日本血吸蟲ELAV-like 2基因的克隆、表達(dá)及功能分析

張媛媛，許 蓉，何川川，李肖純，程貴鳳，郭 露，劉金明，李 浩，古少鵬，金亞美*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；3.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200233)

ELAV-like(embryonic lethal abnormal vision like)蛋白家族是一類mRNA結(jié)合蛋白，含有3個(gè)高度保守的RNA識(shí)別基序(RRM)，存在于多種生物體中，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持起重要作用，且多項(xiàng)研究表明，RRM RNA結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過(guò)程中起重要作用，在人和其他多種生物中其表達(dá)量變化或突變會(huì)引起發(fā)育異?；?qū)е律窠?jīng)性自身免疫病的發(fā)生[1-4]。ELAV在果蠅中首次克隆獲得，因其表達(dá)改變致果蠅視神經(jīng)發(fā)育異常并于胚胎期死亡而得名[5-6]。ELAV-like蛋白家族有ELAV-like 1、ELAV-like 2、ELAV-like 3和ELAV-like 4四個(gè)成員，其中ELAV-like 1在各組織廣泛表達(dá)，ELAV-like 3和ELAV-like 4作為自身抗原在多系統(tǒng)神經(jīng)障礙腫瘤性腦病中被發(fā)現(xiàn)[7-8]，ELAV-like 2蛋白不僅在多種物種的神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，在小鼠的生殖腺及非洲爪蟾的睪丸、卵巢和早期胚胎中也有特異性表達(dá)[9-12]，且研究表明，小鼠在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期間，ELAV-like 2過(guò)早降低會(huì)導(dǎo)致成熟卵母細(xì)胞減數(shù)分裂效益低下[13-14]。

血吸蟲雌雄異體，只有與雄蟲合抱方能引發(fā)雌蟲的性成熟和產(chǎn)卵，成熟雌蟲所產(chǎn)蟲卵沉積于肝，造成宿主的病理?yè)p害，排出體外造成疾病再傳播。單性感染的雌蟲生長(zhǎng)緩慢，處于生殖系統(tǒng)發(fā)育阻遏狀態(tài)，卵黃腺和卵巢不能發(fā)育成熟、不能正常產(chǎn)卵；而經(jīng)兩性感染達(dá)到性成熟的雌蟲一旦與合抱雄蟲分開，蟲體也會(huì)逐漸變小，性器官退化，回到發(fā)育不完善的發(fā)育阻遏狀態(tài)[15-17]，這表明從控制雌蟲的生殖發(fā)育入手控制血吸蟲病傳播與發(fā)生有著重要的理論意義。本實(shí)驗(yàn)室前期分析正常發(fā)育雌蟲與發(fā)育阻遏雌蟲轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異時(shí)發(fā)現(xiàn)一條在發(fā)育阻遏雌蟲中高表達(dá)的基因，序列分析發(fā)現(xiàn)其編碼的氨基酸序列與ELAV-like 2同源，是一種mRNA結(jié)合蛋白，與果蠅的Sex-lethal(Sxl)蛋白也有一定的同源性，同屬于RRM RNA結(jié)合蛋白[18-20]。而Sxl是果蠅性別發(fā)育決定的調(diào)節(jié)開關(guān)，與果蠅的性別決定和維持有很大的關(guān)系[21]。且ELAV-like 2與Sxl基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控機(jī)制及其相似[22]，由此可推測(cè)，SjELAV-like 2在血吸蟲的生長(zhǎng)發(fā)育中應(yīng)也有同樣重要的功能。

本研究在前期基礎(chǔ)上通過(guò)5′-RACE和3′-RACE獲得了SjELAV-like2基因的全長(zhǎng)，克隆表達(dá)了該基因，分析了該基因在感染后不同時(shí)間、不同性別及不同狀態(tài)血吸蟲體內(nèi)的表達(dá)情況，對(duì)該蛋白在血吸蟲成蟲雌蟲體內(nèi)的分布進(jìn)行了定位，并利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)對(duì)該基因功能進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 日本血吸蟲中國(guó)大陸株尾蚴由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所血吸蟲病研究室提供；BALB/c小鼠(6周齡，雄性)，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 ExTaqHS、dNTP (2.5 mmol·L-1)、PrimeScriptRTreagent Kit with gDNA Eraser、SYBR premix ExTaqTM試劑盒、pGEM T-easy載體、SMARTer?RACE 5′/3′Kit、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4 DNA Ligase均購(gòu)于TaKaRa公司；Trizol、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)于Sigma公司；核酸回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色液、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG均購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；硝酸纖維素膜(Whatman)購(gòu)于北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)、DH5α購(gòu)于上海翊圣生物科技有限公司；pET28a、IPTG由本實(shí)驗(yàn)室保存；PCR引物合成及測(cè)序由上海英駿生物科技有限公司完成；dsRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)公司合成。

PCR儀(DNA Thermal Cycler480，美國(guó)PERKIN ELMER)；凝膠成像分析儀(ImageQuant 300，美國(guó)GE)；超聲波細(xì)胞破碎儀(VCX-130，美國(guó)SONICS)；ABi 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABi)；高壓蒸汽滅菌鍋(MLS-3780，美國(guó)Thermo Scientific)；掃描電鏡(JSM-6380LV，日本)；恒溫振蕩器(SYK-2012C，上海蘇坤)；光學(xué)顯微鏡(Eclipse80)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染 采用腹部貼片法感染6周齡雄性BALB/c小鼠，分別于感染7、14、18、21、25、28、35、42 d后剖殺，以肝門靜脈灌注法收集蟲體；并分別收集18、21、25、28、35、42 d曾合抱的雌蟲和雄蟲，同時(shí)收集單性感染而來(lái)的25 d發(fā)育阻遏雌蟲與兩性感染而來(lái)的曾與雄蟲合抱的25 d正常發(fā)育雌蟲，液氮凍存?zhèn)溆?。所有?dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的動(dòng)物使用協(xié)議，批準(zhǔn)號(hào)為SYXK(滬)2016-0010。

1.2.2SjELAV-like2基因的獲得和序列分析 根據(jù)前期發(fā)現(xiàn)的SjELAV-like2基因的部分序列(GenBank登錄號(hào)為FN330875.1)，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)5′-RACE和3′-RACE引物。5′-RACE引物：GSP1(5′-ATCCGTGACCGCAACAGTGGA-3′)，GSP2(5′-CAACATCGATTACGGATGC-3′)；3′-RACE引物：GSP3(5′-TGACAAAGTCGCCCTTGCAG-3′)，GSP4(5′-CGCGTCCAAACTGTCCGAA-3′)。TRIzol?法抽提日本血吸蟲總RNA，分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定；采用Fermentas RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，根據(jù)SMARTer?RACE 5′/3′Kit說(shuō)明書進(jìn)行5′和3′末端的擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收連接到pGEM T-easy載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，挑選單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒送上海英駿生物科技有限公司測(cè)序。通過(guò)BLAST搜索到ELAV-like2基因在埃及血吸蟲(Schistosomahaematobium，XP 012796928.1)、曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni，XP 018649930.1)和人類(Humans，BAD92531.1)的同源基因序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)分析。

1.2.3SjELAV-like2基因的克隆和表達(dá) 根據(jù)上面獲得的基因序列設(shè)計(jì)引物，以日本血吸蟲成蟲cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物(5′-CGCGGATCCACTGCAGAAATGGTTGTATATC-3′，下劃線處為BamHⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物(5′-GGGAAGCTTTAACCTTGACATAGTTTGTACG-3′，下劃線為HindⅢ酶切位點(diǎn))。分別用BamHⅠ和HindⅢ對(duì)PCR產(chǎn)物及pET28a雙酶切并用T4 DNA Ligase連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆采用菌液PCR鑒定和序列測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的重組克隆pET28-SjELAV-like 2接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃、250 r·min-1振蕩培養(yǎng)，OD600 nm達(dá)0.6～0.8 h，加入IPTG至終濃度1 mmol·L-1誘導(dǎo)表達(dá)，并用質(zhì)譜鑒定所表達(dá)特異條帶(質(zhì)譜鑒定由上海厚基生物科技有限公司完成)。為確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間，在IPTG誘導(dǎo)0、1、2、3、4、6和8 h時(shí)收集菌液。同時(shí)以SDS-PAGE凝膠電泳分析經(jīng)超聲波裂解后的菌體蛋白，判定其表達(dá)狀況。將以包涵體形式存在的重組蛋白(rSjELAV-like 2)溶解于8 mol·L-1尿素。

1.2.4 感染后不同時(shí)間血吸蟲體內(nèi)SjELAV-like2基因的擴(kuò)增 以18、25、28、35、42 d血吸蟲蟲體cDNA為模板，擴(kuò)增SjELAV-like2全長(zhǎng)ORF的上、下游引物進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；然后94 ℃ 30 s+59 ℃ 55 s+72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物連接到T-克隆載體中，轉(zhuǎn)化DH5α菌株，陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.5 rSjELAV-like 2的純化 取500 μL上文中“1.2.3”制備的溶解于8 mol·L-1尿素的重組蛋白，不插樣品梳直接上樣，按照常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE。電泳畢，將卸下的膠放入一干凈平皿中，用適量的0.3 mol·L-1KCl溶液染色5 min后，切下染成銀白色的目的條帶，加入液氮研磨，將碾碎的粉末置于2 mL EP管中加入適量6 mol·L-1尿素37 ℃水浴1～2 h，然后12 000 r·min-1離心1 h，取上清。SDS-PAGE凝膠電泳驗(yàn)證純化的重組蛋白。

1.2.6 rSjELAV-like 2重組蛋白多克隆抗體的制備及Western blotting檢測(cè) 在純化的重組蛋白中加入佐劑(首免采用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫采用弗氏不完全佐劑)，采用皮下注射方法每只小鼠注射50 μg rSjELAV-like 2，每隔兩周免疫一次，共免疫三次。在第三次免疫后一周，對(duì)小鼠眼眶靜脈采血，制備抗rSjELAV-like 2的特異性血清。提取全蟲蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上，用抗rSjELAV-like 2血清作一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，以沉淀性DAB顯色液作為底物進(jìn)行顯色。

1.2.7 間接免疫組化 間接免疫組化步驟[23]簡(jiǎn)述如下：將石蠟切片(8 μm)脫蠟水化，切片置于枸櫞酸中加熱煮沸修復(fù)，冷卻至室溫后加3% H2O2室溫封閉15 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，以小鼠抗rSjELAV-like 2特異性血清為一抗，未處理正常小鼠血清作對(duì)照(抗體1∶100稀釋)，4 ℃過(guò)夜，37 ℃復(fù)溫45 min，滴加HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗(1∶1 000稀釋)37 ℃孵育20 min，DAB顯色，Harris蘇木素，封片，鏡檢。

1.2.8 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè) 分別提取感染后不同時(shí)間、不同性別及不同狀態(tài)血吸蟲蟲體總RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA；按照SYBR?Premix ExTaqTMⅡ說(shuō)明書，采用熒光染料法進(jìn)行RT-qPCR。擴(kuò)增SjELAV-like2的引物：上游引物(5′-CATCAGTCGGCACCATC-3′)，下游引物(5′-TCGCCCTTGCAGTTTAG-3′)，擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度為182 bp，引物使用濃度為10 pmol。擴(kuò)增Tublin引物：上游引物(5′-ACCTCAACAACCACCACC-3′)，下游引物(5′-TTGCGGCTTCTGCTCTTC-3′)，擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度為234 bp，引物使用濃度為10 pmol，每個(gè)反應(yīng)均做3孔重復(fù)。應(yīng)用Applied Biosystems 7500軟件進(jìn)行計(jì)算分析，以日本血吸蟲Tublin基因作為內(nèi)參，得出相對(duì)于每百萬(wàn)持家基因的目的基因含量。

1.2.9 RNAi試驗(yàn)

1.2.9.1 siRNA的篩選：根據(jù)SjELAV-like2基因序列，設(shè)計(jì)三對(duì)siRNA及一對(duì)無(wú)關(guān)對(duì)照siRNA(NC)，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成(表1)。15只BALB/c小鼠，分為5組，S1、S2、S3、PBS和NC組，按“1.2.1”的方法感染小鼠，于感染后22 d尾靜脈注射1 OD S1、S2、S3、NC或等體積的PBS。48 h后剖殺小鼠，肝門靜脈灌注法收集蟲體，提取各組蟲體總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板，利用RT-qPCR檢測(cè)受干擾蟲體SjELAV-like2基因的表達(dá)情況，并據(jù)此判斷干擾效果[24]。

表1小干擾RNA序列

Table1ThesequencesofsmallinterferingRNA

序列名Name序列 Sequence正義 Sense反義 Anti-senseS1 siRNA5'-GCGUUAUUCAAUGCCGCAUTT-3'5'-AUGCGGCAUUGAAUAACGCTT-3'S2 siRNA5'-GCUACAGUCCAACCACAAATT-3'5'-UUUGUGGUUGGACUGUAGGTT-3'S3 siRNA5'-GCUACUUGACUCCCUACUUTT-3'5'-AAGUAGGGAGUCAAGUAGCTT-3'NC siRNA5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'

1.2.9.2 siRNA長(zhǎng)期干擾：12只BALB/c小鼠，分為3組，每組4只小鼠。于感染后第4天，選擇干擾效果最佳的siRNA，小鼠尾靜脈注射siRNA、PBS或NC,每4 d干擾一次，共干擾10次，42 d時(shí)收集蟲體并計(jì)數(shù)，RT-qPCR檢測(cè)干擾效果。

1.2.9.3 肝蟲卵計(jì)數(shù)：收集肝并稱重，加入PBS勻漿機(jī)混勻后，定容至20 mL，取1 mL肝勻漿液，加入等體積10% NaOH，56 ℃水浴鍋中消化2 h，消化完全后混勻取50 μL樣品，鏡檢計(jì)數(shù)蟲卵，重復(fù)三次，計(jì)算減卵率。

減卵率=(1-試驗(yàn)組卵胚數(shù)目/對(duì)照組卵胚數(shù)目)×100%。

1.2.9.4 毛蚴計(jì)數(shù)：取4 mL肝勻漿液于細(xì)頸平底燒瓶中，加入去氯水，并用一薄層棉花覆蓋在液面下5 cm處，28 ℃孵化6 h后收集棉花上層清液，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入50 μL碘酊染液固定毛蚴，4 000×g離心5 min，吸去上清，定容至2 mL，混勻后取100 μL樣品，鏡檢計(jì)數(shù)毛蚴，重復(fù)三次，計(jì)算減孵化率。

減孵化率=(對(duì)照組平均孵化率-處理組平均孵化率)/對(duì)照組平均孵化率×100%。

1.2.9.5 掃描電鏡(SEM)觀察:將長(zhǎng)期干擾試驗(yàn)中收集的蟲體用PBS洗滌后，4 ℃置于4%戊二醛中固定24 h。固定好的樣品經(jīng)0.1 mol·L-1PBS漂洗6次(5 min·次-1)，0.5%鋨酸室溫固定1 h，30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇分別脫水20 min，100%乙醇脫水2次(20 min·次-1)，真空干燥，離子濺射儀噴金后，使用JEOJ ISM-6380LV掃描電鏡觀察并拍照[25]。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用GraphPad Prism 5 software(GraphPad software Inc，CA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組的差異性分析用t-test進(jìn)行檢驗(yàn)；P-values小于等于0.01或0.001分別視為差異顯著和極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 SjELAV-like 2基因序列全長(zhǎng)的獲得及序列分析

利用RACE技術(shù)對(duì)已知的部分血吸蟲SjELAV-like2基因片段進(jìn)行5′和3′末端擴(kuò)增，將產(chǎn)物測(cè)序后拼接獲得序列全長(zhǎng)并提交到GenBank，登錄號(hào)為MG515726。該基因長(zhǎng)度為1 894 bp，其開放閱讀框長(zhǎng)度為1 635 bp，共編碼544個(gè)氨基酸，所編碼蛋白分子量大小為60.3 ku。將其與埃及血吸蟲、曼氏血吸蟲和人的ELAV-like2基因進(jìn)行對(duì)比(圖1)，其氨基酸序列的同源性分別為82%、88%和37%。

2.2 SjELAV-like 2基因的克隆、表達(dá)及蛋白純化

以日本血吸蟲成蟲cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得含完整開放閱讀框的編碼區(qū)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28-SjELAV-like 2，并在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)融合蛋白rSjELAV-like 2(融合蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定無(wú)誤)，其相對(duì)分子質(zhì)量大小與預(yù)期結(jié)果相符，合并His-tag后相對(duì)分子質(zhì)量為64.2 ku(圖2)；IPTG誘導(dǎo)4 h時(shí)表達(dá)量達(dá)最高，且以包涵體形式存在(圖2)。經(jīng)純化后，得到條帶單一的rSjELAV-like 2目的蛋白(圖3)。

2.3 感染后不同時(shí)間收集蟲體SjELAV-like 2基因的擴(kuò)增

以感染后18、25、28、35、42 d日本血吸蟲cDNA為模板，PCR擴(kuò)增SjELAV-like2基因，電泳結(jié)果顯示不同時(shí)間段cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物大小相同(圖4)，將PCR產(chǎn)物連接到T-克隆載體，對(duì)陽(yáng)性克隆的測(cè)序分析也說(shuō)明不同時(shí)間段cDNA擴(kuò)增的SjELAV-like2基因產(chǎn)物相同，表明該基因在血吸蟲體內(nèi)轉(zhuǎn)錄時(shí)剪切方式一致。

2.4 SjELAV-like 2反應(yīng)原性分析

用純化后的rSjELAV-like 2重組蛋白免疫小鼠獲得小鼠抗rSjELAV-like 2的特異性血清。將日本血吸蟲全蟲可溶性抗原經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離，經(jīng)電轉(zhuǎn)移至NC膜上，用小鼠抗rSjELAV-like 2蛋白的特異性血清作為一抗進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果有三條條帶，條帶a、c在Marker和空白孔均存在，特異性條帶b僅存在于樣品孔(圖5)。將三條條帶對(duì)應(yīng)位置的蛋白膠條進(jìn)行LC-MSMS(Q-excative Orbitraq,Thermo)質(zhì)譜檢測(cè)，結(jié)果表明僅特異性條帶b對(duì)應(yīng)位置膠條可以檢測(cè)到目的蛋白(質(zhì)譜檢測(cè)mascot查庫(kù)得分23.24)，在Marker孔、樣品孔和空白孔出現(xiàn)非特異性條帶a、c可能是由于制備特異性血清的rSjELAV-like 2蛋白抗原由切膠法純化而來(lái)，其中可能含有某些可刺激產(chǎn)生抗體的物質(zhì)。Western blotting結(jié)果表明SjELAV-like 2具有良好的反應(yīng)原性。

2.5 SjELAV-like 2蛋白在血吸蟲成蟲雌蟲體中的定位

利用免疫組化的方法，以小鼠抗rSjELAV-like 2特異性血清為一抗，未感染血吸蟲的小鼠陰性血清作為對(duì)照，定位SjELAV-like 2在血吸蟲成蟲雌蟲體內(nèi)的表達(dá)，光學(xué)顯微鏡檢測(cè)顯示其在日本血吸成蟲雌蟲體被成簇狀排列，體內(nèi)結(jié)構(gòu)中散在分布(圖6)。

2.6 SjELAV-like 2在感染后不同時(shí)間、不同性別及不同狀態(tài)血吸蟲差異表達(dá)分析

RT-qPCR分析結(jié)果表明，SjELAV-like2基因在日本血吸蟲童蟲中表達(dá)較高，其中以7 d童蟲表達(dá)量最高，之后逐漸下降，蟲體成熟后表達(dá)量趨于平穩(wěn)(圖7A)；通過(guò)分析其在合抱雌、雄蟲中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，SjELAV-like2在合抱雌蟲的表達(dá)量均顯著高于同時(shí)期合抱雄蟲，其在檢測(cè)的不同時(shí)期的合抱雄蟲中的表達(dá)量基本一致(圖7B)，說(shuō)明其期別表達(dá)差異(圖7A)應(yīng)主要來(lái)自雌蟲。我們也分析了SjELAV-like2在單性感染而來(lái)的25 d發(fā)育阻遏雌蟲與兩性感染而來(lái)的曾與雄蟲合抱的25 d正常發(fā)育雌蟲中表達(dá)差異(圖7C)，結(jié)果表明其在單性感染而來(lái)的雌蟲中高表達(dá)，這驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果。

SjELAV-like 2與埃及血吸蟲、曼氏血吸蟲和人類ELAV-like 2氨基酸序列比對(duì)，ELAV-like 2序列之間的相似性以顏色顯示DANMAN alignment of the derived amino acid sequences of ShELAV-like 2, SmELAV-like and HsELAV-like 2,the regions with high identity and similarity between ELAV-like 2 sequences are shown in colors圖1 SjELAV-like 2蛋白序列比對(duì)分析Fig.1 The comparision analysis of the protein sequence of SjELAV-like 2

2.7 siRNA干擾試驗(yàn)

收集SjELAV-like2 siRNA S1、S2、S3干擾組，NC無(wú)關(guān)對(duì)照組及PBS空白對(duì)照組蟲體，提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用RT-qPCR檢測(cè)分析siRNA S1、S2、S3對(duì)SjELAV-like2基因表達(dá)水平的干擾效果。結(jié)果顯示S1、S2、S3 siRNA均在一定程度上干擾了SjELAV-like2的表達(dá)，其中S1 siRNA的干擾效果最好，達(dá)79.1%(P=0.000 8)(圖8A)。選取S1 siRNA進(jìn)行體內(nèi)長(zhǎng)期干擾試驗(yàn)，從感染后第4天開始，每4 d干擾一次，共干擾10次，42 d時(shí)收集蟲體，利用RT-qPCR檢測(cè)干擾效果發(fā)現(xiàn)，干擾組與NC組相比，SjELAV-like2基因的表達(dá)下降達(dá)60%(P=0.006)(圖8B)。與NC組相比，干擾組減蟲率達(dá)28.57%(P=0.005)，小鼠肝減卵率達(dá)39.67%(P=0.006)，每只雌蟲肝蟲卵負(fù)荷的貢獻(xiàn)率下降17.74%(P=0.008)，蟲卵減孵化率達(dá)75.56%(P=0.004)(表2)。

M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～7.IPTG分別誘導(dǎo)時(shí)間0、1、2、3、4、6、8 h；8. pET28-SjELAV-like 2誘導(dǎo)上清；9. pET28-SjELAV-like 2誘導(dǎo)包涵體M. Protein molecular marker；1-7.Recombinant protein induced by IPTG with time 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8 h；8. Supernatant of induced pET28-SjELAV-like 2；9. Inclusion bobies of induced pET28-SjELAV-like 2圖2 重組蛋白rSjELAV-like 2的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.2 Detection of recombinant protein rSjELAV-like 2 by SDS-PAGE

M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 10 μL純化產(chǎn)物；2. 20 μL純化產(chǎn)物M. Protein molecular marker；1. 10 μL purified rSjELAV-like 2 protein；2. 20 μL purified rSjELAV-like 2 protein圖3 rSjELAV-like 2重組蛋白的純化產(chǎn)物Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified rSjELAV-like 2

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5. 分別以18、25、28、35、42 d 血吸蟲蟲體cDNA為模板的SjELAV-like 2基因擴(kuò)增產(chǎn)物M. DL2000 DNA marker；1-5. Products of SjELAV-like 2 gene amplification with 18, 25, 28, 35, 42 d Schistosoma japonicum cDNA as template圖4 感染后不同時(shí)間血吸蟲SjELAV-like 2基因的PCR擴(kuò)增Fig.4 Amplification of SjELAV-like 2 gene by PCR in Schistosoma japonicum at different days after infection

M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 日本血吸蟲全蟲蛋白；2.空白對(duì)照M. Molecular mass marker；1. Soluble protein of Schistosoma japonicum；2. Blank control圖5 小鼠抗rSjELAV-like 2多抗與全蟲蛋白的Western blotting分析Fig.5 Western blotting analysis of anti-rSjELAV-like 2 polyclonal antibody

2.8 掃描電鏡觀察RNAi效果

利用掃描電鏡觀察S1 siRNA干擾組蟲體和NC組蟲體的體被形態(tài)變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，SjELAV-like2干擾組蟲體體被不同部位出現(xiàn)大量泡狀突出物(圖9)。

3 討 論

血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的，嚴(yán)重危害人畜健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大寄生蟲病，至今仍是一個(gè)需要重視的公共衛(wèi)生問(wèn)題[26]。目前對(duì)于血吸蟲病的治療主要應(yīng)用化學(xué)藥物，如吡喹酮，雖然藥物對(duì)感染血吸蟲的個(gè)體有治療效果，但是藥物治療不能解決重復(fù)感染問(wèn)題，也不能起到預(yù)防的目的[27]。血吸蟲成熟雌蟲所產(chǎn)蟲卵是造成宿主主要病理?yè)p害和疾病再傳播的根源，針對(duì)蟲卵在病理?yè)p害和疾病再傳播方面的關(guān)鍵作用，從控制血吸蟲生殖發(fā)育，防止血吸蟲產(chǎn)卵入手，將為研制高效抗血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育疫苗和藥物提供新思路。

A. 陰性血清為一抗；B.抗rSjELAV-like 2血清為一抗A. Negative serum as primary antibody; B.Anti-rSjELAV-like 2 serum as primary antibody圖6 免疫組化分析SjELAV-like 2蛋白在日本血吸蟲成蟲雌蟲體內(nèi)分布情況400×Fig.6 Immunohistochemical analysis of SjELAV-like 2 protein in vivo in adult females distribution of Schistosoma japonicum 400×

A. SjELAV-like 2在血吸蟲感染后不同時(shí)間蟲體的表達(dá)情況；B. SjELAV-like 2在血吸蟲不同性別蟲體的表達(dá)情況；C. SjELAV-like 2在血吸蟲不同狀態(tài)雌蟲的表達(dá)情況；7 d、14 d、18 d、21 d、25 d、28 d、35 d、42 d表示在感染不同時(shí)期收集的蟲體；25 dsf. 單性感染而來(lái)的25 d發(fā)育阻遏雌蟲；25 dmf. 兩性感染而來(lái)的曾與雄蟲合抱的25 d正常發(fā)育雌蟲A. Expression of SjELAV-like 2 at different days after infection of schistosoma japonicum; B. Expression of SjELAV-like 2 in different genders of Schistosoma japonicum; C. Expression of SjELAV-like 2 in different states of schistosoma females; 7 d, 14 d, 18 d, 21 d, 25 d, 28 d, 35 d, 42 d mean the parasites collected at different periods after infection; 25 dsf. 25 days under develop female worms from single-sex cercariae infected；25 dmf. 25 days normal developed female worms from double-sex cercariae infected圖7 Real-time PCR分析SjELAV-like 2在血吸蟲表達(dá)情況Fig.7 Real-time PCR analysis the expression of SjELAV-like 2 in schistosoma japonicum

本研究通過(guò)5′-RACE和3′-RACE獲得了在發(fā)育阻遏雌蟲高表達(dá)的SjELAV-like2基因序列全長(zhǎng)，并在原核系統(tǒng)中克隆和表達(dá)了該基因。反應(yīng)原性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)該天然蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量大于理論相對(duì)分子質(zhì)量，根據(jù)對(duì)感染后不同時(shí)間血吸蟲SjELAV-like2基因的擴(kuò)增及測(cè)序分析，我們認(rèn)為其不存在轉(zhuǎn)錄時(shí)外顯子的不同剪接模式，因此，出現(xiàn)這種情況可能是翻譯后修飾的結(jié)果。

日本血吸蟲在生長(zhǎng)發(fā)育到第15、16 天時(shí)開始合抱，第18天時(shí)合抱基本完成，合抱對(duì)雌蟲發(fā)育是非常重要的階段，合抱后雌蟲進(jìn)入正常生殖發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，SjELAV-like2在日本血吸蟲各個(gè)階段均有表達(dá)，在7 d時(shí)表達(dá)量最高，之后逐漸降低，蟲體成熟后表達(dá)量達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)；分析該基因在雌、雄蟲體中的表達(dá)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，SjELAV-like2在不同時(shí)間合抱雌蟲體內(nèi)的表達(dá)量均顯著高于同時(shí)期合抱雄蟲，且在18 d時(shí)表達(dá)量最高，18～21 d表達(dá)量明顯降低，之后其在雌蟲體內(nèi)的表達(dá)保持在相對(duì)穩(wěn)定的水平。分析其在感染后25 d正常發(fā)育雌蟲與發(fā)育阻遏雌蟲表達(dá)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)其在發(fā)育阻遏雌蟲的表達(dá)高于正常發(fā)育雌蟲，這也驗(yàn)證了我們轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果(未發(fā)表資料)。通過(guò)以上分析我們有理由認(rèn)為SjELAV-like2在期別分析中7和14 d時(shí)的高表達(dá)也主要來(lái)源于雌蟲。鑒于SjELAV-like2在血吸蟲感染后不同時(shí)間、不同狀態(tài)及不同性別的表達(dá)情況，我們認(rèn)為該基因及其產(chǎn)物對(duì)血吸蟲雌蟲的生殖發(fā)育有重要的影響，它的存在可能會(huì)抑制雌蟲的發(fā)育進(jìn)程。令人遺憾的是，免疫組化試驗(yàn)并未鑒定到該蛋白在血吸蟲生殖系統(tǒng)的特異表達(dá)，這可能與采用的切片來(lái)自于成熟時(shí)期蟲體有關(guān)，也可能該基因及其產(chǎn)物是血吸蟲雌蟲生殖發(fā)育的調(diào)控因子，而不是血吸蟲雌蟲生殖發(fā)育調(diào)控的結(jié)果。

A. 最佳干擾效果siRNA篩選；B. S1siRNA體內(nèi)長(zhǎng)期干擾；**. P<0.01，***. P<0.001A. Selection of siRNA with the best interference effect; B. Long-term interference by S1si RNA in vivo；**. P<0.01，***. P<0.001圖8 RT-qPCR檢測(cè)干擾效果Fig.8 Interference effects were detected by RT-qPCR

組別及減少率Group and reduction成蟲數(shù)Number of adults肝荷卵數(shù)/gThe number of liver charged eggs肝荷卵數(shù)/雌蟲The number of liver charged eggs in femal孵化率HatchabilityNC31.5±20.019 681±5 181 3 806±2 769 0.126 0±0.016 9S122.5±16.0**11 873±2 378**3 131±3 233**0.030 8±0.030 1**減少率/% % reduction28.5739.6717.7475.56

組間比較，**.P<0.01

Between the two groups，**.P<0.01

A～C. 日本血吸蟲正常狀態(tài)下體被表膜形態(tài)(箭頭所示：A.光面乳突；B.泡狀突出物；C.有蒂乳突)；D～F. SjELAV-like 2 siRNA干擾組蟲體表膜形態(tài)(箭頭所示：E、F.泡狀突出物)；放大倍數(shù)：A、D 3 000×，B、C、E、F 6 000×A-C. Morphology of Schistosoma japonicum in the control group (arrows indicate: A. Smooth mastoid; B. Vesicular protrusions; C. Pedicle mastoid process); D-F. Morphology of Schistosoma japonicum treated with SjELAV-like 2 siRNA (arrows indicate: E, F. Vesicular protrusions); Magnification: A, D 3 000×，B, C, E, F 6 000×圖9 掃描電鏡觀察RNA干擾后蟲體體被Fig.9 SEM analysis of worms tegument after RNAi

RNAi是利用與靶基因序列同源的雙鏈RNA引發(fā)生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后沉默，從而引起靶基因表達(dá)抑制的現(xiàn)象，因其特異性和高效性，被廣泛應(yīng)用于基因功能的分析[28]。本研究利用RNAi技術(shù)對(duì)SjELAV-like2基因功能進(jìn)行了初步研究，篩選出了干擾效果良好的S1 siRNA，進(jìn)行了體內(nèi)長(zhǎng)期RNAi試驗(yàn)。RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，干擾后SjELAV-like2的表達(dá)顯著降低，且干擾后肝減卵率和卵胚孵化率均顯著降低，初步說(shuō)明該基因?qū)θ毡狙x的生殖發(fā)育有重要影響。

通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，SjELAV-like2干擾組蟲體體被不同部位出現(xiàn)大量泡狀突出物。血吸蟲體被由一層合胞體細(xì)胞組成，血吸蟲不僅可通過(guò)體被吸收葡萄糖、脂類、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，體被外質(zhì)膜的更新還可以影響免疫細(xì)胞或宿主抗體的黏附，翻轉(zhuǎn)則有利于血吸蟲利用宿主抗原進(jìn)行偽裝，這與血吸蟲逃避免疫攻擊，在宿主體內(nèi)存活數(shù)十年有非常重要的關(guān)系。由此可見(jiàn)，血吸蟲的體被除攝取營(yíng)養(yǎng)外，還起著重要的防御機(jī)能[29]?；蚬δ苎芯堪l(fā)現(xiàn)，與NC組相比，SjELAV-like2干擾組減蟲率達(dá)28.57%，這可能與其體壁結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)攝取和防御功能的改變有關(guān)。

4 結(jié) 論

成功克隆、表達(dá)SjELAV-like2基因。RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)SjELAV-like2在日本血吸蟲童蟲中表達(dá)較高，且在合抱雌蟲的表達(dá)量均高于同時(shí)期合抱雄蟲。RNAi功能研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期持續(xù)干擾SjELAV-like2基因的表達(dá)，受干擾蟲體產(chǎn)卵能力和所產(chǎn)卵胚孵化能力都受到顯著的影響，說(shuō)明該基因與血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育有重要關(guān)系，為今后進(jìn)一步研究該基因?qū)θ毡狙x生長(zhǎng)發(fā)育的影響奠定了基礎(chǔ)。