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    溶氧對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響及其控制

    2018-10-16 05:42:14,
    發(fā)酵科技通訊 2018年3期
    關(guān)鍵詞:羥脯氨酸糖酸溶氧

    , , ,

    (1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457;2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,天津 300457;3.吉林大學(xué) 生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,吉林 長春 130022)

    羥脯氨酸是脯氨酸羥基化后的產(chǎn)物[1],它有四種立體異構(gòu)體,分別為順式-3-羥脯氨酸、反式-3-羥脯氨酸、順式-4-羥脯氨酸和反式-4-羥脯氨酸,其中反式-4-羥脯氨酸(文中均稱為L-羥脯氨酸)在自然界中較為常見,并且被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品和美容等行業(yè).L-羥脯氨酸可以用于合成消炎藥、碳青霉烯類等化學(xué)藥物的合成[2-3];可以作為手性催化劑催化許多不對稱反應(yīng)[4];還可以作為化妝品添加劑用來改善飲料風(fēng)味.目前國內(nèi)生產(chǎn)L-羥脯氨酸的主要方法是從膠原中提取,但生物提取法具有成本高、收率低和污染嚴(yán)重等弊端[5];化學(xué)合成法同樣具有成本高的缺點(diǎn)[6].隨著代謝工程等技術(shù)的不斷發(fā)展,以及微生物發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸所展現(xiàn)出來的優(yōu)勢[7-8],使得發(fā)酵法成為一種最具前景的L-羥脯氨酸生產(chǎn)方法.

    采用發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸時(shí),溶氧是限制大腸桿菌高密度發(fā)酵的一個(gè)關(guān)鍵因素,不適宜的溶氧水平會對菌體代謝產(chǎn)生影響,從而影響目的產(chǎn)物的積累.L-羥脯氨酸發(fā)酵生產(chǎn)需要消耗大量的氧氣[9],過低的溶氧水平會限制L-羥脯氨酸的高效生產(chǎn),同時(shí)會導(dǎo)致副產(chǎn)物乙酸的大量積累,對菌體生長和蛋白表達(dá)產(chǎn)生抑制作用.而過高的氧含量會加快細(xì)胞內(nèi)部酶的氧化過程,造成菌體提前衰老,最終導(dǎo)致產(chǎn)量下降.因此,研究了不同溶氧水平對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響,并提出一種分階段溶氧控制策略,對L-羥脯氨酸工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義.

    1 材料與方法

    1.1 菌 種

    Escherichiacoli4HYP,由天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏.

    1.2 培養(yǎng)基

    1.2.1 斜面培養(yǎng)基

    蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO40.4 g/L,NaCl 10 g/L,瓊脂20 g/L.

    1.2.2 種子培養(yǎng)基

    葡萄糖30 g/L,酵母粉6 g/L,檸檬酸0.5 g/L,(NH4)2SO41 g/L,KH2PO42 g/L,VB11 mg/L,VH0.3 mg/L.

    1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

    發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L,(NH4)2SO41 g/L,酵母粉3 g/L,檸檬酸0.5 g/L,KH2PO44 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,MnSO4·H2O 10 mg/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L,VB15 mg/L,VH0.2 mg/L.

    1.3 培養(yǎng)方法

    1.3.1 菌種活化

    在無菌條件下,用接種環(huán)取2環(huán)菌種接種于斜面培養(yǎng)基上,恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)12 h后,將其接種于250 mL茄形瓶中,37 ℃培養(yǎng)12 h.

    1.3.2 種子培養(yǎng)

    在無菌條件下,用無菌水將活化好的菌種進(jìn)行懸浮,再將其接種于5 L發(fā)酵罐中,自動控制溫度為37 ℃,pH 7.0~7.2,通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量控制溶氧在25%~30%,待菌體OD600大約達(dá)到15時(shí),準(zhǔn)備接入發(fā)酵培養(yǎng)基.

    1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

    在30 L發(fā)酵罐中,以發(fā)酵培養(yǎng)基10%的接種量進(jìn)行接種,接種后發(fā)酵液體積為14 L.控制培養(yǎng)溫度為37 ℃,通過自動流加25%的氨水溶液控制pH為7.0~7.2,通過對攪拌轉(zhuǎn)速、通風(fēng)量和罐壓的調(diào)節(jié)使溶氧保持在相應(yīng)的水平,當(dāng)培養(yǎng)基中底糖耗盡時(shí),以一定的脈沖比自動流加80%的葡萄糖溶液,將發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛瓤刂圃?%左右.發(fā)酵過程中,每隔2 h取樣、測樣、記錄數(shù)據(jù).

    1.4 分析方法

    1.4.1 溶氧及pH的檢測

    溶氧是采用發(fā)酵罐連接的溶氧電極進(jìn)行檢測;pH是采用發(fā)酵罐連接的pH電極和精密pH試紙(6.4~8.0)進(jìn)行檢測[10].

    1.4.2 菌體濃度的檢測

    見參考文獻(xiàn)[11].

    1.4.3 L-羥脯氨酸和乙酸含量的檢測

    見參考文獻(xiàn)[12].

    1.4.4 糖酸轉(zhuǎn)化率的計(jì)算方法

    糖酸轉(zhuǎn)化率=

    2 結(jié)果與分析

    為了研究不同溶氧水平對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響,分別使發(fā)酵溶氧維持在10%~20%,20%~30%和30%~40%,對發(fā)酵過程中菌體生長情況、L-羥脯氨酸產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率和副產(chǎn)物乙酸積累量進(jìn)行考察,確定L-羥脯氨酸發(fā)酵的最佳供氧方式.

    2.1 溶氧對菌體生長和L-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響

    在不同的溶氧水平下進(jìn)行L-羥脯氨酸的發(fā)酵,發(fā)酵過程中菌體生長情況如圖1所示,L-羥脯氨酸產(chǎn)量如圖2所示.

    圖1 不同溶氧水平對菌體生長的影響Fig.1 Effect of different levels of dissolved oxygen on the growth of bacteria

    圖2 不同溶氧水平對L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effect of different levels of dissolved oxygen on L-hydroxyproline production

    溶氧對氨基酸發(fā)酵有很大影響,溶氧過高會抑制菌體生長,并加速菌體衰老,過低也會對菌體代謝產(chǎn)生影響[13].由圖1和圖2可知:采用不同的溶氧水平進(jìn)行L-羥脯氨酸發(fā)酵時(shí),發(fā)酵過程中菌體生長和產(chǎn)物積累情況差異明顯.從菌體生長情況來看,當(dāng)發(fā)酵過程中溶氧維持在10%~20%時(shí),菌體OD600為115.1,隨著溶氧提高到20%~30%,菌體OD600顯著提高,達(dá)到了125.4,而將溶氧繼續(xù)提高至30%~40%后,菌體OD600大幅下降,僅為96.4,與溶氧水平在20%~30%的OD600相比,降低了23.1%.從L-羥脯氨酸積累情況來看,10%~20%的溶氧水平難以滿足菌體產(chǎn)酸需要,此時(shí),L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度只有32.4 g/L;當(dāng)發(fā)酵溶氧維持在30%~40%時(shí),發(fā)酵前24 h,菌體表現(xiàn)出較高的產(chǎn)酸能力,但24 h之后,由于較高的溶氧使菌體早衰,導(dǎo)致產(chǎn)酸速率下降,發(fā)酵結(jié)束時(shí),L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度為36.5 g/L;當(dāng)采用20%~30%的溶氧進(jìn)行發(fā)酵時(shí),L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度最高,達(dá)到42.0 g/L,較10%~20%溶氧下的質(zhì)量濃度提高了29.6%.

    2.2 溶氧對糖酸轉(zhuǎn)化率和乙酸積累量的影響

    重組大腸桿菌發(fā)酵過程中,乙酸是主要的代謝副產(chǎn)物,它的積累會抑制菌體生長和重組蛋白的表達(dá),而供氧不足是乙酸產(chǎn)生的一個(gè)主要原因[14].實(shí)驗(yàn)過程中,不同溶氧水平對糖酸轉(zhuǎn)化率和乙酸質(zhì)量濃度的影響如圖3所示.

    圖3 不同溶氧水平對糖酸轉(zhuǎn)化率和乙酸質(zhì)量濃度的影響Fig.3 Effect of different levels of dissolved oxygen on the glucose conversion rate and accumulation of acetic acid

    由圖3可知:分別采用10%~20%,20%~30%和30%~40%的溶氧進(jìn)行發(fā)酵時(shí),當(dāng)溶氧在20%~30%時(shí),糖酸轉(zhuǎn)化率最高,為19.8%,此條件下的乙酸質(zhì)量濃度為2.8 g/L;當(dāng)溶氧為10%~20%時(shí),因溶氧無法滿足菌體生長和產(chǎn)酸需要,糖酸轉(zhuǎn)化率有所下降,與20%~30%溶氧條件下的糖酸轉(zhuǎn)化率相比,下降了6.7%,并且此時(shí)較低的溶氧限制了菌體的呼吸,使得乙酸質(zhì)量濃度達(dá)到5.4 g/L;當(dāng)溶氧為30%~40%時(shí),乙酸質(zhì)量濃度最低,僅有1.4 g/L,但該溶氧條件下的糖酸轉(zhuǎn)化率最低,為16.3%.因此,在三種不同的溶氧水平范圍內(nèi),20%~30%的溶氧最有利于L-羥脯氨酸發(fā)酵.

    2.3 分階段溶氧控制策略的提出及驗(yàn)證

    微生物發(fā)酵的目的在于使底物的消耗盡可能多的轉(zhuǎn)化為目的產(chǎn)物[15].為了提高整個(gè)發(fā)酵過程中L-羥脯氨酸的產(chǎn)率,在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上提出分階段溶氧控制策略,即在發(fā)酵前期(0~8 h),將溶氧維持在20%~30%;發(fā)酵中期(8~24 h),菌體快速增殖和產(chǎn)酸需要消耗大量的氧氣,此階段將溶氧控制在30%~40%;發(fā)酵后期(24~32 h),菌體代謝減弱,耗氧量減少,將溶氧降至20%~30%.按照該溶氧控制策略進(jìn)行發(fā)酵,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4,5所示.

    由圖4可知:采用分階段溶氧控制策略進(jìn)行L-羥脯氨酸發(fā)酵時(shí),發(fā)酵32 h,菌體OD600達(dá)到128.7,與溶氧為20%~30%的恒定供氧發(fā)酵相比,菌體總量稍有增長,L-羥脯氨酸產(chǎn)量達(dá)45.3 g/L,提高了7.9%.由圖5可知:分階段供氧下糖酸轉(zhuǎn)化率為20.7%,乙酸積累量為1.7 g/L,與20%~30%的恒定供氧發(fā)酵相比,糖酸轉(zhuǎn)化率提高了4.5%,乙酸積累量減少了39.3%.可見,采用分階段溶氧控制策略既有利于菌體生長,促進(jìn)產(chǎn)物高效合成,又能夠有效降低副產(chǎn)物乙酸的形成,使整個(gè)發(fā)酵過程表現(xiàn)出良好的狀態(tài).

    圖4 分階段溶氧控制策略下OD600和L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度Fig.4 The OD600and L-hydroxyproline production under the strategy of staged dissolved oxygen control

    圖5 不同溶氧控制方法對糖酸轉(zhuǎn)化率和乙酸質(zhì)量濃度的影響Fig.5 Effect of different dissolved oxygen control methods on the glucose conversion rate and accumulation of acetic acid

    3 結(jié) 論

    溶氧對氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)具有重要影響,發(fā)酵液中溶氧水平的高低會直接影響微生物體內(nèi)的酶活和代謝,進(jìn)而影響菌體生長和產(chǎn)物積累[16].研究了不同溶氧水平對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響,結(jié)果表明:10%~20%的溶氧水平不能滿足L-羥脯氨酸的發(fā)酵需要,并且會導(dǎo)致副產(chǎn)物乙酸的大量積累;30%~40%的溶氧較高,會使菌體提前衰老,導(dǎo)致L-羥脯氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率偏低;而將溶氧維持在20%~30%時(shí),菌體OD600、L-羥脯氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率較高.在確定了不同溶氧水平下的發(fā)酵情況后,提出一種分階段溶氧控制策略,即發(fā)酵前期(0~8 h),溶氧維持在20%~30%;發(fā)酵中期(8~24 h),溶氧控制在30%~40%;發(fā)酵后期(24~32 h),溶氧維持在20%~30%.結(jié)果表明:采用分階段溶氧控制策略使L-羥脯氨酸發(fā)酵整個(gè)過程表現(xiàn)出良好的狀態(tài),發(fā)酵32 h,菌體OD600為128.7,L-羥脯氨酸產(chǎn)量達(dá)45.3 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到20.7%,乙酸積累量僅有1.7 g/L.

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