母胎亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T多態(tài)性與不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究

李乾，常亮，劉平，劉娟，路建波,高華方，馬旭

(1.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所國(guó)家人類(lèi)遺傳資源中心，北京 100081；2.北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，北京 100191)

習(xí)慣性流產(chǎn)(recurrent pregnancy loss，RPL)是指2次或2次以上的自然流產(chǎn)(約70%孕期不滿(mǎn)12周流產(chǎn))，國(guó)際上多稱(chēng)之為復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)，臨床發(fā)病率約2%～5%[1]。RPL發(fā)生的病因非常復(fù)雜，大致包括遺傳因素[2]、自身免疫[3]、組織結(jié)構(gòu)因素[4]、感染因素[5]、內(nèi)分泌因素[6]和其他因素[7]，但仍然有50%～70%的RPL患者無(wú)法明確原因[8]，稱(chēng)為不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)(unexplained recurrent pregnancy loss，URPL)。研究表明亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T基因多態(tài)性通過(guò)影響血清同型半胱氨酸(Hcy)水平及DNA甲基化而造成URPL[9]，但還存在一定的爭(zhēng)議[10]。本研究擬納入U(xiǎn)RPL及有正常妊娠史的女性及胎兒，探究母體及胎兒自身MTHFR基因C677T多態(tài)性與URPL的相關(guān)性。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2014年12月至2016年12月在北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心就診的URPL患者100名為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≤40歲、流產(chǎn)史≥2次；排除標(biāo)準(zhǔn)：染色體異常、抗核抗體陽(yáng)性、妊娠高血壓、糖尿病史、抗心磷脂抗體陽(yáng)性、甲狀腺功能異常、生殖系統(tǒng)解剖畸形、五種胎兒致畸病毒(TORCH)感染陽(yáng)性、配偶生殖功能異常等患有明確引起流產(chǎn)的疾病。同時(shí)，100名URPL患者中收集到了配對(duì)的70例流產(chǎn)胎兒絨毛組織(均為9～13周內(nèi)，胚胎發(fā)育停滯，行清宮術(shù)取樣)。另征集100名有正常妊娠史的健康志愿者作為對(duì)照組，其中70例有胎兒臍帶血樣本。

本研究開(kāi)始前經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(編號(hào)2015SZ-025)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

二、研究方法

1.樣本采集：(1)病例組樣本采集：胚胎發(fā)育停滯患者，行常規(guī)負(fù)壓吸引清宮術(shù)，無(wú)菌條件下留取絨毛組織2 cm×2 cm，生理鹽水充分漂洗，放入無(wú)菌器皿中；同時(shí)抽取患者外周靜脈血2 ml，枸緣酸鈉抗凝管-80℃保存。(2)對(duì)照組樣本采集：胎兒娩出后，常規(guī)斷臍，臍靜脈穿刺取臍帶血，本研究留臍帶血2 ml，枸緣酸鈉抗凝管-80℃保存；同時(shí)抽取產(chǎn)婦外周靜脈血2 ml，枸緣酸鈉抗凝管-80℃保存。

2.基因分型檢測(cè)方法：基因檢測(cè)采用BaiO?核酸提取試劑(上海百澳科技)提取血液及絨毛組織基因組DNA，采用BaiO?MTHFR(C677T)基因檢測(cè)試劑盒[上海百澳科技，PCR-芯片雜交法國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2012第3401329號(hào)]檢測(cè)MTHFRC677T 基因多態(tài)性位點(diǎn)，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。血樣本加蛋白酶K短暫離心，加入200 μl緩沖液BL，500 r/min低速離心15 s，裂解細(xì)胞，活化吸附柱后轉(zhuǎn)移至吸附柱中，洗脫獲得DNA。PCR擴(kuò)增時(shí)向擴(kuò)增液中各加入1 μl反應(yīng)液(冰上操作)。向擴(kuò)增液中加入2 μl對(duì)應(yīng)樣本的模板DNA(冰上操作)，低速離心混勻。運(yùn)行擴(kuò)增程序：50℃ 5 min，94℃5 min，(94℃ 25 s，56℃ 25 s，72℃ 25 s)，72℃5 min。最后芯片雜交顯色。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)包進(jìn)行兩組間基因型、等位基因頻率進(jìn)行分析。URPL病例組與對(duì)照組兩組間等位基因頻率采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析；兩組間母體-胎兒同時(shí)攜帶T等位基因頻率采用Fisher精確檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、URPL病例組與對(duì)照組MTHFR C677T位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較

基因型頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示，對(duì)照組C/C基因型頻率顯著高于病例組C/C基因型頻率(P<0.05)，兩組C/T基因型頻率比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；病例組T/T基因型頻率顯著高于對(duì)照組T/T基因型頻率(P<0.05)；另外病例組等位基因T頻率顯著高于對(duì)照組基因T頻率，且病例組中等位基因T頻率顯著高于基因C頻率，而對(duì)照組等位基因C頻率顯著高于病例組基因C頻率(P<0.05)(表1)。

表1 URPL病例組和對(duì)照組MTHFR C677T基因型頻率及等位基因頻率比較結(jié)果[n(%)]

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

二、URPL病例組與對(duì)照組配對(duì)母體-胎兒同時(shí)攜帶MTHFR 677位T等位基因比較

URPL病例組配對(duì)的母親和胎兒至少有一個(gè)為C/C基因型的配對(duì)組有18對(duì)，頻率為25.7%；配對(duì)的母親和胎兒同時(shí)攜帶T等位基因(即基因型C/T或T/T)的配對(duì)組有52對(duì)，頻率為74.3%。對(duì)照組配對(duì)的母親和胎兒至少有一個(gè)為C/C基因型的配對(duì)組有33對(duì)，頻率為47.1%；配對(duì)的母親和胎兒同時(shí)攜帶T等位基因(即基因型C/T或T/T)的配對(duì)組有37對(duì)，頻率為52.9%。病例組和對(duì)照組配對(duì)的母親和胎兒同時(shí)攜帶T等位基因的頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher精確檢驗(yàn)，P=0.014)，病例組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表2)。

表2 URPL病例組和對(duì)照組母體-胎兒同時(shí)攜帶MTHFR 677位T等位基因頻率比較結(jié)果[n(%)]

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

討 論

流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生率約占全部妊娠的2%～5%[1]。除明確的遺傳因素、自身免疫、組織結(jié)構(gòu)因素內(nèi)分泌因素和其他因素外，約有一半以上的患者發(fā)病原因仍然不明[11]。該疾病給家庭帶來(lái)巨大的精神壓力和經(jīng)濟(jì)壓力，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

既往研究發(fā)現(xiàn)MTHFRC677T多態(tài)性與URPL可能存在相關(guān)性[12-14]。MTHFR是葉酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵性的酶，對(duì)5，10-亞甲基四氫葉酸還原成為5-甲基四氫葉酸起催化作用。MTHFR基因677位等位基因C變?yōu)門(mén)會(huì)導(dǎo)致MTHFR酶耐熱性和活性下降甚至喪失，酶活性降低會(huì)導(dǎo)致5-甲基四氫葉酸合成減少，5-甲基四氫葉酸為Hcy提供一碳單位使其甲基化為甲硫氨酸，5-甲基四氫葉酸合成減少使Hcy不能甲基化為甲硫氨酸而造成Hcy堆積，導(dǎo)致血清Hcy水平升高[15-16]。Hcy具有細(xì)胞毒性可以使巰基氧化，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，損傷血管內(nèi)皮并增加血栓形成風(fēng)險(xiǎn)，影響子宮胎盤(pán)血流灌注，導(dǎo)致胚胎血液供給不足影響生長(zhǎng)發(fā)育從而使流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)升高[17]。另外，MTHFR酶活性降低影響甲硫氨酸合成效率，導(dǎo)致甲基供給異常，出現(xiàn)DNA甲基化不足和DNA合成障礙，胚胎發(fā)育期甲基化異常導(dǎo)致胚胎正常發(fā)育失敗，最終將導(dǎo)致出生缺陷或者胚胎停育[18-19]。

高Hcy血癥可能是URPL的風(fēng)險(xiǎn)因子之一，但由于本研究納入的URPL組中的部分患者已服用葉酸進(jìn)行治療，入組本研究時(shí)患者的血清Hcy水平已經(jīng)大幅度降低。此外，影響血清Hcy水平的因素很多，包括年齡、性別、BMI[20]、飲食中是否攝入含大量蛋氨酸的食物[21]等，Hcy一次的檢測(cè)結(jié)果難以反映患者妊娠時(shí)真實(shí)的水平。因此，本研究未將病例及對(duì)照Hcy水平納入研究，而是關(guān)注URPL組與對(duì)照組MTHFR基因 C677T位點(diǎn)基因分型，結(jié)果顯示URPL組中MTHFRC677T位點(diǎn)T等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，支持MTHFRC677T位點(diǎn)T等位基因是URPL的高風(fēng)險(xiǎn)因子。

目前，胎兒本身的MTHFRC677T等位基因是否與URPL相關(guān)的研究比較少見(jiàn)，曾有報(bào)道認(rèn)為夫妻配對(duì)研究可以間接地反映子代MTHFRC677T基因型，王亞文等[22]對(duì)32對(duì)有兩次及兩次以上URPL史的夫婦和39對(duì)健康夫婦進(jìn)行MTHFRC677T相關(guān)性研究，結(jié)論認(rèn)為子代攜帶MTHFR純合或雜合突變可能是胚胎早期發(fā)育異常的原因之一，從而導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。顧瑩等[23]對(duì)URPL組和對(duì)照組各50對(duì)夫婦的外周血進(jìn)行MTHFRC677T的位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)分析本研究結(jié)果顯示，夫婦雙方T等位基因頻率在URPL組顯著升高。本研究直接檢測(cè)與母體配對(duì)的流產(chǎn)胎兒組織樣本，分析結(jié)果顯示配對(duì)的母體和胎兒均攜帶T等位基因時(shí)，URPL風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步升高。推測(cè)其原因，一方面母親攜帶T等位基因，自身MTHFR酶活性降低，易發(fā)生Hcy堆積而使胎盤(pán)形成血栓風(fēng)險(xiǎn)升高，影響胚胎血液供給；另一方面胎兒自身攜帶T等位基因時(shí)，高Hcy產(chǎn)生細(xì)胞毒性，激發(fā)某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和控制系統(tǒng)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，影響胚胎早期重要的心臟、神經(jīng)系統(tǒng)等的發(fā)育。因此，母體和胎兒均同時(shí)帶T等位基因增加了URPL風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步推測(cè)，對(duì)于夫妻雙方均攜帶有T等位基因時(shí)，鑒于其遺傳給胎兒的幾率較大，因此應(yīng)該密切關(guān)注其可能流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究的結(jié)果顯示MTHFR677位 T等位基因是URPL的風(fēng)險(xiǎn)因素之一，為MTHFRC677T基因型與URPL相關(guān)性研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和資料積累。但是，本研究URPL病例組和對(duì)照組樣本數(shù)量較少，日后還需要積累更多樣本量繼續(xù)驗(yàn)證工作。本研究的結(jié)果提示對(duì)于無(wú)法尋找出原因的習(xí)慣性流產(chǎn)患者，建議進(jìn)行MTHFRC677T基因型的篩查，同時(shí)，如果有條件獲取胎兒MTHFRC677T基因型時(shí)，應(yīng)該密切關(guān)注母胎均攜帶MTHFR677位T等位基因的孕婦流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，并后續(xù)有針對(duì)性地進(jìn)行預(yù)防和治療。