蟲草及其制品中D-甘露醇檢測技術(shù)研究進(jìn)展

王鵬躍,曾議霆,李小軍

(1 成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院,四川成都 611130;2.成都產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院有限責(zé)任公司,四川成都 610100;3.成都天河中西醫(yī)科技保育有限公司,四川成都 610041)

D-甘露醇即蟲草酸具有利尿脫水、提高血漿滲透壓、抗氧化、抗衰老、鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘等多種功效[1-3],是蟲草及其制品中真正起藥效和保健作用的最重要的成分之一,是蟲草的一個(gè)特征標(biāo)識(shí)[4-5],是評(píng)價(jià)蟲草及其制品質(zhì)量品質(zhì)的重要指標(biāo)[6-8]。

現(xiàn)有天然蟲草資源極度匱乏,人們除了對(duì)天然蟲草資源高效利用外,也在積極進(jìn)行人工引種栽培,并利用豐富的現(xiàn)代加工技術(shù)手段制得廣泛的蟲草制品[9],以實(shí)現(xiàn)蟲草資源的效益最大化,當(dāng)然市場上也大量存在偽劣及假冒的蟲草及其制品,因而市場管理必須介入。市場管理,科學(xué)地培育人工蟲草,蟲草及蟲草制品的研究、加工與質(zhì)量控制等都需要以準(zhǔn)確檢測、識(shí)別其有效成分為前提[10]。目前對(duì)天然或人工培養(yǎng)蟲草與蟲草相關(guān)制品中D-甘露醇的檢測已有大量研究,檢測方法如容量法、UPLC-MS/MS、TLC、GC-MS等,但缺乏系統(tǒng)地方法研究與評(píng)述,蟲草制品往往成分復(fù)雜,檢測時(shí)干擾因素較多,目前尚缺乏商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn),且沒有對(duì)蟲草及相關(guān)制品細(xì)分產(chǎn)品如保健功能食品、醫(yī)藥制品及其他制品等D-甘露醇檢測的特定的行之有效的方法。因此了解蟲草及其制品中D-甘露醇檢測技術(shù)的研究進(jìn)展,對(duì)于現(xiàn)有D-甘露醇檢測技術(shù)的完善或開發(fā)新型檢測方法具有重要意義,本文通過對(duì)蟲草及其制品中D-甘露醇檢測技術(shù)的綜述,以期對(duì)現(xiàn)有D-甘露醇檢測技術(shù)的完善或開發(fā)新型檢測方法提供理論指導(dǎo),同時(shí)為蟲草及其制品的質(zhì)量監(jiān)控,蟲草及其制品用于功能食品、保健食品及醫(yī)藥的進(jìn)一步開發(fā)研究及相關(guān)細(xì)分檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 D-甘露醇檢測方法

1.1 容量分析法(Volumetric analysis,VA)

容量分析法,別稱容量法、剩余滴定法,是利用D-甘露醇的還原性,以高碘酸鈉作為氧化劑進(jìn)行滴定的方法,也稱氧化還原滴定法,該法收載于我國各版本藥典中,用于測定冬蟲夏草及由蟲草作為主要成分制作的藥品中的D-甘露醇的含量[11-14]。

鄧亮等[15]采用VA測定不同生產(chǎn)條件下制得的蟲草菌絲中D-甘露醇的含量,表明生產(chǎn)條件對(duì)D-甘露醇含量影響較大。檢測方法為:以乙醇熱回流提取樣品,濾液中加入高碘酸鈉溶液,置水浴加熱氧化,隨后加入碘化鉀試液略微放置,用硫代硫酸鈉滴定液(0.05 mol/L)滴定,快到終點(diǎn)時(shí),加入淀粉指示液,再滴定至藍(lán)色消失,空白校正,硫代硫酸鈉滴定液(0.05 mol/L)對(duì)D-甘露醇(C6H14O6)的滴定度為0.9109 mg。該法簡便易行,但諸多研究表明,VA檢測結(jié)果較真實(shí)值偏大,主要是由于具有其他還原性成分的干擾,且誤差較大,適用于較純的D-甘露醇制劑[16-17]。

1.2 薄層色譜法(Thin layer chromatography,TLC)

旺寶琪等[18]首次使用TLC檢測蟲草中D-甘露醇的含量。以95%乙醇在沙氏提取器中回流提取蟲草樣品得D-甘露醇提取液,以復(fù)合展開劑展開后,用高碘酸鉀-聯(lián)苯胺顯色,在λS=295 nm、λR=370 nm的條件下進(jìn)行雙波長反射鋸齒形掃描,測得西藏產(chǎn)冬蟲夏草中D-甘露醇的含量為8.4%,回收率為98.0%～101.6%,RSD為0.60%。此后,鮮有用該法測定蟲草或蟲草制品中D-甘露醇含量的情形,許妍等[19]、陳策等[20]使用TLC對(duì)蟲草菌粉制品金水寶片劑、人工蛹蟲草等中的D-甘露醇進(jìn)行定性分析,均未進(jìn)行定量測定。之后,未見對(duì)此方法的報(bào)道,可能是由于TLC測定D-甘露醇對(duì)點(diǎn)樣操作、點(diǎn)樣劑等要求較高,誤差大[21]。

1.3 分光光度法(Spectrophotometry,SP)

劉桂君等[22]以SP測定了分別以燕麥、小米、大麥、大米為培養(yǎng)基質(zhì)形成的蛹蟲草子座中D-甘露醇的含量,檢測結(jié)果判定小米和大麥適合于人工培養(yǎng)高產(chǎn)蟲草素、D-甘露醇的蛹蟲草子座。李妍等[23]通過SP測定蛹蟲草保健酒中D-甘露醇的含量,并以響應(yīng)曲面方法對(duì)基酒提取人工蛹蟲草子實(shí)體中D-甘露醇的工藝進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明投料比1∶55,基酒40% vol,蛹蟲草原粒度,提取1 d,提取過程中氮吹攪拌10 min 提取工藝下,SP測得的D-甘露醇含量最大。王曉玲等[3]通過SP監(jiān)測液體深層發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的菌絲粉中D-甘露醇含量的動(dòng)態(tài)變化特征,并建立了生產(chǎn)蛹蟲草D-甘露醇的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型。其以蒸餾水回流提取菌絲粉中的D-甘露醇,先后加入高碘酸鈉、L-鼠李糖、Nash試劑,在413 nm處比色測定D-甘露醇的含量。

XIAO等[24]建立了酶標(biāo)儀-分光光度法(40 ℃水浴提取)用于多種藥用冬蟲夏草D-甘露醇的測定,該法具有成本低、效率高、可大批量檢測等特點(diǎn)。之后,蔣永紅等[25]從方法學(xué)角度驗(yàn)證了酶標(biāo)儀-分光光度法測定蟲草菌絲共生體中D-甘露醇含量的可靠性。用30%乙醇水浴(35 ℃)提取D-甘露醇,先后加入高碘酸鈉、L-鼠李糖、Nash試劑,53 ℃水浴生成黃色的3,5-二乙酰-1,4-脫氫二甲基吡啶,于414 nm處比色。D-甘露醇濃度在10～60 mg/L范圍內(nèi)線性良好,R值為0.9992。

蔡友華等[26]進(jìn)行了SP測定巴西蟲草菌絲體中D-甘露醇含量的研究,通過方法可靠性的證明實(shí)驗(yàn)表明,D-甘露醇提取液中含有的糖類(包含葡萄糖、鼠李糖和果糖等),只有果糖對(duì)檢測結(jié)果有較大影響,該法適用于不含果糖的巴西蟲草菌絲體等的甘露醇含量的測定。因而,SP相較于前述的VA,具有一定的優(yōu)越性,但仍然受類似糖醇的干擾較大,應(yīng)用具有一定的局限性。

1.4 高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)

劉薇等[27]以HPLC替代藥典中VA測定冬蟲夏草菌絲體膠囊(白令膠囊)中D-甘露醇的含量(具體方法參見表1,下同),結(jié)果表明傳統(tǒng)的VA測定的為樣品中具有還原羥基的成分的所有物質(zhì),而HPLC測定的是單一的D-甘露醇的含量,結(jié)果相對(duì)更準(zhǔn)確。

表1 各類蟲草或其制品中的D-甘露醇HPLC檢測方法Table 1 HPLC methods for the determination of D-mannitol in Cordyceps and its products

劉謀盛等[6]在HPLC中,使用了固相萃取預(yù)分離技術(shù)測定冬蟲夏草中D-甘露醇的含量。以水超聲振蕩浸取冬蟲夏草樣品中的D-甘露醇,浸取液用Waters Sep-Pak-C18固相萃取小柱預(yù)分離,以海藻糖為內(nèi)標(biāo)物,Waters Sugar-Pak-1(6.5 mm×300 mm)鈣型陽離子交換柱為固定相,0.05 g/L EDTA鈣鈉水溶液為流動(dòng)相,以RID檢測器測定。在此之前,王琳等[28]對(duì)該法進(jìn)行了嘗試,僅以水替代0.05 g/L EDTA鈣鈉水溶液為流動(dòng)相。對(duì)比兩者[6,28]的研究結(jié)果表明,該方法中,EDTA鈣鈉水溶液或水作為流動(dòng)相效果相當(dāng),而EDTA鈣鈉可減少鈣型交換柱材料上鈣離子的流失,延長柱的壽命;進(jìn)行預(yù)分離旨在分離除去樣品提取液中含有的蛋白質(zhì)、脂肪等水溶性差的成分,避免其附著在柱材料上不易被流動(dòng)相洗脫污染柱而降低柱效。

顧振宇等[6,28-29]建立了HPLC-RID測定冬蟲夏草及其相關(guān)制品中D-甘露醇含量的方法,各方法對(duì)D-甘露醇的LOD分布在1.5～2.0 μg/mL。之后,楊昕等[30]建立了HPLC-ELSD測定人工蛹蟲草子實(shí)體中D-甘露醇含量的方法,對(duì)D-甘露醇的LOD為0.1 μg/mL。表1中各方法亦顯示,ELSD檢測器明顯較RID檢測器靈敏,對(duì)D-甘露醇識(shí)別效果更好。因D-甘露醇在紫外區(qū)不被吸收,因此紫外檢測器不適用;電化學(xué)檢測器的靈敏度高,對(duì)樣品選擇性好,但對(duì)樣品前處理的要求較高,操作復(fù)雜;RID靈敏度相對(duì)較低,對(duì)溫度和壓力的變化較敏感[31]。

王心珉[32]以SP和HPLC法測定人工發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體膠囊D-甘露醇的含量并做比較,結(jié)果表明SP測定的D-甘露醇含量為(6.03±0.35)mg/g,顯著低于HPLC法的(6.52±0.35)mg/g,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),但兩種方法測定結(jié)果呈正相關(guān)(r=0.965,p=0.002<0.05);研究結(jié)論認(rèn)為HPLC法的靈敏度、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性均優(yōu)于SP,但SP具有操作簡單,對(duì)試劑的要求較低,不需要特定標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)濟(jì),快速等優(yōu)點(diǎn)。

吳敬梅等[33]以蒸餾水超聲提取(40 min,360 W)冬蟲夏草菌絲體粉末后,以50 ℃水浴繼續(xù)提取兩小時(shí)制得提取液,通過HPLC探究冬蟲夏草菌絲體中存在的果糖是否會(huì)對(duì)SP測定D-甘露醇含量產(chǎn)生影響。結(jié)果表明,相同濃度的D-甘露醇和果糖的出峰面積大致相同,而樣品水提液中的果糖,相對(duì)于D-甘露醇,峰面積極其微小,其含量不到D-甘露醇含量的3%,分析得出樣品中極其少量的果糖引起的比色法吸光度增量很小,即果糖對(duì)D-甘露醇SP測定的干擾極其微小。然而,蔡友華等通過波譜比較和HPLC分析驗(yàn)證了所分析樣品(巴西蟲草菌絲體)不含有果糖,通過額外加入果糖到樣品提取液中(加入后果糖濃度達(dá)50 mg/L)測定加入果糖前后吸光度值的變化,發(fā)現(xiàn)加入該量果糖后與對(duì)照相比吸光度值顯著增加(p<0.01)。因?yàn)镾P測定時(shí)使用的KIO4可以把具有羥基的單糖生成醛,由于在酸性條件下游離單糖以穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在,故不會(huì)對(duì)測定結(jié)果產(chǎn)生干擾,但作為酮糖的果糖在相同的條件下,不能形成穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu),可以被KIO4氧化[34]。因而筆者推測,果糖本質(zhì)上會(huì)影響SP測定D-甘露糖醇,但這種影響要基于樣品中果糖的量達(dá)到一定程度才能呈現(xiàn)出來,這個(gè)量是需要進(jìn)一步研究進(jìn)行確定。如前所述,蔡友華等與吳敬梅等的研究均表明,HPLC法特異性強(qiáng),所受干擾少,適合對(duì)組成復(fù)雜體系中D-甘露醇含量的測定。

由表1可知,目前HPLC中對(duì)D-甘露醇的提取主要是使用(熱)水與(熱)醇浸提、超聲或回流提取,對(duì)這類方法研究較多。胡秋芬等[35]提出基質(zhì)固相分散-高效液相色譜法(MSPD-HPLC-ELSD)測定蟲草中D-甘露醇的方法。將蟲草樣品與石墨化碳黑球以質(zhì)量比為1∶4充分研磨后裝柱,用熱水洗脫,洗脫液中的D-甘露醇用HPLC測定?；|(zhì)固相分散技術(shù)(Matrix solid-phase dispersion,MSPD)是一種類似于固相提取的樣品預(yù)處理方法[36],將樣品直接與固相萃取材料一起混合研磨,使樣品均勻分散于固定相顆粒的表面,形成一個(gè)獨(dú)特的色譜固定相,裝柱后依靠所選定的溶劑洗脫樣品,具有快速高效、操作簡便,且能一次實(shí)現(xiàn)提取、凈化與分離,現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品與植物中成分的提取[37-40]。但在胡秋芬等之后未見有使用該法用于蟲草制品中D-甘露醇的提取。

1.5 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)

雍太萍等[41]研究了UPLC-MS/MS(超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法)同時(shí)測定冬蟲夏草制品金水寶膠囊中D-甘露醇等5種成分的含量。用90%的甲醇超聲提取(30 min,45 kHz)樣品中D-甘露醇,過濾,取濾液以流動(dòng)相稀釋得D-甘露醇待測液。甲醇-0.1%甲酸溶液(5:95,V/V)為流動(dòng)相,以Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm,5 μm)分離,采用電噴霧電離源,多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM),m/z為183.1/69,Fragmentor及CE值分別為70、10 V,測得D-甘露醇含量為11051.4 μg/g,回收率為95.33～98.39%,RSD為1.34%。陳志遠(yuǎn)等[42]以上述同樣的方法檢測蛹蟲草中D-甘露醇等6種成分的含量,測得樣品D-甘露醇含量為1421.44 μg/g,回收率為92.1%～102.6%,RSD 3.3%。兩者均表明該法樣品前處理簡單,適合一次多成分分析,且速度快、靈敏度高、抗干擾性強(qiáng)。

1.6 離子色譜法(Ion chromatography,IC)

薛俊杰[21]建立了高效陰離子色譜法測定北蟲草中D-甘露醇的方法。1 g子實(shí)體粉中加入100 mL水熱回流提取2 h。對(duì)提取液采用CarboPac MAl檢測柱(4×250 mm)分離,流動(dòng)相為480 mmol/L的NaOH,流速0.40 mL/min,上樣量25 μL,柱溫30 ℃。后續(xù)上樣量25 μL,流速0.45 mL/min。將該方法測得結(jié)果與HPLC比較表明,兩者無顯著差異,通過方法學(xué)研究發(fā)現(xiàn),兩種方法重復(fù)性好、精密度高及重現(xiàn)性佳,回收率在95%～105%之間,均適用于北蟲草中D-甘露醇含量的測定。相較于HPLC,離子色譜法前處理更簡便易行,且可將阿糖醇、海藻糖等與D-甘露醇有效分離[21]。隨后,出臺(tái)了離子色譜-電化學(xué)檢測器法測定食用菌中包含D-甘露醇等多種成分的測定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[43]。

1.7 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)

GC-MS靈敏度高、效能好,因而被廣泛用于檢測分析,但用于D-甘露醇的分析報(bào)道很少,目前僅用于冬蟲夏草、蛹蟲草[44-45]中D-甘露醇的檢測[46]。

王波等[44]用GC-MS檢測蛹蟲草中D-甘露醇的含量。以無水吡啶、醋酐熱提取蛹蟲草中的D-甘露醇,在HP-5MS 5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷毛細(xì)管柱上分離,N2為載氣,四極桿質(zhì)譜電子電離源檢測。該方法對(duì)D-甘露醇LOD為0.173 μg/mL,回收率為101.45%,RSD為2.62%。王和興等[47]用RO水超聲提取D-甘露醇,采用乙酸酐將D-甘露醇衍生化為D-甘露醇六乙酯,用毛細(xì)管色譜柱分離,FID檢測器檢測,建立了保健食品中D-甘露醇的毛細(xì)管氣相色譜分析方法,實(shí)現(xiàn)了葡萄糖、肌醇和山梨醇與D-甘露醇的分離,排除了它們對(duì)D-甘露醇測定的干擾。

GUAN Jia等[45]通過梯度式加壓溶劑萃取(pressurized liquid extraction,PLE),GC-MS對(duì)來自不同區(qū)域的13個(gè)天然與人工栽培蟲草樣品的成分進(jìn)行定性與定量分析。以樣品與硅藻土等量混合,加入70%乙醇,在100 ℃、1.034×104kPa下萃取D-甘露醇;離子源ESI,在HP-5MS 5%苯基甲基硅氧烷毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,i.d.)上分離;升溫程序:175 ℃維持7 min,然后5 ℃/min升至185 ℃維持5 min,隨后4 ℃/min升至230 ℃;分流比1∶50,以高純氮作載氣。MS為EI模式,掃描范圍40～550 amu,ie為70 eV,進(jìn)樣口溫度250 ℃,離子源溫度280 ℃。該方法測定D-甘露醇LOD為0.12 μg/mL,回收率92.2%,RSD 4.6%,通過聚類分析方法建立了基于糖類成分組成與含量的蟲草的鑒別方法及品質(zhì)評(píng)估方法。

GC在精密度與準(zhǔn)確度上均能達(dá)到食品分析的要求,但D-甘露醇的結(jié)構(gòu)決定其極性較大,氣化溫度高,因而使用GC測定時(shí)需要進(jìn)行衍生化降低沸點(diǎn),致使其前處理略復(fù)雜[21,44,47]。

2 問題與展望

綜上所述,目前對(duì)蟲草及其制品中D-甘露醇的檢測技術(shù)有VA、SP、HPLC、TLC、GC、HPLC-MS、IC。VA與SP具有操作簡便,所需儀器設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn),因而是沿用多年的傳統(tǒng)方法,但存在抗類似官能團(tuán)或類似結(jié)構(gòu)物質(zhì)的干擾性差,前處理顯色步驟復(fù)雜,測定結(jié)果不精確等缺陷[7,21]。TLC對(duì)操作要求較高,GC前處理復(fù)雜等而使這兩種方法被應(yīng)用較少。HPLC、HPLC-MS、IC為近年來的新型檢測技術(shù),具有靈敏度高,結(jié)果精確,重現(xiàn)性高等優(yōu)點(diǎn),HPLC-MS與HPLC相比,抗干擾性更強(qiáng),靈敏度更高,操作更簡便;IC也相對(duì)較優(yōu),但I(xiàn)C所需設(shè)備昂貴,目前普及性不廣,可加強(qiáng)推廣。

現(xiàn)有對(duì)D-甘露醇的檢測技術(shù)的研究主要集中在提取工藝與監(jiān)測手段上,即如何進(jìn)行簡便有效的樣品處理與精準(zhǔn)檢測的問題。但研究的深入性還不夠,如前所述,在2008年胡秋芬等[35]之后未見有使用MSPD用于蟲草及其制品中D-甘露醇的提取,但MSPD濃縮了傳統(tǒng)的樣品均化、組織細(xì)胞裂解、提取、過濾、凈化等過程,使樣品的預(yù)處理變得簡便,同時(shí)也避免了目標(biāo)物的損失。因此,MSPD相較于傳統(tǒng)的水提與醇提具有明顯的優(yōu)勢。王志兵等[37]首次將MSPD與HPLC相結(jié)合用于野生冬蟲夏草、深層發(fā)酵培養(yǎng)的蛹蟲草菌絲體和固態(tài)培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體中核苷類物質(zhì)的測定,并對(duì)影響基質(zhì)固相分散的提取條件(分散劑的種類和樣品與分散劑的質(zhì)量、淋洗劑與洗脫劑的種類和體積、凈化劑的影響等)進(jìn)行了優(yōu)化,最終測定結(jié)果令人滿意,其結(jié)論表明MSPD-HPLC法可被廣泛應(yīng)用于蟲草與其相關(guān)制品中核苷和堿基的測定。因而,筆者認(rèn)為可以繼續(xù)開展MSPD用于蟲草及其制品中D-甘露醇的提取分離測定的研究,諸如MSPD對(duì)蟲草及其制品中D-甘露醇提取條件優(yōu)化等。同時(shí),提取工藝除簡單易操作之外,還應(yīng)考慮降低或除去干擾物質(zhì)。D-甘露醇具有易溶于水,微溶于醇的特性,因而綜述文獻(xiàn)中有一些研究者使用甲醇或甲醇-水體系作為提取液提取D-甘露醇,但有研究發(fā)現(xiàn),甲醇會(huì)增加其他類型物質(zhì)的溶出,增大分析時(shí)的背景干擾[48];特定制品的HPLC流動(dòng)相的比例等需要進(jìn)一步摸索等。再者,研究的系統(tǒng)性不足,將分析樣品對(duì)儀器的損傷降到最低也應(yīng)當(dāng)是一個(gè)考慮的因素,如有研究表明HPLC中,LSID較RID檢測器靈敏[30],但HPLC-ELSD測定D-甘露醇時(shí),由于檢測樣品中的糖類成分在高溫下會(huì)焦化而污染漂移管,使ELSD檢測器產(chǎn)生故障,對(duì)儀器不利[21,27]。

對(duì)成分復(fù)雜的或者偽劣假冒蟲草制品的定性定量研究還需廣泛開展,如李展平等[10]用飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜(TOF-SIMS)對(duì)正品、仿制與偽劣蟲草制品進(jìn)行分析,以質(zhì)譜峰的m/z位置及峰面積對(duì)D-甘露醇進(jìn)行定性定量,準(zhǔn)確有效。同時(shí),可探索基于多種復(fù)合型檢測技術(shù)對(duì)D-甘露醇定性的定量分析,如HPLC-Q-TOF-MS/MS[49]。由于新型栽培方法與食品加工工藝的多樣性造成人工栽培蟲草與蟲草制品成分復(fù)雜,僅建立一種廣適性的方法測定蟲草及其制品中D-甘露醇的含量難以可行,因而考慮要形成蟲草及相關(guān)制品細(xì)分產(chǎn)品如醫(yī)藥制品、保健功能食品及其他制品等的特定的行之有效的方法尤為必要。