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    裂殖酵母醛酮還原酶基因的克隆與誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

    2018-10-16 04:47:22,,,,,
    發(fā)酵科技通訊 2018年3期
    關(guān)鍵詞:誘導(dǎo)劑還原酶菌體

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    (浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310014)

    微生物醛酮還原酶(Aldo-keto reductase, AKR)是醛酮還原酶家族的主要組成,通常為NADP(H)專一性依賴型,含有高度保守的(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)[1].微生物醛酮還原酶具有來源的豐富性和催化底物的多樣性等特性,其作為生物催化劑在酶法合成手性醇方面已有成功的應(yīng)用.例如,王亞軍等[2]通過理性設(shè)計對源自Kluyveromyceslactis的醛酮還原酶進(jìn)行了分子改造,該突變酶與源自Exiguobacteriumsibiricum的葡萄糖脫氫酶進(jìn)行共表達(dá)構(gòu)建整細(xì)胞催化劑,并應(yīng)用于制備光學(xué)純6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯,生產(chǎn)效率達(dá)到了243.2 kg/(m3·d).

    D-泛解酸內(nèi)酯作為一種典型的手性醇化合物,是用于D-泛酸及D-泛醇合成的重要手性中間體[3].目前,在工業(yè)規(guī)模上通過內(nèi)酯水解酶催化混旋泛解酸內(nèi)酯的選擇性拆分來制備D-泛解酸內(nèi)酯,而基于酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶和泛解酸內(nèi)酯脫氫酶的氧化還原酶法在酶法合成D-泛解酸內(nèi)酯方面已展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力[4].本課題組前期研究已從釀酒酵母中克隆表達(dá)了2 個酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶SceCPR1[5]和SceAKR3C1[6],其中SceAKR3C1屬于醛酮還原酶家族.本研究從裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)基因組克隆表達(dá)了一個具有酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶活力的醛酮還原酶.在此基礎(chǔ)上,對該重組酶的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定了其最適誘導(dǎo)溫度、轉(zhuǎn)速、時間、接種量以及最適誘導(dǎo)劑濃度等,為該酶在不對稱還原酮基泛解酸內(nèi)酯上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    1.1.1 菌株與載體

    裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)菌種由本實驗室保藏,表達(dá)宿主菌EscherichiacoliBL21(DE3)、E.coliTrans-T1克隆宿主菌和載體pEASY-Blunt E1購自北京全式金(TransGen Biotech)生物技術(shù)有限公司.

    1.1.2 試 劑

    FastPfuFly DNA Polymerase及配套材料購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;用于質(zhì)粒提取和DNA片段純化的試劑盒均購自大連寶生物工程(TaKaRa)有限公司;酵母基因組提取試劑盒、輔酶NADPH、蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液BSA和異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)等購自上海生工生物工程股份有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

    1.1.3 引 物

    利用BLAST軟件根據(jù)S.pombe基因組中吲哚-3-乙醛還原酶基因(GenBank: NM_001019853.2)進(jìn)行同源分析,設(shè)計PCR擴增醛酮還原酶基因引物如下:上游引物SpoAKR3C2 F為5′-ATGCTTATCGCTGCTATG-3′,下游引物SpoAKR3C2 R為5′-CTCATCCATGTGCTTCAT-3′.引物由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成.

    1.1.4 培養(yǎng)基

    YPD培養(yǎng)基:酵母膏10 g/L,蛋白胨20 g/L,葡萄糖20 g/L.固體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的瓊脂粉.培養(yǎng)基于0.1 MPa,115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min.

    LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/L,NaCl 10 g/L,調(diào)節(jié)pH至7.0.固體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的瓊脂粉.培養(yǎng)基于0.1 MPa,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min.

    LB/Amp培養(yǎng)基:在LB培養(yǎng)基加入氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL.

    LB/Kan培養(yǎng)基:在LB培養(yǎng)基加入卡那霉素(Kanamycin, Kan)至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL.

    1.2 方 法

    1.2.1 醛酮還原酶SpoAKR3C2的基因克隆

    以S.pombe基因組為DNA模版,進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以獲得目的片段,PCR擴增參數(shù):95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性20 s,55 ℃復(fù)性20 s,72 ℃延伸20 s,反應(yīng)循環(huán)數(shù)為35,72 ℃復(fù)延伸5 min.PCR擴增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,并利用DNA片段純化試劑盒進(jìn)行回收.純化后PCR產(chǎn)物與載體pEASY-Blunt E1連接,并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入50 μLE.coliTrans-T1感受態(tài)細(xì)胞中.采用菌落PCR篩選陽性克隆子,送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序以進(jìn)一步檢測.將測序所得的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的基因序列進(jìn)行比對、分析,含有目的片段的質(zhì)粒命名為pEASY-Blunt E1-SpoAKR3C2.

    1.2.2 密碼子優(yōu)化與重組菌的構(gòu)建

    目的基因通過密碼子優(yōu)化軟件(http://www.jcat.de/)進(jìn)行密碼子優(yōu)化,由上海捷瑞生物工程有限公司合成密碼子優(yōu)化后的目的基因,并插入在pET28b表達(dá)載體上,插入位點為NdeI與BamH I,所得的質(zhì)粒命名為pET28b-SpoAKR3C2.重組質(zhì)粒pET28b-SpoAKR3C2轉(zhuǎn)入50 μL剛解凍的感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中,孵育1 h后將其涂布于LB/Kan固體平板上,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置過夜培養(yǎng).挑取陽性克隆子,接種于含Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃和200 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)10 h,作為種子液,即重組菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-SpoAKR3C2.按2%接種量擴大培養(yǎng)至Kan抗性的150 mL LB液體培養(yǎng)基中,在37 ℃和200 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)至菌體濃度OD600為0.6~0.8時,添加誘導(dǎo)劑0.1 mol/L IPTG.然后在22 ℃,150 r/min條件下誘導(dǎo)10 h.誘導(dǎo)完成后,所得培養(yǎng)物利用12% SDS-PAGE進(jìn)行檢測分析.

    1.2.3 生長曲線測定

    將新鮮的種子液接種至含有相性抗生素(Kan)的LB液體培養(yǎng)基中,在37 ℃,200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng).以未接種的LB液體培養(yǎng)基作為空白對照進(jìn)行零點校正及零時測定,間隔一定的時間取樣,選用600 nm波長進(jìn)行光電比濁測定其光密度值.

    1.2.4 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

    以1.2.2中所述的誘導(dǎo)流程為標(biāo)準(zhǔn)的誘導(dǎo)流程,分別考察種子液接種量、誘導(dǎo)時間、溫度、轉(zhuǎn)速以及誘導(dǎo)劑濃度等對產(chǎn)醛酮還原酶SpoAKR3C2的影響.其中,誘導(dǎo)溫度為16,19,22,25,28,31,34 ℃;誘導(dǎo)時間為6,8,10,12,14,16 h;誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速為120,130,140,150,160,170 r/min;誘導(dǎo)劑終濃度為0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3 mmol/L;種子液接種量(體積分?jǐn)?shù))為0.5%,1.0%,1.5%,2.0%,2.5%,3.0%.

    1.2.5 粗酶液制備及酶活力測定

    誘導(dǎo)完成后,4 ℃條件下6 000 r/min離心15 min收集菌體沉淀,并用超純水反復(fù)重懸清洗,再離心收集菌體.在50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)重懸菌體至終質(zhì)量濃度為50 g/L,充分混懸后吸取菌懸液10 mL,然后在冰浴條件下超聲波破碎細(xì)胞.超聲破碎參數(shù):工作時間1 s,間歇時間1 s,總工作時間為3 min.細(xì)胞裂解液4 ℃,6 000 r/min離心15 min,收集上清即為含醛酮還原酶SpoAKR3C2粗酶液.

    實驗選取酮基泛解酸內(nèi)酯為底物,利用紫外分光光度計測定酶活力,結(jié)合菌體濃度確定最佳誘導(dǎo)條件.標(biāo)準(zhǔn)酶活測定體積為2.5 mL,包括:10 mmol/L酮基泛解酸內(nèi)酯、10 μL醛酮還原酶SpoAKR3C2細(xì)胞破碎上清液和0.1 mmol/L NADPH,用0.2 mol/L PBS緩沖液(pH 6.0)補至2.5 mL,反應(yīng)溫度35 ℃.上述反應(yīng)通過最后加入NADPH和底物啟動反應(yīng),通過檢測1 min內(nèi)NADPH在340 nm波長下的降低來確定酶活.NADPH的摩爾消光系數(shù)為6.22×103L/(mol·cm),酶活力單位(U)定義為每分鐘內(nèi)消耗1 μmol NADPH所需的酶量.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 醛酮還原酶SpoAKR3C2的克隆表達(dá)

    以S.pombe基因組為DNA模板,經(jīng)PCR擴增后獲得目的基因,經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)以及測序驗證,發(fā)現(xiàn)其大小為852 bp,與目的序列大小相符.通過軟件BLAST比對,發(fā)現(xiàn)其與S.pombe中吲哚-3-乙醛還原酶基因(GenBank: NM_001019853.2)序列一致.目的基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后構(gòu)建獲得重組菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-SpoAKR3C2.誘導(dǎo)表達(dá)的SpoAKR3C2在SDS-PAGE上對應(yīng)于大小約為36 kD的條帶(圖2),相比于未經(jīng)誘導(dǎo)的對照,誘導(dǎo)后菌體在大小約36 kD處出現(xiàn)明顯的加粗條帶,與預(yù)期相符.誘導(dǎo)所得的粗酶液經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)酶活力檢測,其比活力約為2 U/mg.進(jìn)一步對其進(jìn)行催化反應(yīng)驗證,在2 mL反應(yīng)體系中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的凍干菌粉為生物催化劑,以100 mmol/L酮基泛解酸內(nèi)酯為底物,偶聯(lián)葡萄糖脫氫酶催化100 mmol/L葡萄糖脫氫提供輔酶循環(huán),以0.3 mmol/L NADP+為輔酶,在pH 6.0,45 ℃和200 r/min下反應(yīng)7 h,D-泛解酸內(nèi)酯得率約為80%,光學(xué)純度高達(dá)99%以上.鑒于該酶的工業(yè)應(yīng)用前景,筆者針對目的菌株E.coliBL21 (DE3)/pET 28b-SpoAKR3C2進(jìn)行了誘導(dǎo)條件優(yōu)化實驗.

    M—DL5000 DNA Marker;1—PCR擴增產(chǎn)物圖1 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳驗證膠圖Fig.1 The agarose gel electrophoresis of PCR amplification product

    M—Protein Marker;1—未誘導(dǎo)菌液;2—40 mmol/L咪唑洗脫液洗脫的酶液;3—100 mmol/L咪唑洗脫液洗脫的酶液;4—250 mmol/L咪唑洗脫液洗脫的酶液;5—誘導(dǎo)后菌液圖2 醛酮還原酶SpoAKR3C2 SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of an aldo-keto reductase SpoAKR3C2

    2.2 細(xì)胞生長曲線

    以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),以不同時間細(xì)菌培養(yǎng)液的OD600值為縱坐標(biāo),繪制重組菌E.coliBL21 (DE3)/pET28b-SpoAKR3C2菌體濃度隨時間的變化曲線(圖3).研究發(fā)現(xiàn):重組菌在0~1.5 h內(nèi)生長緩慢;1.5 h后,菌體濃度直線上升,以穩(wěn)定的幾何級數(shù)快速增長,并在8 h后菌液OD600徑直達(dá)到了4.408,此后曲線變化幅度不大,重組菌進(jìn)入穩(wěn)定生長期.

    圖3 E.coli BL21 (DE3)/pET 28b-SpoAKR3C2細(xì)胞生長曲線Fig.3 Growth curve of E.coli BL21(DE3)/pET 28b-SpoAKR3C2

    2.3 最適誘導(dǎo)溫度

    誘導(dǎo)溫度是重組蛋白表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵因素之一,它對菌體生長速率及蛋白的可溶性表達(dá)等有著重要影響[7].重組菌E.coliBL21(DE3)/pET 28b-SpoAKR3C2表達(dá)外源目的蛋白采用二階段發(fā)酵模式,即菌體生長階段和外源基因表達(dá)階段.由圖4可知:生物量在外源基因表達(dá)階段隨著誘導(dǎo)溫度的升高逐步增加,當(dāng)誘導(dǎo)溫度高于31 ℃后,其菌體濃度的變化趨勢趨緩;另一方面,在溫度16~34 ℃范圍內(nèi),均有一定量的外源蛋白表達(dá),但低溫條件明顯有利于目的蛋白的正確折疊表達(dá),當(dāng)溫度降低至19 ℃時,酶活達(dá)到了3.143 U/mg.大腸桿菌的最適生長溫度為37 ℃,因此低溫(19 ℃)雖然使得溶解性蛋白的體積酶活力達(dá)到峰值,但不利于菌體的正常生長代謝.綜合菌體量及其酶活力,確定醛酮還原酶SpoAKR3C2的最適誘導(dǎo)溫度為19 ℃.

    圖4 溫度對醛酮還原酶SpoAKR3C2誘導(dǎo)表達(dá)的影響Fig.4 Effect of temperature on the inducible expression of aldo-keto reductase SpoAKR3C2

    2.4 最適誘導(dǎo)時間

    在發(fā)酵過程中,隨著誘導(dǎo)劑作用時間的增加,培養(yǎng)液OD600穩(wěn)步上升,而目的蛋白活力在誘導(dǎo)14 h后達(dá)到峰值,延長至16 h酶活力卻有所下降(圖5).總體而言,實驗發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)時間對產(chǎn)醛酮還原酶SpoAKR3C2影響顯著,隨著時間的適當(dāng)延長,目的蛋白表達(dá)量增加并且不斷累積.因而,確定最佳誘導(dǎo)時間為14 h.

    圖5 時間對醛酮還原酶SpoAKR3C2誘導(dǎo)表達(dá)的影響Fig.5 Effect of time on the inducible expression of aldo-keto reductase SpoAKR3C2

    2.5 最適誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速

    宿主菌為E.coliBL21 (DE3)屬于異養(yǎng)兼性厭氧型,研究考察了120~170 r/min范圍內(nèi)轉(zhuǎn)速對產(chǎn)醛酮還原酶SpoAKR3C2影響.在發(fā)酵過程中,隨著誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速的增加,培養(yǎng)液OD600呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,這與宿主菌的代謝性質(zhì)相符(圖6).另一原因可能是因為轉(zhuǎn)速增大,使得溶氧供給過多促使細(xì)胞在早期過快生長,進(jìn)而過多地消耗了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致后期營養(yǎng)不足,從而細(xì)胞生物量較低.而較低的振蕩頻率給菌體提供了一個低氧的環(huán)境,且其受到的剪切力明顯減少,從而更加有利于目的蛋白的正確折疊、表達(dá).綜合菌體量及其酶活力,確定最佳誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速為140 r/min.

    圖6 轉(zhuǎn)速對醛酮還原酶SpoAKR3C2誘導(dǎo)表達(dá)的影響Fig.6 Effect of rotating speed on the inducible expression of aldo-keto reductase SpoAKR3C2

    2.6 最適誘導(dǎo)劑濃度

    IPTG誘導(dǎo)劑濃度太低,不利于誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,從而影響外源蛋白表達(dá).誘導(dǎo)劑濃度過高菌體活力下降,比生長速率降低,也會導(dǎo)致目的蛋白的表達(dá)量下降[8].本研究考察了誘導(dǎo)劑IPTG濃度對產(chǎn)醛酮還原酶SpoAKR3C2誘導(dǎo)表達(dá)的影響.相較于誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間這兩個因素,IPTG濃度對外源基因的表達(dá)影響略小.當(dāng)IPTG終濃度0.1 mmol/L時,粗酶液的比活力最高,并且生物量也處于較高的水平(圖7).

    圖7 IPTG濃度對醛酮還原酶SpoAKR3C2誘導(dǎo)表達(dá)的影響Fig.7 Effect of IPTG concentration on the inducible expression of aldo-keto reductase SpoAKR3C2

    2.7 最適接種量

    采用適合的接種量,在合理地縮短發(fā)酵周期的同時,又能得到較高的發(fā)酵水平[9].就目的蛋白活力而言,隨著接種量增加呈現(xiàn)上升趨勢,在1.5%達(dá)到峰值,隨后逐漸降低(圖8).因而,最適接種量確定為1.5%(體積分?jǐn)?shù)).

    圖8 接種量對醛酮還原酶SpoAKR3C2誘導(dǎo)表達(dá)的影響Fig.8 Effect of inoculation amount on the inducible expression of aldo-keto reductase SpoAKR3C2

    3 結(jié) 論

    醛酮還原酶SpoAKR3C2具有酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶活力,能催化D-泛解酸內(nèi)酯的不對稱合成.對重組菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-SpoAKR3C2的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化,確定了最佳誘導(dǎo)條件:以1.5%接種量進(jìn)行接種,在37 ℃,200 r/min條件下培養(yǎng)至菌液OD600為0.6~0.8時,加入0.1 mmol/L誘導(dǎo)劑IPTG,隨后在19 ℃,140 r/min條件下誘導(dǎo)14 h,可進(jìn)一步實現(xiàn)重組菌過量表達(dá)目的蛋白.在各影響因素中,誘導(dǎo)溫度及時間是影響產(chǎn)醛酮還原酶SpoAKR3C2的主要因素.在優(yōu)化的條件下,所得誘導(dǎo)培養(yǎng)物相較于未優(yōu)化前活力提高了約3.4 倍,為該醛酮還原酶在不對稱合成D-泛解酸內(nèi)酯的進(jìn)一步工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

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