云南麗江和吉林靖宇11種越橘果實(shí)花色苷組分的分析

臧慧明,吳 林,2,*,徐德冰,2,王雪松,張 強(qiáng)

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,吉林長春 130118;2.吉林省普藍(lán)高科技有限公司,吉林長春 130000;3.北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院,北京 100176)

藍(lán)莓,學(xué)名越橘,杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)植物,多年生落葉或常綠灌木小漿果類果樹。藍(lán)莓果實(shí)中含有花色苷、原花青素、黃酮類、超氧化物歧化酶(SOD)、熊果酸等活性成分,被譽(yù)為“漿果之王”[1]。藍(lán)莓原產(chǎn)北美,廣泛分布于北半球,1981～2000年,吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)等研究機(jī)構(gòu)陸續(xù)從美國等國家大量引種藍(lán)莓,促使藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)得到發(fā)展。我國藍(lán)莓的生產(chǎn)可規(guī)劃為6個(gè)產(chǎn)區(qū),包括長白山、大興安嶺、遼東半島、長江流域、華南產(chǎn)區(qū)和西南產(chǎn)區(qū),現(xiàn)階段各產(chǎn)地將引種表現(xiàn),田間管理措施作為研究重點(diǎn),對(duì)藍(lán)莓果品品質(zhì)的研究較少[2]。

迄今為止,存在的植物花色苷有500多種,花青素有20余種。藍(lán)莓中主要有5種花青素,并且與半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖等以糖苷鍵結(jié)合而成藍(lán)莓果實(shí)中的15種花色苷,同時(shí)在酸水解的作用下重新轉(zhuǎn)化為5種花青素[3]。藍(lán)莓花色苷具有很強(qiáng)的生物活性,近年來,隨著藍(lán)莓的普及,人們開始研究藍(lán)莓的保健功效。研究表明,藍(lán)莓花色苷對(duì)H2O2所致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用[4],還可顯著降低糖尿病小鼠的血糖含量和肝臟中的丙二醛含量(p<0.05)[5],并對(duì)大鼠心臟病理變化有不同程度減輕,對(duì)環(huán)磷酰胺致大鼠心臟毒性具有一定保護(hù)作用[6]。

花青素的分離提取方法主要有浸提、超聲波、微波等,常用于純化花青素的技術(shù)有柱層析、固相萃取、液相色譜、高速逆流色譜等。田密霞等[5]采用超臨界CO2法萃取藍(lán)莓花色苷,利用AB-8大孔樹脂進(jìn)行純化,純化后花色苷純度為80.76%。張楊等[7]通過XAD-7HP大孔樹脂與固相微萃取小柱純化藍(lán)莓果實(shí),鑒定出11種花色苷。劉靜波等[8]采用AmberliteXAD-7HP大孔樹脂層析、Sep-Pak C18固相萃取和Sephadex LH-20凝膠色譜分離,所得藍(lán)莓花色苷粗品的純度為62.49%,經(jīng)過半制備型高效液相色譜技術(shù)純化飛燕草素-3-O-半乳糖苷和錦葵色素-3-O-半乳糖苷,純度分別為96.98%和95.63%。由此可見,不同分離技術(shù)對(duì)花色苷作用明顯,但過多的分離程序?qū)ㄉ盏牧魇г斐闪艘欢ǖ挠绊憽Ｒ虼?選擇一種高效、低破壞度的分離方法成為研究的方向。

目前,對(duì)花色苷的檢測(cè)方法較多,主要以pH示差法[9]、高效液相色譜法為主。pH示差法適用于含有干擾物體系中花色苷總量的測(cè)定[10]。高效液相色譜法能夠很好的對(duì)花色苷進(jìn)行定量分析[11],由于部分花色苷含量較低,通常使用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)花色苷進(jìn)行定性,但同樣存在干擾因素多,儀器、人員等外部因素,導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確的弊端[12]。因此,采用花色苷標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)照,通過高效液相色譜法進(jìn)行定性和定量分析更為準(zhǔn)確。

本研究旨在分析云南麗江和吉林靖宇11種越橘花色苷種類及含量的差異,了解區(qū)域性不同品種越橘的營養(yǎng)價(jià)值,以期為功能性品種的選育和產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

11種越橘果實(shí)(品種為：藍(lán)豐、托柔、奧林匹亞、杜克、藍(lán)樂、早藍(lán)、雷戈西、奧尼爾、密斯蒂、北陸、布里吉塔) 采自2016年5～7月云南麗江、吉林靖宇普藍(lán)高科藍(lán)莓基地,每個(gè)品種選取3株正常生長的植株,每株隨機(jī)摘取20個(gè)果實(shí),果實(shí)采摘后放入-20 ℃冰箱保存;矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-半乳糖苷、錦葵色素-3-葡萄糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷、錦葵色素-3-半乳糖苷、飛燕草素-3-半乳糖苷標(biāo)準(zhǔn)品 均由上海源葉生物科技有限公司提供。

BT125D型分析天平 奧多利斯科學(xué)儀器有限公司;JP-100ST型超聲波清洗機(jī) 深圳潔盟設(shè)備有限公司;隔膜真空泵 天津津騰有限公司;1200型高效液相色譜儀(DAD二極管陣列檢測(cè)器) 美國安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 精密稱取5.0 g藍(lán)莓鮮果,研缽研磨至泥狀,加入0.2%鹽酸水溶液50 mL,超聲提取30 min,超聲溫度為30 ℃,超聲頻率為40000 Hz,過濾,濾渣利用上述方法再進(jìn)行提取,合并濾液,定容至100 mL,過0.22 μm濾膜后上液相色譜儀檢測(cè)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精密稱取6種花色苷標(biāo)準(zhǔn)品1 mg,置于10 mL棕色容量瓶中,以1 mol/L鹽酸甲醇溶液溶解,作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,臨用前用1 mol/L鹽酸甲醇稀釋成0.37～223 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 色譜條件 液相條件:安捷倫Eclipse XDB-C18柱,5 μm,4.6×150 mm,流動(dòng)相:A:10%甲酸水,B:甲醇,梯度洗脫:0～25 min,25%～30%B,流速:0.6 mL/min,檢測(cè)波長:530 nm,柱溫25 ℃;進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4 精密度試驗(yàn) 吸取6種配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)10 μL進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。

1.2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 取已知各花色苷含量的麗江藍(lán)豐果實(shí)樣品，按照1.2.1的方法制備樣品，取1份加入純凈水作為對(duì)照組，加入不同質(zhì)量濃度的花色苷標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定花色苷含量，計(jì)算回收率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003、SPSS 18.0對(duì)15個(gè)越橘樣品的花色苷成分進(jìn)行方差分析與聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色苷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以一定質(zhì)量濃度梯度的花色苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析,以色譜峰面積(Y)對(duì)6種花色苷質(zhì)量濃度(X)求回歸方程和相關(guān)系數(shù),結(jié)果如圖1、表1所示。

表1 花色苷對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 1 Standard equations for anthocyanins

圖1 花色苷混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed anthocyanins standards注:1:飛燕草素-3-半乳糖苷,2:飛燕草素-3-葡萄糖苷,3:矢車菊素-3-半乳糖苷4:矢車菊素-3-葡萄糖苷,5:錦葵色素-3-半乳糖苷,6:錦葵色素-3-葡萄糖苷。

由圖1可見,飛燕草素-3-半乳糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、錦葵色素-3-半乳糖苷、錦葵色素-3-葡萄糖苷6種標(biāo)準(zhǔn)品峰型標(biāo)準(zhǔn),分離效果良好,能夠達(dá)到色譜分析的條件。由表1可見,6種標(biāo)準(zhǔn)品線性良好,相關(guān)系數(shù)為0.9939～0.9968。

2.2 精密度試驗(yàn)

測(cè)定6種標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積RSD為2.00%～3.73%,表明進(jìn)樣精密度良好,結(jié)果見表2。

表2 花色苷重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Repeatability for anthocyanins

2.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果分析

如表3所示,6種花色苷平均回收率在98.90%～100.99%,表明花色苷標(biāo)準(zhǔn)品回收良好,此方法適用于提取液中各花色苷含量的測(cè)定,準(zhǔn)確率較高。

表3 花色苷加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Spiked recoveries for anthocyanins

2.4 15個(gè)越橘樣品花色苷含量分析

由表4可知,15個(gè)越橘樣品中,均檢測(cè)到的有飛燕草素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-半乳糖苷、錦葵色素-3-半乳糖苷三種花色苷,其中飛燕草素-3-半乳糖苷平均含量為223.99 μg/g、錦葵色素-3-半乳糖苷平均含量為153.34 μg/g,二者占總花色苷含量的65%。飛燕草素-3-半乳糖苷含量最低為95.44 μg/g(麗江藍(lán)豐),最高為428.07 μg/g(麗江雷戈西),錦葵色素-3-半乳糖苷含量最低為47.27 μg/g(吉林托柔),最高為362.72 μg/g(麗江雷戈西),6種花色苷變異系數(shù)為0.56～1.48,變幅較大,說明不同花色苷品種間差異較大。

表4 不同越橘花色苷含量分析(μg/g)Table 4 Analysis of anthocyanins contents in different blueberries(μg/g)

由圖2可知,6種花色苷除飛燕草素-3-半乳糖苷與矢車菊素-3-半乳糖苷外,其余4種地區(qū)間差異顯著(p<0.05),麗江地區(qū)錦葵色素-3-半乳糖苷顯著高于靖宇地區(qū)(p<0.05),靖宇地區(qū)飛燕草素-3-葡萄糖苷、錦葵色素-3-葡萄糖苷顯著高于麗江地區(qū)(p<0.05)。飛燕草素-3-半乳糖苷平均含量最高,分別為220.49(吉林靖宇)、226.31 μg/g(云南麗江)。

圖2 靖宇和麗江地區(qū)越橘中6種花色苷差異分析Fig.2 Variance analysis of 6 anthocyanins of Jingyu and Lijiang in blueberries注:不同字母表示同一種花色苷不同產(chǎn)地間差異顯著(p<0.05);圖3同。

2.5 不同地區(qū)同種越橘花色苷組分的分析

如圖3所示,相同品種越橘不同地區(qū)的花色苷種類無差異,含量差異較大,這與麗江、靖宇地區(qū)的土壤、光照、環(huán)境、田間管理等因素有關(guān)。麗江藍(lán)豐主要以錦葵色素-3-葡萄糖苷、錦葵色素-3-半乳糖苷為主,靖宇藍(lán)豐以飛燕草素-3-半乳糖苷、錦葵色素-3-葡萄糖苷為主。麗江托柔以錦葵色素-3-半乳糖苷為主,靖宇托柔只鑒定出3種花色苷,且含量較低,說明此品種種植在靖宇地區(qū)不利于花色苷的積累。奧林匹亞杜克均以飛燕草素-3-半乳糖苷為主,且靖宇地區(qū)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于麗江地區(qū),說明奧林匹亞、杜克種植在靖宇地區(qū)更有利于花色苷的積累。

圖3 四種越橘不同產(chǎn)地花色苷對(duì)比分析Fig.3 Comparative analysis of anthocyanins in 4 blueberries

2.6 不同越橘樣品聚類分析

采用歐氏距離法對(duì)不同品種的花色苷組分特點(diǎn)進(jìn)行聚類分析,結(jié)果如圖4所示。當(dāng)歐氏距離為5時(shí),所測(cè)樣本分為4個(gè)集群:集群1為飛燕草素-3-半乳糖苷含量較高的三種越橘,代表品種為麗江雷戈西、麗江奧尼爾、靖宇杜克;集群2為6種花色苷總含量較高的越橘品種,代表品種為麗江北陸與靖宇早藍(lán);集群3代表的越橘品種6種花色苷均有檢出,集群4代表的越橘品種所含花色苷總量較低。當(dāng)歐氏距離為6～20時(shí),所測(cè)樣本分為3個(gè)集群,且集群1與集群2無變化,集群1、集群2對(duì)不同越橘花色苷的貢獻(xiàn)大,說明飛燕草素-3-半乳糖苷含量與花色苷總含量是評(píng)價(jià)越橘花色苷特點(diǎn)的重要因子。

圖4 不同越橘的聚類分析樹狀圖Fig.4 Cluster analysis dendrogram of different blueberries

3 討論

越橘品種及地區(qū)差異會(huì)導(dǎo)致越橘果實(shí)中花色苷種類及含量有所不同[13]。天然花色苷由于色澤鮮亮、水溶性高,是水果中呈現(xiàn)顏色的主體物質(zhì)[14-15]。研究表明,越橘中含量較高的花色苷是錦花葵素-3-半乳糖苷。Moze等[16]通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS)鑒定不同產(chǎn)區(qū)藍(lán)莓的花色苷,共15種,以錦花葵素與飛燕草素為主,含量最高的是錦花葵素-3-O-半乳糖苷。郭曉倩等[17]以東北野生藍(lán)莓為原料,共鑒定出14種花色苷組分,飛燕草素衍生物是最主要的花色苷,占花色苷總量的34.89%～42.21%,牽?；ㄋ匮苌?5.96%～32.95%,錦葵素衍生物25.96%～32.95%。Brambilla等[18]測(cè)定不同藍(lán)莓品種的果汁制品,共檢出15種花色苷,其中錦葵花素-3-O-半乳糖苷含量最高。Burdulis等[19]對(duì)比了立陶宛、俄羅斯、瑞典等地區(qū)的越橘花色苷種類及含量,立陶宛地區(qū)的花色苷總含量最高,不同地區(qū)越橘中花色苷的種類沒有差異。此外,越橘中花色苷的含量與海拔、光照、氣候、溫度等環(huán)境因素密切相關(guān),花色苷種類受環(huán)境因素影響較小[20]。本文對(duì)云南麗江、吉林靖宇兩個(gè)產(chǎn)區(qū)進(jìn)行對(duì)比分析,共鑒定出6種花色苷,所測(cè)品種多以飛燕草素為主,錦葵花素為輔,發(fā)現(xiàn)藍(lán)豐、杜克、托柔、奧林匹亞花色苷種類與地域無關(guān),花色苷含量受地區(qū)性環(huán)境因素影響較大,導(dǎo)致花色苷含量呈顯著性差異,這與前人研究相符。

4 結(jié)論

對(duì)越橘中花色苷進(jìn)行分離提取和HPLC分析,飛燕草素-3-半乳糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、錦葵色素-3-半乳糖苷、錦葵色素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品線性良好,相關(guān)系數(shù)為0.9939～0.9968,精密度RSD為2.00%～3.73%,且平均回收率在98.90%～100.99%,該方法準(zhǔn)確、高效,共鑒定出6種花色苷,含量較高的是飛燕草素-3-半乳糖苷、錦葵色素-3-葡萄糖苷,共占花色苷總量65%。通過聚類分析,表明集群1為飛燕草素-3-半乳糖苷含量較高的三種越橘,集群2為6種花色苷總含量較高的越橘品種,說明飛燕草素-3-半乳糖苷含量與花色苷總含量是評(píng)價(jià)越橘花色苷特點(diǎn)的重要因子。