hrHPV DNA載量 分型和E6蛋白對宮頸癌前病變進展的預測作用*

張莉 李佳瑤② 熱米拉·熱扎克 胡尚英 徐小倩 趙雪蓮 趙爽 胡芳芳② 陳鳳 張詢喬友林 趙方輝

近十余年來，我國宮頸癌的發(fā)病率和死亡率呈升高趨勢，2015年我國宮頸癌新發(fā)9.9萬例，死亡3.1萬例［1］。自2009年，我國政府在農(nóng)村地區(qū)啟動了宮頸癌和乳腺癌的兩癌篩查項目，隨著篩查規(guī)模的逐步擴大和高危型人乳頭瘤病毒（high risk human papil?lomavirus，hrHPV）DNA檢測的推廣應(yīng)用，越來越多的hrHPV陽性和宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變1級（cervical in?traepithelial neoplasia grade 1，CIN1）婦女被檢出，CIN1主要由hrHPV一過性感染引起，逆轉(zhuǎn)率高，尤其是多發(fā)于年輕婦女中。國際上推薦針對CIN1和hrHPV陽性婦女均采取定期隨訪、無需手術(shù)的管理方式［2］。

目前尚無明確預測CIN1進展的生物學標志物，也無有效治療hrHPV感染的方法，因此識別hrHPV陽性和CIN1婦女中真正具有進展風險的高危人群并進行風險分層管理是目前亟需解決的難題。本研究基于以人群為基礎(chǔ)的宮頸癌篩查隊列，從hrHPV DNA和E6蛋白兩個層面，探討影響婦女hrHPV陽性和CIN1進展的分子標志物，為我國宮頸癌篩查的管理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2010年10月至2012年8月中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院與美國衛(wèi)生適宜技術(shù)研究所合作，在宮頸癌高發(fā)區(qū)山西省陽城縣、河南省新密市以及江西省銅鼓縣招募7 543名婦女。入組條件為25～65歲，無宮頸癌及癌前病變史，具有完整的宮頸，目前處于非妊娠期，能夠理解并自愿簽署知情同意書。滿足以下條件者納入本研究：1）基線hrHPV陽性但病理結(jié)果正常者；2）病理診斷CIN1者；3）參與1年后隨訪且篩查結(jié)果完整者。

1.2 方法

每名婦女均自愿簽署知情同意書，由經(jīng)過培訓的當?shù)卣{(diào)查員進行宮頸癌危險因素問卷調(diào)查，再進行婦科檢查和標本收集。

1.2.1 篩查方法 宮頸癌篩查基線采用HC2和careHPV對婦女自我取樣、醫(yī)生取樣的hrHPV DNA檢測、E6蛋白（Onco E6）檢測以及醋酸染色后肉眼觀察6種方法。所有careHPV陽性的標本進行careHPV16/18/45分型檢測。1年后采用同樣的方法對基線任一結(jié)果陽性婦女進行隨訪［3］。

hrHPV DNA檢測以醫(yī)生取樣的careHPV檢測結(jié)果為準，careHPV以及進一步分型的careHPV16/18/45均基于雜交捕獲的原理，通過熒光信號放大的手段，提供檢測標本中相應(yīng)hrHPV的病毒載量，當標本的相對光單位值大于或等于閾值時（即RLU/PC≥1.0）為陽性。careHPV可在2.5 h內(nèi)一次性檢測14種hrH?PV（16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/66/68），而careHPV16/18/45檢測出3種hrHPV（16/18/45）。根據(jù)相對光單位值對HPV載量進行分組［4］，在RLU/PC≥1.0的基礎(chǔ)上，RLU/PC＜10.0為低載量組，RLU/PC≥10.0為中高載量組。Onco E6是一種基于免疫色譜法的hrHPV E6蛋白檢測技術(shù)，通過試紙條可半定量檢出hrHPV16/18/45型的E6蛋白，并提供具體的分型信息。

1.2.2 陰道鏡和組織病理學檢查 初篩結(jié)果任一陽性者轉(zhuǎn)診行陰道鏡檢查，陰道鏡下異常時直接活檢，若陰道鏡下無異常表現(xiàn)，將進行四象限2、4、8、10點活檢并進行頸管搔刮術(shù)，所有活檢標本均由中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院的2名病理醫(yī)生獨自閱片，結(jié)果不一致時，經(jīng)討論給出一致的診斷結(jié)果。所有診斷為宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變2級及以上（cervical intraepithe?lial neoplasia grade 2 or worse，CIN2+）的標本，由美國的1名病理醫(yī)生再次閱片質(zhì)控。

1.2.3 轉(zhuǎn)歸 1年后的病理結(jié)果較基線發(fā)生進展為主要研究終點，包括由正常進展至CINs或由CIN1進展至CIN2+，設(shè)為進展組。病理結(jié)果維持不變/減輕者，納入維持/逆轉(zhuǎn)組。

1.3 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料分析采用χ2檢驗，單因素分析及多因素Logistic回歸模型分析影響病理進展的相關(guān)因素。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 納入分析與未納入分析婦女在基線時的社會人口學特征

基線hrHPV陽性或CIN1者共958例，其中164例因失訪或無明確的病理結(jié)果未納入分析，最終納入分析794例。年齡以及其他社會人口學特征在納入分析和未納入分析婦女中的分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。

2.2 不同轉(zhuǎn)歸組基線篩查結(jié)果的比較

在納入分析的794例婦女中1年后病理進展者為88例，進展至CIN2+者為23例。進展組基線hrH?PV載量75%分布在中高載量組，而維持/逆轉(zhuǎn)組基線hrHPV載量48%左右分布在低、中高載量組，兩組間分布差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進展組中hrH?PV16/18/45分型以及E6蛋白（Onco E6）的陽性率均高于維持/逆轉(zhuǎn)組（表2）。

2.3 基線篩查結(jié)果對病理進展的預測作用

單因素分析結(jié)果顯示，hrHPV中高載量組進展的風險約是低載量組3倍。hrHPV16/18/45、E6蛋白（Onco E6）陽性者1年后進展的風險分別為陰性者的2.4、2.9倍（表3）。多因素Logistic回歸模型分析顯示，E6蛋白（Onco E6）與進展的關(guān)聯(lián)無顯著性差異，hrHPV中高載量者、hrHPV16/18/45陽性者進展的風險分別是hrHPV低載量、hrHPV16/18/45陰性者的2.6倍（95%CI為1.6～4.4）、1.9倍（95%CI為1.2～3.1）。

表1 794例納入分析和164例未納入分析的婦女基線人口學特征比較

進一步分析婦女不同篩查結(jié)果進展至CIN2+的風險，基線中高載量和hrHPV16/18/45陽性者，1年后進展為CIN2+的絕對風險分別為4.9%（95%CI為3.2～7.4）和9.0%（95%CI為9.5～14.3）。對于E6蛋白（Onco E6）陽性婦女的風險高達18.8%（95%CI為10.2～31.9），見圖1。

2.4 hrHPV16/18/45載量聯(lián)合E6蛋白對病理進展的預測作用

婦女careHPV16/18/45陰性者的E6蛋白亦陰性，1年后病理級別的進展絕對風險為8.9%（56/626），而hrHPV16/18/45中高載量且E6蛋白（Onco E6）陽性者的進展絕對風險高達32.4%（11/34），且進展者中72.3%（8/11）進展至CIN2+。以hrHPV16/18/45陰性組婦女為對照，hrHPV16/18/45低載量且E6蛋白（On?co E6）陰性、hrHPV16/18/45低載量但E6蛋白（Onco E6）陽性、hrHPV16/18/45中高載量但E6蛋白（Onco E6）陰性、hrHPV16/18/45中高載量且E6蛋白（Onco E6）陽性的進展相對風險分別為2.1、1.7、1.7、4.9倍，而hrHPV16/18/45低載量且E6蛋白（Onco E6）陽性、hrHPV16/18/45中高載量且E6蛋白（Onco E6）陰性組婦女較少，相對風險比較差異無統(tǒng)計學意義（表4）。

表2 不同轉(zhuǎn)歸組基線篩查結(jié)果分布

表3 基線篩查結(jié)果對病理進展預測作用的單因素分析

圖1 婦女不同篩查結(jié)果進展至CIN2+的絕對風險

表4 hrHPV16/18/45載量聯(lián)合E6蛋白對病理進展的預測作用

3 討論

hrHPV DNA檢測靈敏度較高，在國際上已廣泛作為篩查宮頸癌的方法，但其特異度和陽性預測值較低。宮頸癌的自然史表明，CIN1人群中僅約10%進展至CIN2+，而大部分將逆轉(zhuǎn)至正?；蚓S持CIN1。目前影響婦女hrHPV陽性和CIN1進展的因素尚不明確。國內(nèi)外開展了多項研究，探索hrHPV分型、P16（INK4A）、宿主基因甲基化等對宮頸病變進展的預測作用［5-6］。本研究基于大樣本的宮頸癌篩查前瞻性隊列結(jié)果顯示，hrHPV中高載量、hrHPV16/18/45分型以及E6蛋白對婦女hrHPV陽性和CIN1的病理進展具有良好的預測作用，特別是hrHPV16/18/45中高載量且E6蛋白陽性的婦女，近1/3者1年內(nèi)發(fā)生進展。

hrHPV病毒載量與宮頸癌的關(guān)系仍存在爭議。研究顯示，hrHPV高載量者與hrHPV清除呈負相關(guān)，與CIN2+的發(fā)生呈正相關(guān)，隨著宮頸病變的進展，hrHPV DNA載量逐漸增加［7］。但hrHPV病毒載量與宮頸癌之間的關(guān)系仍存在爭議［8］。一項納入38個研究的Meta分析顯示，hrHPV陽性的CIN1婦女進展的風險為hrHPV陰性者的3.0倍（95%CI為2.4～3.8）［9］。在印度開展的一項大規(guī)模宮頸癌篩查研究發(fā)現(xiàn)，hrHPV陽性且病理結(jié)果為正?；駽IN1婦女中，平均隨訪時間為2.01年，hrHPV DNA中高載量者進展的風險是低載量的1.9～2.4倍［10］。在我國開展的一項以人群為基礎(chǔ)的宮頸癌篩查隊列發(fā)現(xiàn)，在病理結(jié)果為正?；駽IN1婦女中，1.3%hrHPV低載量者以及11%左右的中高載量者，6年后進展至CIN2+［11］。本研究也發(fā)現(xiàn)，中高載量對宮頸病變進展的預測作用的具體結(jié)果之間的不同主要由隨訪時間和檢測方法不同導致。

不同型別的hrHPV致癌風險不同，hrHPV16、18和45是宮頸癌中最常見的3種高危型別，世界范圍內(nèi)約75%宮頸癌是由這3種型別引起。尤其是hrH?PV16與宮頸癌的病因?qū)W關(guān)系最為密切。我國的一項研究發(fā)現(xiàn)，hrHPV16陽性婦女10年發(fā)生CIN2+的累積風險高達47.5%［12］。近期我國的一項研究也發(fā)現(xiàn)，hrHPV16/18基因分型對于CIN1的進展具有預測作用，2年內(nèi)hrHPV陽性婦女發(fā)生CIN1進展的風險是陰性者的2.7倍［13］。國內(nèi)學者從分流hrHPV陽性人群臨床效果的角度，發(fā)現(xiàn)hrHPV16/18/45分型可以顯著降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率，提高陽性預測值。本研究從預測宮頸病變進展風險的角度也證明了hrHPV16/18/45分型在宮頸癌篩查中的作用。

E6蛋白作為hrHPV致癌的主要分子，通過E6-AP介導，結(jié)合并降解p53，使其喪失抑癌作用從而導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，hrHPV16/18/45型E6蛋白陽性者，近1/5短期內(nèi)進展至CIN2+。我國開展的一項隊列研究發(fā)現(xiàn)，hrHPV16/18型E6蛋白陽性婦女10年發(fā)生CIN3+的累計風險高達53.0%［15］。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，hrHPV16/18/45型的中高載量且E6蛋白陽性的婦女，近1/3者1年內(nèi)發(fā)生進展。本研究僅檢測了hrHPV16/18/45三種型別的hrHPV病毒載量聯(lián)合其E6蛋白的預測作用，隨著多價hrHPV E6蛋白檢測技術(shù)的發(fā)展與成熟，未來將更加全面地探討hrHPV病毒載量和E6蛋白在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的協(xié)同作用。

綜上所述，本研究基于前瞻性的隊列研究，首次從hrHPV DNA聯(lián)合E6蛋白層面，探討對宮頸癌前病變進展具有預測作用的生物學標志物，研究發(fā)現(xiàn)hrHPV DNA中高載量、hrHPV16/18/45分型以及E6蛋白可以作為婦女hrHPV陽性和CIN1進展的生物學標志物，但本研究主要局限性在于隨訪時間僅為1年，需更長隨訪時間的隊列研究以進一步驗證。此外，careHPV16/18/45和E6蛋白檢測簡單、快速、成本低，適宜在資源缺乏地區(qū)推廣應(yīng)用，對于改善資源缺乏地區(qū)宮頸癌的篩查具有重要的現(xiàn)實意義。