兩株小鼠致病性差異顯著的H5N1禽流感病毒PA蛋白差異互作宿主蛋白研究

高 照，胡 嬌，劉秀梵*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

禽流感病毒(AIV)是一種能夠?qū)е录毙院粑到y(tǒng)疾病的病原體，它不但能夠感染禽類，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失；還能夠跨種傳播感染并致死哺乳動(dòng)物(包括人類)，給公共衛(wèi)生帶來(lái)極大威脅[1]。AIV是一種有包膜結(jié)構(gòu)的負(fù)鏈RNA病毒，其基因組包含8個(gè)RNA片段編碼至少17種病毒蛋白，包括10種最初鑒定的蛋白質(zhì)(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、NS2)和7種新發(fā)現(xiàn)的病毒蛋白PB1-F2、PB1-N40、PA-X、PA-N155、PA-N182、M42和NS3。PA蛋白是病毒RNA聚合酶復(fù)合物的第三個(gè)亞基，它在AIV的生命周期和發(fā)病機(jī)制中具有多重作用。PA蛋白的N-末端具有核酸內(nèi)切酶活性、帽結(jié)合和啟動(dòng)子結(jié)合的能力，從而影響病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[2]； PA蛋白的位點(diǎn)突變有助于AIV跨越宿主屏障、增強(qiáng)AIV的宿主適應(yīng)性[3-4]；此外，PA的關(guān)鍵位點(diǎn)能影響病毒的毒力[5-6]；并且PA蛋白與宿主蛋白的“shut-off”有關(guān)[7-8]。然而PA蛋白在AIV生命周期和發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮其作用的潛在機(jī)制在很大程度上仍是未知的。

流感病毒自身并不具有復(fù)制能力，感染宿主后必須借助宿主細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)制。許多研究已經(jīng)證實(shí)流感病毒依賴于宿主細(xì)胞蛋白來(lái)維持其生命周期和致病性[9-11]，而蛋白之間的相互作用是維持宿主和病毒之間聯(lián)系的關(guān)鍵方式，并且目前已經(jīng)鑒定出能與流感病毒PA蛋白相互作用的宿主因子。HAX1是一種具有抗凋亡功能的細(xì)胞質(zhì)蛋白，它能夠與PA的核定位信號(hào)域結(jié)合，在病毒感染的細(xì)胞中，HAX1可以阻止PA的核積累來(lái)抑制病毒復(fù)制，這表明HAX1-PA相互作用是宿主用來(lái)限制病毒感染的防御機(jī)制之一[12]。hCLE是與PA蛋白相互作用的另一個(gè)宿主因子，PA的兩個(gè)區(qū)域(氨基酸殘基493—512和557—574)被證實(shí)與hCLE相互作用[13]，在流感病毒感染期間，hCLE-PA相互作用能夠增加病毒聚合酶活性，促進(jìn)病毒RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，提高病毒滴度和病毒顆粒產(chǎn)生[14]。PA也與MCM復(fù)合體有相互作用，MCM復(fù)合體是病毒基因組復(fù)制的宿主調(diào)節(jié)劑[15]。此外，RanBP5[16]、AIFMI[17]、NPM[18]和RIG-I[19]等也被發(fā)現(xiàn)與PA相互作用并影響AIV的生命周期。然而，考慮到PA蛋白在流感病毒生命周期中的多重效應(yīng)，其他與PA蛋白相互作用的宿主因子仍需要被鑒定。

目前，雖然在禽流感病毒基因變異、蛋白結(jié)構(gòu)和功能等研究方面有了顯著進(jìn)展，但從病毒-宿主蛋白質(zhì)互作的角度解析禽流感病毒的致病機(jī)制及宿主拮抗流感病毒感染的機(jī)制研究依然較少。以禽流感病毒-宿主蛋白的相互作用為突破口，是解析禽流感病毒致病機(jī)制和宿主拮抗病毒感染機(jī)制的另一思路。本研究通過(guò)篩選與致病性差異的H5N1 AIV有相互作用的人類細(xì)胞蛋白，可能從宿主方面闡釋H5N1 AIV PA蛋白調(diào)控病毒生命周期及致病能力方面提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 毒株與細(xì)胞

本研究所用的主要由PA基因決定的致病性差異的一對(duì)模式病毒為本實(shí)驗(yàn)室分離保存，分別為對(duì)小鼠表現(xiàn)為高致病性的CK10病毒: A/Chicken/Jiangsu/k0402/2010(小鼠半數(shù)致死劑量為0.33 log10EID50)和對(duì)小鼠表現(xiàn)為低致病性的GS10病毒：A/Goose/Jiangsu/k0403/2010(小鼠半數(shù)致死劑量> 6.32 log10EID50)[20]。A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.2 免疫沉淀(IP)

提取細(xì)胞蛋白：將細(xì)胞上清棄去后，用預(yù)冷的PBS洗兩遍，然后將殘留PBS吸干，加入600 μL含濃度1 mmol·L-1PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液(碧云天)，冰上裂解，并用搖床輕輕搖晃20 min，使細(xì)胞徹底裂解，收集于指形管中，然后在4 ℃下12 000 r·min-1離心15 min，取上清備用。

蛋白質(zhì)與抗體結(jié)合：在獲得的細(xì)胞蛋白質(zhì)中加入總量為5 μL的PA兔多克隆抗體(GeneTex)，對(duì)照組則加入總量為5 μL的非特異性兔多克隆抗體(GeneTex)，試驗(yàn)組與對(duì)照組各三個(gè)重復(fù)，然后在4 ℃搖床輕搖過(guò)夜。

抗體與agarose結(jié)合：取30 μL Protein A+G agarose(Sigma)分別加入對(duì)照組與試驗(yàn)組的蛋白質(zhì)與抗體混合物中，4 ℃搖床輕搖5 h。

洗脫：將充分作用后的樣品以12 000 r·min-1瞬離，棄掉上清，加入預(yù)冷的PBS，輕輕顛倒混勻，12 000 r·min-1瞬離，棄上清，如此重復(fù)操作5次，最后用Glycline-HCl(pH = 3.0)洗脫，進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3 質(zhì)譜分析(LC-MS/MS)

溶液內(nèi)酶解：吸取已制備好的樣品(約30 μg)，加入30 μL STD buffer，沸水浴5 min，冷卻至室溫。加入200 μL UA buffer(8 mol·L-1Urea，150 mmol·L-1Tris-HCl pH8.5)混勻，轉(zhuǎn)入30 kDa超濾管離心。加入200 μL UA buffer離心，棄濾液。加入100 μL IAA(50 mmol·L-1IAA in UA)，振蕩1 min，避光室溫孵育30 min，離心。加入100 μL UA buffer，離心，重復(fù)2次。加入100 μL 25 mmol·L-1NH4HCO3，離心，重復(fù)2次。加入40 μL 25 mmol·L-1NH4HCO3同時(shí)加入Trypsin，酶切過(guò)夜后離心。再加入40 μL 25 nmol·L-1NH4HCO3，離心，酸化。

毛細(xì)管高效液相色譜方法：A液為0.1%甲酸的水溶液，B液為0.1%甲酸的乙腈水溶液(乙腈為84%)。色譜柱以95%的A液平衡后，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣至Trap柱。色譜梯度：0～50 min，A液線性梯度從4% 到50%；50～54 min，B液線性梯度從50%到100%；54～60 min，B液維持在100%。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集：多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描(full scan)后采集10個(gè)碎片圖譜(MS2 scan)。

數(shù)據(jù)分析：質(zhì)譜測(cè)試原始文件(raw file)用Mascot2.2軟件檢索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索參數(shù)如下，Database: uniprot Taxonomy，Human(145758)；Enzyme: Trypsin； Dynamical modifications: Oxidation (M)； Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)；Max Missed Cleavages: 2；ProteomicsTools: 3.1.6；Filter by score ≥20。

1.4 生物信息學(xué)分析軟件

GO注釋使用Database for Annotation Visualization and Integrated Discovery (DAVID) (版本 6.7)；細(xì)胞通路分析使用KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)分析。

1.5 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)

以1個(gè)MOI劑量的CK10和GS10病毒分別感染A549細(xì)胞，PBS感染作為對(duì)照。36 h后收集細(xì)胞蛋白，每個(gè)組分別使用PA與eEF1A1抗體進(jìn)行IP試驗(yàn)，所得免疫復(fù)合物用eEF1A1及PA抗體進(jìn)行Western blot試驗(yàn)進(jìn)行分析驗(yàn)證。

1.6 Western blot

樣品加入上樣緩沖液后沸水煮5 min變性，12% SDS-PAGE中電泳分離后，并將其轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，120 V轉(zhuǎn)印1 h。轉(zhuǎn)印完畢后，用5%脫脂奶37 ℃封閉1 h，用合適的抗體進(jìn)行孵育，室溫 2 h，隨后，將膜用含0.05% Tween-20的TBST洗滌4次，每次10 min，再用合適的酶標(biāo)二抗室溫孵育1 h，再次將膜用含0.05% Tween-20的TBST洗滌4次，最后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)印跡蛋白質(zhì)。

2 結(jié) 果

2.1 篩選與PA蛋白有相互作用的宿主細(xì)胞蛋白

為了有效地從AIV感染的細(xì)胞中鑒定與PA相互作用的宿主蛋白，測(cè)定了PA蛋白的峰值表達(dá)點(diǎn)。以1個(gè)MOI的劑量用CK10病毒感染A549細(xì)胞，在感染后12、24、36、48和60 h收獲細(xì)胞蛋白，然后用PA抗體進(jìn)行Western blot分析，同時(shí)以β-actin蛋白作為對(duì)照。結(jié)果表明，在CK10病毒感染A549過(guò)程中，PA表達(dá)水平逐漸升高，在感染后36 h左右達(dá)到最高[21]。因此，收集病毒感染細(xì)胞36 h后的細(xì)胞蛋白，并用PA抗體或作為對(duì)照的無(wú)關(guān)抗體進(jìn)行免疫沉淀；得到的蛋白復(fù)合物通過(guò)LC-MS / MS分析，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比(三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)中至少出現(xiàn)兩次的蛋白即視為存在相互作用)，檢測(cè)到278種與CK10病毒PA蛋白特異性沉淀的宿主細(xì)胞蛋白，287種與GS10病毒PA蛋白特異性沉淀的宿主細(xì)胞蛋白。而與GS10病毒相比，有160種宿主蛋白能夠與CK10病毒PA蛋白特異性結(jié)合(表1)。

2.2 生物信息學(xué)分析-GO (Gene Ontology)注釋

為了揭示與PA蛋白相互作用的差異宿主蛋白的功能，將所篩選的CK10與GS10 病毒PA相互作用差異的160種宿主蛋白質(zhì)進(jìn)行GO注釋分析。如圖1所示，GO注釋分為三個(gè)方面，包括生物學(xué)進(jìn)程(biological process)、細(xì)胞組成(cellular component)和分子功能(molecular function)。生物學(xué)進(jìn)程分析結(jié)果顯示：這160種宿主蛋白主要參與基因表達(dá)、翻譯、病毒感染和病毒轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)進(jìn)程(圖1A)，表明與流感病毒的感染息息相關(guān)；細(xì)胞組成分析結(jié)果顯示，與PA蛋白相互作用的宿主蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)(圖1B)；基于分子功能的分析結(jié)果表明，與PA相互作用的宿主蛋白主要發(fā)揮結(jié)合功能(圖1C)。

表1特異性與CK10病毒PA蛋白互作的宿主蛋白(部分蛋白)

Table1HostproteinsspecificallyinteractwithCK10PAprotein(selectedproteins)

蛋白登錄號(hào)GenBank accession number基因符號(hào)Gene symbol蛋白名稱Protein nameP68104eEF1A1Elongation factor 1-alpha 1H0Y3T0ATRXTranscriptional regulator ATRXP10914IRF1Interferon regulatory factor 1P0C869PLA2G4BCytosolic phospholipase A2 betaQ13162PRDX4Peroxiredoxin-4P24385CCND1G1/S-specific cyclin-D1Q96J66ABCC11ATP-binding cassette sub-family C member 11P67809YBX1Nuclease-sensitive element-binding protein 1O60861GAS7Growth arrest-specific protein 7Q96BF6NACC2Nucleus accumbens-associated protein 2Q86YH2ZNF280BZinc finger protein 280BQ9NW97TMEM51Transmembrane protein 51Q9UGU0TCF20Transcription factor 20B0YJC4VIMVimentinP63244GNB2L1Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-2-like 1P05141SLC25A5ADP/ATP translocase 2Q9UBN6TNFRSF10DTumor necrosis factor receptor superfamily member 10DP63261ACTG1Actin, cytoplasmic 2P42330AKR1C3Aldo-keto reductase family 1 member C3P00540MOSProto-oncogene serine/threonine-protein kinase mosP27701CD82CD82 antigenP00338LDHAL-lactate dehydrogenase A chain

2.3 生物信息學(xué)分析-KEGG通路

通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所篩選到的與PA相互作用的差異宿主蛋白進(jìn)行細(xì)胞通路分析，發(fā)現(xiàn)其中的57種蛋白參與了126條細(xì)胞通路。主要涵蓋了六種類型的細(xì)胞通路，包括人類疾病(human diseases)、遺傳信息處理(genetic information processing)、生物系統(tǒng)(organismal systems)、代謝(metabolism)、細(xì)胞過(guò)程(cellular processes)和環(huán)境信息處理(environmental information processing)(圖2A)；其主要參與的細(xì)胞通路為翻譯、傳染病、癌癥和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖2B)。

2.4 Co-IP驗(yàn)證eEF1A1特異性地與CK10病毒PA蛋白相互作用

采用IP結(jié)合LC-MS/MS的方法，本研究篩選到eEF1A1可能特異性與CK10病毒PA存在相互作用。隨后利用Co-IP進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。分別以1個(gè)MOI劑量的CK10和GS10病毒或PBS作為對(duì)照直接感染A549細(xì)胞，感染病毒36 h后收集細(xì)胞蛋白，分別用PA和eEF1A1抗體進(jìn)行IP試驗(yàn)，所得免疫沉淀物通過(guò)Western blot試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。如圖3所示，eEF1A1能夠與CK10病毒PA蛋白相互作用，但不與GS10病毒PA蛋白相互作用。

A.生物學(xué)進(jìn)程；B.細(xì)胞組成；C.分子功能A. Biological process; B. Cellular component; C. Molecular function圖1 與PA相互作用差異宿主蛋白的GO功能注釋分析Fig.1 The GO annotation of the different proteins interacting with PA

3 討 論

自1997年在亞洲發(fā)現(xiàn)第一個(gè)H5N1流感病例，H5N1亞型流感病毒已經(jīng)迅速地蔓延到不同大洲的60多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，給養(yǎng)禽業(yè)和人類健康帶來(lái)了相當(dāng)大的損害。流感病毒可以逃逸宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)并導(dǎo)致持續(xù)感染。然而，直到現(xiàn)在，AIV感染的機(jī)制尚未完全闡明。病毒感染宿主細(xì)胞后，可通過(guò)與宿主細(xì)胞因子的相互作用，利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，在細(xì)胞中存活并不斷地繁殖[22]。PA是流感病毒RNA聚合酶的一個(gè)亞基，具有多重作用：(1)在病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中起重要作用[15]；(2)有助于增強(qiáng)AIV在哺乳動(dòng)物宿主中的適應(yīng)性[3,23]；(3)影響流感病毒的毒力[5-6]；(4)與宿主細(xì)胞蛋白的“shut-off”有關(guān)[7-8]；(5)流感病毒感染過(guò)程中，參與宿主的免疫調(diào)節(jié)[24]。此外，PA基因通過(guò)核糖體移碼能夠編碼翻譯PA-X蛋白，PA-X在病毒的生命周期和致病機(jī)制中起著重要的作用[25]。

鑒于PA蛋白在流感病毒生命周期和致病機(jī)制中的重要作用，挖掘與流感病毒PA蛋白相互作用宿主細(xì)胞蛋白對(duì)于研究病毒感染的潛在機(jī)制和開(kāi)發(fā)新的抗病毒藥物非常重要。而本研究中通過(guò)一對(duì)主要由PA決定的小鼠致病性差異顯著的模式病毒篩選與PA相互作用差異宿主蛋白，更能挖掘出影響禽流感病毒致病性的宿主因子。

A.KEGG通路聚類分析；B.參與最多的四個(gè)通路的蛋白名稱A. Classification of the enriched KEGG pathways of the identified proteins; B. Name of the identified proteins related with the top four KEGG pathways圖2 與PA相互作用差異宿主蛋白的KEGG通路分析Fig.2 The KEGG pathway analysis of the different proteins interacting with PA

許多技術(shù)已被用于篩選蛋白間的相互作用，如親和純化結(jié)合質(zhì)譜(AP-MS)和酵母雙雜交(Y2H)，與Y2H相比，AP-MS的使用更為廣泛，因?yàn)樗梢越沂咎烊粻顟B(tài)下蛋白質(zhì)之間的相互作用。在本研究中，應(yīng)用IP偶聯(lián)LC-MS / MS技術(shù)，篩選在H5N1流感病毒感染的A549細(xì)胞中與PA相互作用的宿主蛋白，這相比于使用PA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后進(jìn)行IP偶聯(lián)LC-MS / MS相比，不僅在病毒復(fù)制期間保留蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，而且能夠探索可能與PA間接相互作用的宿主細(xì)胞蛋白。

通過(guò)上述方法，共篩選到與致病性差異H5N1流感病毒的PA存在相互作用的160種差異人類細(xì)胞蛋白。為了進(jìn)一步探索這些差異宿主細(xì)胞蛋白與病毒之間相互作用的生物學(xué)意義，對(duì)這些宿主蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析?；贕O注釋分析結(jié)果表明，所篩選的宿主細(xì)胞蛋白與病毒感染、翻譯和復(fù)制高度相關(guān)(圖2)。

通過(guò)KEGG通路分析，160個(gè)所篩選的差異宿主細(xì)胞蛋白中有57種蛋白參與了126條細(xì)胞通路。其中參與最多且與病毒感染密切相關(guān)的為翻譯相關(guān)途徑，涉及到2條細(xì)胞通路以及9種宿主蛋白(圖3)。因此，我們推測(cè)翻譯途徑在流感病毒感染過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因?yàn)樵诹鞲胁《具M(jìn)入宿主細(xì)胞后，病毒核糖核蛋白復(fù)合物和病毒RNA(vRNPs)被運(yùn)送到細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞核中，病毒基因組轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后又被轉(zhuǎn)運(yùn)回細(xì)胞質(zhì)并翻譯成病毒蛋白，隨后NP、PB1、PB2和PA蛋白將重新進(jìn)入細(xì)胞核與病毒RNA形成新的RNP復(fù)合物[26]。因此，通過(guò)將與PA互作宿主細(xì)胞蛋白的KEGG通路分析，進(jìn)一步證實(shí)了PA在病毒復(fù)制中的關(guān)鍵作用。其次還有傳染病相關(guān)途徑，包括14條通路和9個(gè)所篩選的蛋白(圖3)。在這9種蛋白中，ACTG1和TNFRSF10D與流感病毒感染途徑高度相關(guān)，因此我們推測(cè)這兩個(gè)蛋白可能是造成本研究中兩株禽流感病毒致病性差異的主要宿主因子。同時(shí)免疫系統(tǒng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也富集較多差異PA互作宿主蛋白，包括抗原的加工和呈遞、NOD樣受體信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和Jak-STAT信號(hào)通路等。已有的研究結(jié)果表明，PI3K-Akt信號(hào)通路在流感病毒感染過(guò)程中由NS1激活[27]，發(fā)揮著抑制病毒復(fù)制的作用[28]；而MAPK信號(hào)通路在流感病毒感染期間能夠調(diào)節(jié)宿主炎性應(yīng)答反應(yīng)，從而影響病毒復(fù)制[29]。本研究的結(jié)果將進(jìn)一步為研究禽流感病毒對(duì)宿主免疫應(yīng)答的影響提供新的靶標(biāo)蛋白。

圖3 Co-IP鑒定eEF1A1特異性地與CK10病毒PA蛋白相互作用Fig.3 Identification of eEF1A1 interacts with CK10 PA protein specifically

利用Co-IP試驗(yàn)，對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)宿主蛋白eEF1A1能夠特異性的與CK10病毒PA蛋白結(jié)合。eEF1A1不僅是一種翻譯因子，它還有多種效用，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架、伴侶蛋白活性以及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡[30]。以前的研究表明，eEF1A1與p53蛋白相互作用[31]。P53蛋白也與流感病毒相互作用，抑制p53蛋白表達(dá)能夠增強(qiáng)機(jī)體先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)抵抗流感病毒感染[32]，但是p53發(fā)揮此作用的機(jī)制仍未可知。因此，我們推測(cè)本研究中所鑒定的CK10病毒PA相互作用宿主蛋白eEF1A1可能與p53一起在流感病毒感染過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，當(dāng)然這需要進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

在此研究中，通過(guò)比較兩株小鼠致病性差異顯著的H5N1禽流感病毒PA蛋白相互作用的人類細(xì)胞蛋白，篩選到160種差異相互作用的人類細(xì)胞蛋白。通過(guò)GO注釋和KEGG通路分析，結(jié)果顯示這些蛋白在病毒感染和病毒復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用，此外Co-IP試驗(yàn)驗(yàn)證了宿主蛋白eEF1A1能夠特異性地與CK10病毒PA蛋白相互作用。這為揭示與流感病毒毒力因子PA蛋白相關(guān)的分子機(jī)制提供了幫助，同時(shí)也將加速?gòu)乃拗鲗用骊U明流感病毒致病機(jī)制的步伐。