結(jié)直腸癌術(shù)后輔助卡培他濱為基礎(chǔ)化療方案的臨床療效及相關(guān)藥物基因組學(xué)分析*

劉世舉 張慧儉 王金榜 楊會舉 張新春 劉翔 劉佃溫

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球發(fā)病率排名第3位的惡性腫瘤［1］，目前在中國每年新發(fā)病例約為37.5萬，死亡為19.1萬例［2-3］?；趯Α癐DEA”研究的認(rèn)可，2018年第1版美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）指南推薦對于低危Ⅲ期結(jié)直腸癌推薦3個(gè)月的卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑的輔助化療方案［4］。因此，CRC術(shù)后輔助化療仍是以卡培他濱為基礎(chǔ)的化療方案［5］?？ㄅ嗨麨I需要經(jīng)過3步酶聯(lián)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為5-FU，其中最重要的為被胞苷脫氨酶（cytidine deaminase，CDD）和胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TYMP）代謝成5-FU而發(fā)揮細(xì)胞毒作用。5-FU的主要作用靶標(biāo)為胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS），被二氫嘧啶脫氫酶（dihydropyrimidine dehydroge?nase，DPD）滅活［6］。因此，在卡培他濱代謝為5-FU過程中，CDD具有重要作用。

CDD基因位于染色體1p36.12，包含4個(gè)外顯子。該基因的表達(dá)在體內(nèi)普遍存在，主要表達(dá)于肝臟，既往研究結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞內(nèi)較高的CDD表達(dá)水平和對卡培他濱的敏感性呈顯著正相關(guān)［7］。CDD基因-451C＞A位點(diǎn)在既往研究中發(fā)現(xiàn)可以影響CDD基因的活性［8］。近期在188例接受貝伐珠單抗聯(lián)合紫杉醇卡培他濱治療的晚期乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)，CDD基因-451C＞A位點(diǎn)的GA/AA基因型患者的客觀緩解率達(dá)到66.7%，顯著高于野生型的患者［9］。然而，目前在CRC輔助化療領(lǐng)域，尚缺乏CDD基因-451C＞A位點(diǎn)和預(yù)后的關(guān)聯(lián)性研究。

因此，本研究旨在評估CDD基因-451C＞A位點(diǎn)與接受卡培他濱為基礎(chǔ)輔助化療方案的CRC患者預(yù)后相關(guān)性，并探討該位點(diǎn)對外周血單核細(xì)胞中CDD基因mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 病例資料

本研究回顧性分析2010年1月至2017年6月河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院收治術(shù)后接受輔助化療的CRC患者215例。入組標(biāo)準(zhǔn)：1）年齡≥18歲，ECOG評分為0～2分，心功能正常（左心室射血分?jǐn)?shù)＞50%），腎功能正常（肌酐≤1.5×ULN），骨髓功能正常（中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)≥1.5×109/L，血小板計(jì)數(shù)≥100×109/L，血紅蛋白≥9 g/dL）；2）預(yù)期壽命≥3個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：家族性腺瘤性息肉病、其他遺傳性CRC綜合征及失訪的患者。

輔助化療的用法用量：術(shù)后3～4周，卡培他濱，1 000 mg/m2，2次/d，第1～14 d，每21 d為1個(gè)周期。奧沙利鉑，80～130 mg/m2，靜脈滴注，第1 d。輔助化療結(jié)合患者情況為6～8個(gè)周期。根據(jù)治療過程中出現(xiàn)的血液學(xué)或非血液學(xué)毒性調(diào)整相應(yīng)的給藥劑量，如發(fā)生威脅生命的不良反應(yīng)則中止治療。本研究獲得河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（批號：科研-2016-013），所有入組患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本收集及基因分型 治療過程中收集患者的外周血樣本4 mL，用苯酚氯仿法提取基因組DNA，之后于-20℃保存。設(shè)計(jì)包含-451C＞A（rs532545）位點(diǎn)的上下游PCR引物，上游引物：5′-TCAAAGGTCC AAGCTCCAAG-3′；下游引物：5′-GGGCTAGGGCAAA GAGAAGT-3′，產(chǎn)物片段為208 bp，通過限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）方法對該位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。分析設(shè)置陰性參照，＞10%的樣本至少分析1次確保樣本未被污染，部分樣本的分型結(jié)果通過直接測序方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 外周血單核細(xì)胞提取及CDD基因mRNA表達(dá)分析 收集85例患者化療前的外周血標(biāo)本，采用淋巴細(xì)胞分離液Histopaque-1077（購自美國Sigma公司）對標(biāo)本進(jìn)行外周血單核細(xì)胞的提取。用Trizol試劑（購自大連寶生物工程有限公司）提取PBMC中的RNA。用real-time PCR法進(jìn)行CDD mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)，CDD基因的上游引物：5′-TGGCCCAGAAGCGT CCTG-3′；下游引物：5′-TCACTGGGTCTTCTGCAGG TCC-3′。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系：SYBN Premix Ex Tag溶液10 μL，TYMP F primer（20 μM）0.2 μL，TYMP R primer（20 μM）0.2 μL，ddH2O 7.6 μL，cDNA2 μL，反應(yīng)體系總計(jì)20 μL，GAPDH mRNA表達(dá)用作內(nèi)參。CDD mRNA用相對定量法2-△△Ct進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 隨訪 全部患者入組后開始隨訪，前期隨訪在患者就診醫(yī)院接受固定周期輔助化療期間進(jìn)行，此階段可以明確獲取每例患者復(fù)發(fā)的原因和日期。后期對總生存期（overall survival，OS）與患者后線接受的治療情況進(jìn)行電話隨訪，重點(diǎn)詢問死亡狀態(tài)和日期。本研究最后一次隨訪時(shí)間為2017年12月，所有患者從納入研究到最后1次隨訪的中位隨訪時(shí)間為4.21（0.5～6.1）年。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)分析多態(tài)性位點(diǎn)基因分型是否符合哈迪溫伯格平衡。在基線臨床資料中，離散型變量和-451C＞A位點(diǎn)不同基因型的分布采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)數(shù)據(jù)較少時(shí)采用Fisher精確檢驗(yàn)。連續(xù)型變量和-451C＞A位點(diǎn)不同基因型的分析采用非參檢驗(yàn)的Mann-Whitney U（兩組間）或Kruskal-Wallis H（多組間）檢驗(yàn)。采用Stata 14.0軟件繪制Kaplan-Meier曲線比較不同基因型患者無病生存期（disease-free survival，DFS）和OS的差異，曲線間的差異采用對數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行比較。DFS定義為從手術(shù)開始到疾病復(fù)發(fā)或任何原因引起死亡的時(shí)間。OS定義為從手術(shù)開始到任何原因引起死亡的時(shí)間。不良反應(yīng)的多變量分析采用二元的Logistic回歸分析，生存分析的多變量分析通過Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型校正。采用向后LR的選擇步驟來篩選和校正潛在的混雜變量。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 215例患者基線臨床資料及-451C＞A位點(diǎn)基因分型情況

215例患者的基線臨床資料見表1。入組患者中位年齡為52歲，ECOG評分為0分的患者139例（64.65%），結(jié)腸癌和直腸癌分別為129例和86例，腫瘤分化中等患者149例（69.30%）。在臨床分期上，Ⅱ期患者57例，Ⅲ期158例。所有患者均接受術(shù)后輔助化療，其中卡培他濱單藥方案67例（31.16%），卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑方案148例（68.84%）。

-451C＞A位點(diǎn)的基因分型結(jié)果為：野生GG型157例（73.02%），GA型53例（24.65%），AA型5例（2.33%），最小等位基因頻率為0.15，3種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.834）。

表1 215例CRC患者的基線臨床資料及-451C>A位點(diǎn)基因型的基線臨床資料對比 n（%）

2.2 CDD基因-451C＞A位點(diǎn)和DFS及OS的關(guān)聯(lián)

-451C＞A位點(diǎn)突變純合子AA型患者僅5例，故后期分析將GA和AA患者合并，共計(jì)58例。野生型GG型和突變的GA/AA基因型患者在基線臨床資料上分布均衡（表1）。

對215例患者的總體數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，患者3年DFS為67.44%（95%CI：60.93%～73.49%），5年OS為58.60%（95%CI：51.21%～68.82%）。

-451C＞A位點(diǎn)不同基因型患者的3年DFS呈顯著性差異。攜帶A等位基因的GA/AA基因型患者和野生型GG型患者的3年DFS分別為81.03%和62.42%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002，圖1）。另外，本研究構(gòu)建Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型，將可能影響DFS的風(fēng)險(xiǎn)因素如年齡、性別、ECOG評分（1～2分歸為一組）、腫瘤分期及-451C＞A位點(diǎn)不同基因型納入該模型。經(jīng)過多變量校正，-451C＞A位點(diǎn)對DFS獨(dú)立的影響意義依然存在，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR=0.55，P=0.011）。在Cox模型中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量還有 ECOG 評分（OR=1.88，P=0.009）和腫瘤分期（OR=2.95，P＜0.001）（表2）。

圖1 215例CRC患者中CDD基因-451C＞A位點(diǎn)不同基因型患者的DFS曲線

表2 影響DFS的基線臨床資料以及多態(tài)性位點(diǎn)的多變量Cox回歸分析

在針對OS的單因素變量分析中，兩組基因型患者OS呈顯著性差異，GA/AA基因型患者和GG基因型患者的5年OS率分別為72.41%和53.50%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.016，圖2）。

圖2 215例CRC患者中CDD基因-451C＞A位點(diǎn)不同基因型患者的OS曲線

本研究對手足綜合征（hand foot syndrome，HFS）的發(fā)生情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明215例患者中出現(xiàn)2級及以上HFS患者為67例（31.16%）。GA/AA基因型患者中2級及以上HFS的發(fā)生率為44.83%，GG基因型患者中發(fā)生率為26.11%。GA/AA基因型患者中HFS的發(fā)生率顯著高于GG型患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）。

2.3 -451C＞A位點(diǎn)對CDD基因mRNA表達(dá)的影響

本研究納入85例從患者的外周血單核細(xì)胞標(biāo)本，通過提取的RNA對CDD的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行分析，并和-451C＞A位點(diǎn)的基因型進(jìn)行相關(guān)性分析。在85例PBMC標(biāo)本中，GG型62例，GA型21例，AA型2例，3種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.889）。AA型患者相對較少，將AA型和GA型患者合并，共計(jì)23例。攜帶A等位基因的GA/AA型患者相對于GG型患者，CDD mRNA表達(dá)水平明顯較高（3.02±0.16vs.2.33±0.32），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖3）。

圖3 CDD基因-451C＞A位點(diǎn)不同基因型患者的相對CDD mRNA表達(dá)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)-451C＞A位點(diǎn)野生型GG基因型患者相較于攜帶A等位基因的GA和AA基因型患者具有顯著較差的DFS和OS，并發(fā)現(xiàn)不同基因型患者的CDD基因mRNA表達(dá)水平呈較大的差異。-451C＞A位點(diǎn)可能通過影響CDD基因的表達(dá)使CRC患者從卡培他濱為基礎(chǔ)的輔助化療中獲益。

本研究215例患者3年DFS率為67.44%（95%CI：60.93%～73.49%），5年OS率為58.60%（95%CI：51.21%～68.82%），低于NO.16968研究的3年DFS為70.9%和 5年 OS為 77.6%［10］，可能因?yàn)楸狙芯恐蠩COG評分為0分的患者比例低于NO.16968研究（64.65%vs.77.00%）。可能因?yàn)榛仡櫺苑治鱿鄬τ谠O(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)、給藥方案規(guī)范的Ⅲ期臨床研究的療效較低，本研究結(jié)果與張德志等［11］的研究結(jié)果相符。

另外，本研究中57例Ⅱ期結(jié)直腸癌患者是否能從卡培他濱為基礎(chǔ)的化療方案治療中獲益，目前尚存爭議，在Ⅱ期具有MSI-H/d-MMR的患者中未能從氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的輔助化療當(dāng)中獲益，這部分患者可能在Ⅱ期患者中的分布頻率只有不到20%［12］。

本研究結(jié)果表明，部分中國CRC患者接受卡培他濱為基礎(chǔ)的輔助化療方案時(shí)，CDD基因-451C＞A位點(diǎn)的A等位基因攜帶者可通過影響該基因的表達(dá)，使得該基因型患者對卡培他濱更為敏感，進(jìn)而從卡培他濱的輔助化療中獲益。本研究結(jié)果與Lam等［9］的研究結(jié)果相符，該研究納入188例接受紫杉醇、卡培他濱聯(lián)合貝伐珠單抗治療的晚期乳腺癌患者，通過對CDD基因-451C＞A等位點(diǎn)進(jìn)行基因分型并和療效進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了該位點(diǎn)GA/AA基因型患者具有顯著較高的客觀緩解率和顯著較長的中位無進(jìn)展生存期。但是該研究并未進(jìn)一步分析該位點(diǎn)和CDD基因表達(dá)及活性的關(guān)聯(lián)。另外，Caronia等［13］的一項(xiàng)研究納入130例接受卡培他濱治療的CRC和乳腺癌患者，結(jié)果表明在高加索人群中-451C＞A位點(diǎn)的等位基因頻率達(dá)到0.30，而本研究中該位點(diǎn)僅為0.14，說明該位點(diǎn)具有較大的種族差異。該研究表明，-451C＞A位點(diǎn)的A等位基因攜帶者具有顯著較高的3級HFS發(fā)生率，與本研究結(jié)果一致。既往的研究結(jié)果提示，出現(xiàn)3級HFS的患者具有較好的預(yù)后［14］。然而，在表達(dá)分析中并未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)和CDD基因mRNA表達(dá)的相關(guān)性，與本研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)樵撐稽c(diǎn)存在較大的種族差異。本研究基因表達(dá)的結(jié)果也可以部分解釋CDD基因-451C＞A多態(tài)性位點(diǎn)具有較好預(yù)后的原因：GA/AA基因型的個(gè)體通過引起CDD mRNA的高表達(dá)從而在卡培他濱代謝過程中更多地代謝為5-FU，進(jìn)而使患者從卡培他濱的術(shù)后輔助化療中獲益。

綜上所述，本研究結(jié)果表明在部分中國CRC人群中CDD基因-451C＞A位點(diǎn)是一個(gè)獨(dú)立的DFS影響因素。本研究也存在部分局限性，首先，納入研究的樣本量較小。其次，作為回顧性分析，無法避免偏倚。然而，本研究對-451C＞A位點(diǎn)的預(yù)后影響進(jìn)行了較為充分的評估，也從CDD基因mRNA表達(dá)層面揭示了該位點(diǎn)造成預(yù)后差異的可能因素，對結(jié)直腸癌術(shù)后輔助卡培他濱為基礎(chǔ)化療方案的患者預(yù)后評估具有一定的參考價(jià)值。亟需大樣本前瞻性臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。