扛板歸多糖含量測定方法的建立

裴世成,盧慧英,王 云,伍善廣,馮學(xué)珍,陸 苑,劉雪萍,韋水連，韋啟球

(廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院,廣西柳州 545005)

扛板歸又名貫葉蓼、河白草、蛇見退,系蓼科蓼屬植物扛板歸(PolygonumperfoliatumL.)的全草,分布全國各地?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,扛板歸有抗病毒、抗炎、抑菌、降血壓、抗誘變、抗腫瘤、止血等活性[1-2]。近年來國內(nèi)外主要是對扛板歸的黃酮類、蒽醌類、苯丙素等成分進(jìn)行較多的研究報(bào)道,但對扛板歸多糖的研究報(bào)道還尚少。黃家偉等[3]以離心時(shí)間、沉淀時(shí)間和沉淀劑用量為考察因素,運(yùn)用正交試驗(yàn)優(yōu)選扛板歸多糖丙酮沉淀的最佳工藝。Lai 等[4]對扛板歸多糖提取條件進(jìn)行了優(yōu)化,并證實(shí)該多糖具有顯著抗A549腫瘤細(xì)胞活性。

常用的多糖含量測定方法是比色法,可分為蒽酮-硫酸法[5]、苯酚-硫酸法[6]和3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)[7]等單一的方法。采用蒽酮-硫酸法或苯酚-硫酸法只能測定供試液中總糖含量;DNS法則需要通過鹽酸水解等方法分別測定總糖含量和還原糖含量,而后計(jì)算多糖含量。最近有運(yùn)用DNS法聯(lián)合蒽酮-濃硫酸法或苯酚-濃硫酸法測定多糖含量的報(bào)道[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)以扛板歸為原料,聯(lián)合苯酚-硫酸法和DNS法分別測定扛板歸水提液中的總糖含量和還原糖含量,兩者含量之差即為多糖含量,并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證;運(yùn)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)(CCD)-效應(yīng)面分析法(RSM)優(yōu)選多糖含量測定的最佳條件。為進(jìn)一步研究扛板歸多糖奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

當(dāng)歸 采自廣西壯族自治區(qū)柳州市郊區(qū)(2016年7月28日),經(jīng)廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院韋運(yùn)東副教授鑒定為蓼科蓼屬植物扛板歸(PolygonumperfoliatumL.)的干燥地上部分;重蒸苯酚 分析純,北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司;硫酸 分析純,廣州化學(xué)試劑廠;3,5-二硝基水楊酸(DNS) 分析純,阿拉丁試劑(上海)有限公司; 葡萄糖 分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠;其他試劑 均為市售,分析純。

TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HH-1型水浴鍋 常州蒙特儀器制造有限公司;TDL-5-A型臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;SF-200型高速萬能粉碎機(jī) 泰州市天泰制藥機(jī)械廠;XW-80A型旋渦混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;FA2204B型分析天平 上海精科儀器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;DHG-9241A型電熱恒溫干燥箱 上海圣科儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 當(dāng)歸的預(yù)處理 取扛板歸原藥材,自然涼干,粉碎(40目);30倍量的石油醚回流處理2次,每次2 h，抽濾,棄去提取液，取藥渣,揮干石油醚,得脫脂脫色扛板歸粉末,待用。

1.2.2 樣品供試液的制備 精密稱取“1.2.1”項(xiàng)下預(yù)處理扛板歸粉末1.0 g,30倍量蒸餾水回流提取2次,每次1.5 h[4]。經(jīng)離心(4000 r/min,10 min),得上層清液,合并上清液后轉(zhuǎn)至250 mL容量瓶中,蒸餾水定容至刻度,搖勻,得扛板歸水提液。取一定量扛板歸水提液準(zhǔn)確稀釋5倍,稀釋液作為總糖供試液。未稀釋的扛板歸水提液作為還原糖供試液。

1.2.3 測定波長的選擇

1.2.3.1 總糖測定波長的選擇 精密量取1 mL 0.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液于25 mL具塞試管中。分別加入1 mL 5%苯酚試劑和5 mL硫酸,充分混勻后,沸水浴中反應(yīng)15 min,冰水冷卻后,室溫放置10 min,作為葡萄糖對照組。以蒸餾水同法操作為空白組;以“1.2.2”項(xiàng)下的樣品溶液同法操作作為樣品組。將蒸餾水(調(diào)零)+空白組、空白組(調(diào)零)+葡萄糖組、空白組(調(diào)零)+樣品組分別在200～700 nm掃描,得吸光度曲線,選擇測定波長。

1.2.3.2 還原糖測定波長的選擇 精密量取1 mL 4 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液于25 mL 具塞試管中。加入3 mL(3,5-二硝基水楊酸)DNS 顯色劑[10],充分混勻后,沸水浴中反應(yīng)10 min,冰水冷卻后,蒸餾水稀釋至刻度,室溫放置10 min,作為葡萄糖對照組。以蒸餾水同法操作為空白組;以“1.2.2”項(xiàng)下的樣品溶液同法操作為樣品組。將蒸餾水(調(diào)零)-空白組、空白組(調(diào)零)-葡萄糖組、空白組(調(diào)零)-樣品組分別在200～700 nm掃描,得吸光度曲線,選擇測定波長。

1.2.4 總糖測定的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 總糖測定的單因素實(shí)驗(yàn) 分別精密量取1 mL總糖供試液于25 mL具塞試管中,每支加入不同體積5%苯酚試劑(0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL)和5 mL硫酸,充分混勻后,沸水浴中反應(yīng)15 min,冰水冷卻后,在冰水中補(bǔ)水至15 mL,室溫放置10 min。以蒸餾水同法操作為空白組,在486 nm波長處,空白組調(diào)零,測定各管吸光度值,比較苯酚試劑用量對吸光度的影響;固定苯酚試劑用量為2.0 mL,沸水浴中反應(yīng)時(shí)間為15 min,分別考察硫酸用量(3、4、5、6、7、8、9、10、11和12 mL)對吸光度值的影響;固定苯酚試劑用量為2.0 mL,硫酸用量為10 mL,分別考察反應(yīng)時(shí)間(5、10、15、20和25 min)對吸光度值的影響。

1.2.4.2 還原糖測定的單因素實(shí)驗(yàn) 分別精密量取1 mL還原糖供試液于25 mL 具塞試管中。每支加入不同體積的DNS顯色劑(1、2、3、4和5 mL),充分混勻后,沸水浴中反應(yīng)10 min,冰水冷卻后,蒸餾水稀釋至25 mL,室溫放置10 min。以蒸餾水同法操作為空白組,在540 nm波長處,空白組調(diào)零,測定各管吸光度值,比較不同體積的顯色劑對吸光度的影響;固定顯色劑用量為3 mL,反應(yīng)溫度為100 ℃,分別考察顯色時(shí)間(3、5、7、9、11、13和15 min)對吸光度值的影響;固定顯色劑用量為3 mL,顯色時(shí)間為9 min,分別考察顯色溫度(50、60、70、80、90和100 ℃)對吸光度值的影響。

1.2.5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

1.2.5.1 總糖測定的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化顯色條件 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)中心組合試驗(yàn),運(yùn)用軟件Design-Expert.8.0.5b建立3因素5水平的試驗(yàn),通過擬合二次多項(xiàng)式方程,確定苯酚-硫酸法測定總糖的最佳工藝。以吸光度為考察指標(biāo),苯酚試劑用量、硫酸用量和反應(yīng)時(shí)間為自變量,因素水平編碼見表1。

表1 總糖因素水平表Table 1 The response surface design of total sugar

1.2.5.2 還原糖測定的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化顯色條件 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)中心組合試驗(yàn),運(yùn)用軟件Design-Expert.8.0.5b建立3因素5水平的試驗(yàn),通過擬合二次多項(xiàng)式方程,確定DNS法測定還原糖的最佳工藝。以吸光度為考察指標(biāo),DNS 顯色劑用量、顯色時(shí)間和顯色溫度為自變量,因素水平編碼見表2。

表2 還原糖因素水平表Table 2 The response surface design of reducing sugar

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.6.1 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)苯酚-硫酸法[6]。分別精密量取100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL于6支25 mL具塞試管中,補(bǔ)蒸餾水至1 mL。分別加苯酚試劑1.7 mL和硫酸8.7 mL,充分混勻后,沸水浴中反應(yīng)11 min,冰水冷卻后,室溫放置10 min。在486 nm處測定吸光度A。以1 mL蒸餾水按同法操作為空白,以濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)x,吸光度A為縱坐標(biāo)y,線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6.2 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)DNS法[7]。分別精密量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL 1000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液于6支25 mL 具塞試管中,補(bǔ)蒸餾水至1 mL。加DNS試劑2.7 mL,充分混勻后,81 ℃水浴中反應(yīng)10 min,冰水冷卻后,蒸餾水稀釋至25 mL,室溫放置10 min。在540 nm處測定吸光度A。以1 mL蒸餾水按同法操作為空白,以濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)x,吸光度A為縱坐標(biāo)y,線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 樣品中多糖含量的測定 精密稱取“1.2.1”項(xiàng)下預(yù)處理扛板歸粉末1.0 g,3份。按“1.2.2”項(xiàng)下操作,制備樣品供試液。精密量取總糖供試液1 mL于具塞試管中,按照“1.2.6.1”方法自“加苯酚試劑”起,依法操作,測定吸光度值,由總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品中總糖含量(C1),按下公式計(jì)算樣品中總糖含量。精密量取還原糖供試液1 mL于具塞試管中,按照 “1.2.6.2”方法自“加DNS試劑”起,依法操作,測定吸光度值,由還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品中還原糖含量(C2),按下公式計(jì)算樣品中還原糖含量。從而計(jì)算樣品多糖含量。

樣品總糖含量(mg/g)=C1×D×V/(W×1000)

樣品還原糖含量(mg/g)=C2×V/(W×1000)

樣品多糖含量(mg/g)=樣品總糖含量-樣品還原糖含量

式中:C1、C2分別為總糖供試液中總糖和還原糖供試液中還原糖濃度,μg/mL;D為總糖供試液稀釋因子;V為提取液定容容積,mL;W為扛板歸質(zhì)量,g。

1.2.8 方法學(xué)考察

1.2.8.1 精密度試驗(yàn) 精密量取100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和1000 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液6份,各0.5 mL,補(bǔ)蒸餾水至1 mL。分別按“1.2.6.1”和“1.2.6.2”項(xiàng)下操作,測定吸光度,考察苯酚-硫酸法和DNS法的精密度。

1.2.8.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取“1.2.1”項(xiàng)下預(yù)處理扛板歸粉末6份,每份1.0 g,按照樣品供試液的制備方法制備總糖供試液和還原糖供試液,再根據(jù)苯酚-硫酸法測定總糖供試液吸光度、DNS法測定還原糖供試液吸光度?？疾旆椒ǖ闹貜?fù)性。

1.2.8.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密量取0.5 mL總糖供試液和1 mL還原糖供試液各一份,補(bǔ)蒸餾水至1 mL。分別按“1.2.6.1”和“1.2.6.2”項(xiàng)下操作進(jìn)行測定,分別在第10、20、30、40、50、60、70、80和90 min測定吸光度,考察苯酚-硫酸法和DNS法的穩(wěn)定性。

1.2.8.4 樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn) 精密稱取 “1.2.1”項(xiàng)下預(yù)處理、總糖含量已知扛板歸粉末1.0 g,9份。均分為低、中、高3組,各組分別精確加入相當(dāng)于總糖含量80%、100%、120%的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品。按照樣品制備項(xiàng)下制備總糖供試液,依法測定各組總糖含量,計(jì)算回收率。

精密稱取“1.2.1”項(xiàng)下預(yù)處理、還原糖含量已知扛板歸粉末1.0 g,9份。均分為低、中、高3組,各組分別精確加入相當(dāng)于還原糖含量80%、100%、120%的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品。按照樣品制備項(xiàng)下制備還原糖供試液,依法測定各組還原糖含量,計(jì)算回收率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 7.5 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定波長的選擇

苯酚-硫酸法的掃描曲線見圖1a,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的最大吸收波長均在486 nm,在此波長處,空白組干擾甚小。故選486 nm為總糖的測定波長。

由圖1b可知,氨基化合物的最大吸收波長為482 nm,由于最大吸收波長處具有高靈敏度的特性,一般測定波長的選擇均會優(yōu)先選擇最大吸收波長。但是,該試驗(yàn)在此波長處DNS試劑也具有很強(qiáng)的吸光度(水+DNS試劑)。在實(shí)驗(yàn)過程中,顯色之前空白組和待測組中DNS試劑的加入量是相同的,但顯色期間由于部分DNS試劑與待測液中還原糖相結(jié)合,空白組中DNS試劑含量大于待測液中DNS試劑含量,若選擇最大吸收波長作為測定波長,則DNS試劑對試驗(yàn)結(jié)果有較大干擾,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。分析發(fā)現(xiàn),在波長小于540 nm 以下,DNS試劑對測定結(jié)果干擾嚴(yán)重,故還原糖測定波長選擇為540 nm,與文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道結(jié)果一致。

圖1 吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectrum 注:a:總糖;b:還原糖。

2.2 總糖測定的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 苯酚試劑的用量對吸光度的影響 圖2a結(jié)果顯示,在0.5～2.0 mL范圍內(nèi),隨著苯酚試劑用量的增加,吸光度值也相應(yīng)增加,當(dāng)用量為2.0 mL時(shí),吸光度達(dá)到最大值。然而當(dāng)苯酚試劑用量達(dá)到2.5 mL時(shí),吸光度值降低,故選擇2.0 mL為苯酚試劑最佳用量。

2.2.2 硫酸用量對吸光度的影響 圖2b結(jié)果表明,隨著硫酸用量的增加,吸光度值也快速增加,當(dāng)用量達(dá)到10 mL時(shí),吸光度值才趨于穩(wěn)定。然而當(dāng)硫酸用量達(dá)到12 mL時(shí),吸光度有下降的趨勢,可能是硫酸用量過多導(dǎo)致多糖碳化[13]。為了節(jié)省試劑,試驗(yàn)選擇硫酸用量為10 mL。

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間對吸光度的影響 由圖2c可知,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,吸光度在逐步上升,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到20 min時(shí),吸光度達(dá)到最大值。再延長反應(yīng)時(shí)間,吸光度下降,可能是多糖結(jié)構(gòu)部分受到破壞所致[14]。為使反應(yīng)完全,故選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為20 min。

圖2 苯酚用量(a)、硫酸用量(b)和反應(yīng)時(shí)間(c)對吸光度的影響 Fig.2 Effects of different phenol amount(a),amount of sulfuric acid(b)and reaction time(c)on absorbance

2.3 還原糖的單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 顯色劑用量對吸光度的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3a,顯色劑用量在1～3 mL的范圍內(nèi),吸光度值逐漸上升至最大值,而后吸光度值變化變緩,差異不明顯。為了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,顯色劑用量應(yīng)不小于3 mL,故選擇顯色劑用量3 mL為宜。

2.3.2 顯色時(shí)間對吸光度的影響 圖3b實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,吸光度值在9 min中內(nèi)隨著顯色時(shí)間的延長而逐漸升高,當(dāng)顯色時(shí)間達(dá)到9 min時(shí),吸光度值趨于穩(wěn)定,表明在該實(shí)驗(yàn)條件下顯色反應(yīng)9 min時(shí)，反應(yīng)已基本完成。根據(jù)吸光度值趨于穩(wěn)定后選最短用時(shí)原則,不但提高還原糖的檢測效率而且還降低能耗[15。因此,顯色時(shí)間選擇9 min為宜。

2.3.3 顯色溫度對吸光度的影響 顯色溫度對吸光度的影響見圖3c,隨著溫度的升高,吸光度值持續(xù)升高,當(dāng)溫度達(dá)到90 ℃時(shí),吸光度出現(xiàn)最大值。當(dāng)溫度達(dá)到100 ℃時(shí),吸光度值反而有下降趨勢,可能是溫度過高使顯色復(fù)合物揮發(fā)所致[16]。故顯色溫度選擇90 ℃為宜。

圖3 (a)顯色劑用量、(b)顯色時(shí)間和(c)顯色溫度對吸光度的影響Fig.3 Effects of different(a)DNS amount,(b)coloration time and(c)coloration temperature on absorbance

2.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用苯酚-硫酸法測定總糖含量,苯酚試劑用量在0.5～2.0 mL、硫酸用量在3～10 mL、反應(yīng)時(shí)間在5～20 min范圍內(nèi)對測定指標(biāo)的影響較大;DNS法測定還原糖過程中,顯色劑用量在1～3 mL、顯色時(shí)間在3～15 min、顯色溫度在50～90 ℃的范圍內(nèi)對測定指標(biāo)的影響較大。試驗(yàn)設(shè)計(jì)[13-14]與結(jié)果分別見表3和表4。

2.4.2 模擬方程的建立及顯著性分析 利用軟件Design-Expert.8.0.5b分別對表3和表4數(shù)據(jù)進(jìn)行二次線性回歸擬合。總糖含量測定的二次線性回歸方程為Y=0.66+0.012X1+0.07X2+0.008853X3-0.00225X1X2-0.003X1X3-0.014X2X3-0.018X12-0.035X22-0.018X32(R2=0.9761);對該模型及系數(shù)進(jìn)行方差分析,見表5。上述模型p<0.0001,模型極顯著。失擬項(xiàng)p=0.0509>0.05,無顯著性意義,說明該模型對本實(shí)驗(yàn)的擬合程度良好,可靠性高。模型決定系數(shù)R2=0.9761,應(yīng)用該回歸模型能夠?qū)Ρ椒?硫酸法測定總糖含量的效果進(jìn)行較好的分析和預(yù)測。分析各模型系數(shù)的p值,X1、X2、X2X3、X12、X22和X32項(xiàng)影響顯著或極顯著(p<0.05或p<0.01),而X3、X1X2和X1X3項(xiàng)影響不顯著(p>0.05)。

表3 總糖星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface central composite design and results for absorbance of total sugars

表4 還原糖星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Response surface central composite design and results for absorbance of reducing sugars

表5 總糖二項(xiàng)式回歸模型方差分析結(jié)果Table 5 Results of ANOVA for response surface quadratic model obtained from total sugars

表6 還原糖二項(xiàng)式回歸模型方差分析結(jié)果Table 6 Results of ANOVA for response surface quadratic model obtained from reducing sugars

各因素對考察指標(biāo)影響的分析,用各因素的F值可評價(jià)該對試驗(yàn)指標(biāo)的影響,F值越大,表明該因素的影響越顯著。由表5可知,F(X1)=8.55,F(X2)=288.31,F(X3)=4.62,即各因素對總糖含量的影響順序?yàn)榱蛩嵊昧?苯酚用量>反應(yīng)時(shí)間。由表6可知,F(X4)=17.54,F(X5)=20.31,F(X6)=89.92,即各因素對還原糖的影響順序?yàn)轱@色溫度>顯色時(shí)間>顯色劑用量。

以效應(yīng)值為縱坐標(biāo),固定3個(gè)自變量之一為中值,其他兩個(gè)自變量為橫坐標(biāo),Design-Expert.8.0.5b軟件繪制三維效應(yīng)面圖。效應(yīng)曲面的坡度變化可以反映因素對考察指標(biāo)影響的強(qiáng)弱程度及其交互作用。效應(yīng)曲面坡度陡峭時(shí),表明效應(yīng)值對處理?xiàng)l件的變化非常敏感;效應(yīng)曲面相對平緩則說明考察因素對考察指標(biāo)影響不大?？疾炝吮椒佑昧俊⒘蛩嵊昧亢头磻?yīng)時(shí)間對總糖含量影響的效應(yīng)曲面。如圖4所示,硫酸用量和反應(yīng)時(shí)間之間交互作用顯著(p<0.05),隨著硫酸用量增加和反應(yīng)時(shí)間的延長,吸光度值逐漸增大,在用量增至8 mL和反應(yīng)時(shí)間持續(xù)到11 min之后逐漸變緩。顯色劑用量、顯色時(shí)間和顯色溫度對DNS法測定還原糖含量影響的效應(yīng)曲面見圖5。由圖5可知,顯色劑用量、顯色時(shí)間和顯色溫度3因素中,兩因素交互作用對DNS法測定還原糖含量有一定影響,但均不顯著。

圖4 總糖苯酚用量、硫酸用量和反應(yīng)時(shí)間對吸光度影響的效應(yīng)面圖Fig.4 Response surface showing the effect of phenol amount,amount of sulfuric acid and reaction time on absorbance of total sugars

圖5 還原糖DNS試劑用量、顯色時(shí)間和顯色溫度對吸光度影響的效應(yīng)面圖Fig.5 Response surface showing the effect of DNS amount,coloration time and coloration temperature on absorbance of reducing sugars

2.4.3 最佳測定條件及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 由Design-Expert.8.0.5b軟件分析得出苯酚-硫酸法測定總糖的最佳條件為:苯酚試劑用量為 1.71 mL,硫酸用量8.68 mL,反應(yīng)時(shí)間為11.28 min,該條件下吸光度的理論值為0.693。為檢驗(yàn)該最佳測定條件的可靠性,進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?？紤]到實(shí)際操作的可行性,將測定條件改進(jìn)為:苯酚試劑用量為 1.7 mL,硫酸用量8.7 mL,反應(yīng)時(shí)間為11.0 min。通過 3 次平行實(shí)驗(yàn),測得最佳條件下吸光度值為 0.678,與理論值的相對誤差為2.45%。因此,利用效應(yīng)曲面法優(yōu)化苯酚-硫酸法測定總糖的最佳條件是可行的。

NDS法測定還原糖的最佳條件為:顯色劑用量為2.66 mL,顯色時(shí)間10.19 min,顯色溫度81.33 ℃,該條件下吸光度的理論值為0.281?？紤]到實(shí)際操作的可行性,將測定條件改進(jìn)為:顯色劑用量為2.7 mL,顯色時(shí)間10 min,顯色溫度81 ℃。通過3次平行實(shí)驗(yàn),測得最佳條件下吸光度值為0.272,與理論值的相對誤差為1.42%。因此,利用效應(yīng)曲面法優(yōu)化NDS法測定還原糖的最佳條件是可行的,有較好的預(yù)測作用。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

苯酚-硫酸法測定總糖含量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6(a),線性回歸方程為y=0.00693x-0.01942(r=0.99983),說明葡萄糖濃度在10～100 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.99983。

DNS法測定還原糖的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6(b),線性回歸方程為y=0.00079x-0.05782(r=0.99990),表明葡萄糖濃度在100～1000 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.99990。

圖6 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 The standard curve of glucose注:a:苯酚-硫酸法;b:DNS法。

2.6 樣品含量測定結(jié)果

按照本實(shí)驗(yàn)方法對扛板歸總糖含量和還原糖含量分別進(jìn)行了測定,從而計(jì)算扛板歸多糖含量?？偺呛繛?49.78 mg/g,RSD 1.91%(n=3);還原糖含量為103.06 mg/g,RSD 2.30%(n=3);多糖含量為46.72 mg/g。

2.7 方法學(xué)考察結(jié)果

2.7.1 精密度試驗(yàn) 計(jì)算相應(yīng)供試品中總糖和還原糖的吸光度分別為0.327±0.007(n=6)和0.352±0.004(n=6),表明苯酚-硫酸法測定總糖和DNS法測定還原糖精密度良好。

2.7.2 重復(fù)性試驗(yàn) 計(jì)算相應(yīng)供試品中總糖和還原糖的吸光度分別為0.376±0.009(n=6)和0.272±0.004(n=6),表明苯酚-硫酸法測定總糖和DNS法測定還原糖重復(fù)性良好。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 計(jì)算相應(yīng)供試品中總糖和還原糖的吸光度分別為0.378±0.004(n=9)和0.272±0.004(n=9),表明苯酚-硫酸法測定總糖顯色和DNS法測定還原糖顯色在90 min內(nèi)均穩(wěn)定。

2.7.4 樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn) 計(jì)算相應(yīng)供試品中苯酚-硫酸法測定總糖加樣回收率和DNS法測定還原糖加樣回收率分別為102.26±4.12(n=9)和102.89±2.73(n=9);RSD值依次為4.03%、2.66%,均小于5%。結(jié)果表明苯酚-硫酸法測定總糖和DNS法測定還原糖的加樣回收率良好。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,運(yùn)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)(CCD)-效應(yīng)面分析法(RSM)優(yōu)選總糖和還原糖測定的最佳條件?？偺菧y定最佳條件為:苯酚用量1.7 mL,硫酸用量8.7 mL,顯色時(shí)間11 min;還原糖測定最佳條件:顯色劑用量2.7 mL,顯色時(shí)間10 min,顯色溫度81 ℃。在該條件下,扛板歸多糖含量為46.72 mg/g。

本文建立苯酚-硫酸法聯(lián)合DNS法測定扛板歸多糖的含量,方法學(xué)結(jié)果表明該方法靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好,苯酚-硫酸法和 DNS 法分別測定水提液中總糖和還原糖含量,多糖含量為總糖與還原糖含量差值,可避免水提液中還原糖的干擾,從而客觀評價(jià)扛板歸多糖含量,為扛板歸多糖的后續(xù)研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。