久久九九热精品免费| 91九色精品人成在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 制服人妻中文乱码| 成人18禁在线播放| 黄色 视频免费看| 精品国产乱码久久久久久男人| 老司机福利观看| 老汉色∧v一级毛片| 精品免费久久久久久久清纯 | 多毛熟女@视频| 中文字幕制服av| 亚洲av第一区精品v没综合| 丰满迷人的少妇在线观看| 色在线成人网| 久久性视频一级片| 亚洲午夜理论影院| 欧美激情 高清一区二区三区| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 女人久久www免费人成看片| 国产成人啪精品午夜网站| 丝袜在线中文字幕| 久久中文字幕人妻熟女| 欧美精品av麻豆av| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲人成电影观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 在线永久观看黄色视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲av美国av| 欧美一级毛片孕妇| 12—13女人毛片做爰片一| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产人伦9x9x在线观看| 免费看a级黄色片| 久久精品亚洲av国产电影网| 99九九在线精品视频| 亚洲,欧美精品.| 精品久久蜜臀av无| 国产成人欧美| av超薄肉色丝袜交足视频| 99九九在线精品视频| 国产伦理片在线播放av一区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美日韩黄片免| 久久久久久久精品吃奶| 色综合婷婷激情| 热99久久久久精品小说推荐| 首页视频小说图片口味搜索| 婷婷成人精品国产| 亚洲av第一区精品v没综合| 啦啦啦在线免费观看视频4| 少妇被粗大的猛进出69影院| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲一码二码三码区别大吗| 天堂8中文在线网| 精品一区二区三卡| 亚洲国产av影院在线观看| 欧美日韩黄片免| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲av美国av| 色综合欧美亚洲国产小说| 自线自在国产av| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲精品国产一区二区精华液| 99国产极品粉嫩在线观看| 成人手机av| 五月天丁香电影| 欧美日本中文国产一区发布| 伦理电影免费视频| 丁香欧美五月| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲精品在线美女| 一级片免费观看大全| 国产在视频线精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产人伦9x9x在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲人成电影免费在线| 国产日韩欧美视频二区| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲色图av天堂| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品电影一区二区三区 | 人妻 亚洲 视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲一区二区三区欧美精品| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 高清视频免费观看一区二区| 高清在线国产一区| 久久亚洲精品不卡| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 91成年电影在线观看| 国精品久久久久久国模美| 99re6热这里在线精品视频| svipshipincom国产片| 亚洲国产看品久久| 91麻豆av在线| 国产成人系列免费观看| 首页视频小说图片口味搜索| 国产野战对白在线观看| 国产麻豆69| 欧美日韩亚洲高清精品| 男人操女人黄网站| 欧美 日韩 精品 国产| 69精品国产乱码久久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| 99riav亚洲国产免费| 欧美成人午夜精品| 丝袜人妻中文字幕| 久久国产精品影院| 免费看十八禁软件| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 少妇 在线观看| 又大又爽又粗| 国产视频一区二区在线看| 麻豆av在线久日| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲精品自拍成人| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产黄色免费在线视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 男女边摸边吃奶| 在线观看免费视频日本深夜| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲精品在线美女| 日本av免费视频播放| 成人特级黄色片久久久久久久 | 午夜激情久久久久久久| 一区在线观看完整版| 在线观看免费视频日本深夜| 日韩欧美免费精品| 亚洲免费av在线视频| 老熟女久久久| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产亚洲一区二区精品| 黄色视频,在线免费观看| 日本av免费视频播放| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产黄频视频在线观看| 亚洲精品在线美女| 天堂中文最新版在线下载| 欧美精品啪啪一区二区三区| 美女高潮到喷水免费观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产91精品成人一区二区三区 | 男女高潮啪啪啪动态图| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产精品 国内视频| 亚洲专区字幕在线| a级片在线免费高清观看视频| 黄片播放在线免费| 国产91精品成人一区二区三区 | 麻豆乱淫一区二区| 国产三级黄色录像| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久久久久久国产电影| 亚洲av国产av综合av卡| 无限看片的www在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 啦啦啦在线免费观看视频4| 99re在线观看精品视频| 9色porny在线观看| 日本欧美视频一区| 国产成人啪精品午夜网站| 在线观看www视频免费| 久久久精品免费免费高清| 高清在线国产一区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久香蕉激情| av线在线观看网站| 中文欧美无线码| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁|