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    毛序棘豆內(nèi)生真菌分離鑒定及系統(tǒng)進化分析

    2018-10-15 09:36:00任禎慧宋潤杰權(quán)海云焦韻潔黃竹濤王敬龍趙寶玉
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報 2018年9期
    關(guān)鍵詞:棘豆內(nèi)生鐮刀

    孫 璐,任禎慧,宋潤杰,權(quán)海云,焦韻潔,黃竹濤,王敬龍,趙寶玉,路 浩*

    (1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,楊凌 712100;2.西藏農(nóng)牧科學(xué)院草業(yè)科學(xué)研究所,拉薩 850000)

    棘豆屬植物在世界范圍內(nèi)大約有300種,主要分布在北半球的歐亞和北美等地[1],我國有125種、4個變種和4個變型[2],其中有近10種有毒植物[3],主要分布于內(nèi)蒙古、新疆、青海、西藏等西部草原[4]。動物采食棘豆屬有毒植物后表現(xiàn)有后肢拖地、搖擺,步態(tài)不穩(wěn),四肢麻痹僵硬,頭頸部不斷做水平擺動等以運動機能障礙為特征的臨床癥狀,也可導(dǎo)致母畜不孕、流產(chǎn),公畜不育,胎兒畸形,畜產(chǎn)品質(zhì)量下降,甚至家畜大量死亡,嚴重阻礙了畜牧業(yè)的健康發(fā)展[5-6]。

    內(nèi)生真菌(fungal endophyte)是指在健康植物內(nèi)寄生、在各種組織器官內(nèi)部或者細胞間隙中度過全部或近乎全部生活周期而不使寄主表現(xiàn)任何癥狀的一類真菌,包括菌根真菌和所有植物病原菌在內(nèi)的一個大類群[7]。1999年,Braun等[8]從瘋草中發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌并初步認為瘋草產(chǎn)毒機制與其內(nèi)生真菌感染有關(guān)。隨后,Cook等[9]、Gao等[10]和Grum等[11]先后通過qPCR及LC-MS證明棘豆蠕孢菌(Undifilumoxytropis)是棘豆屬有毒植物主要毒性成分——苦馬豆素(swainsonine)生物合成的根本原因。研究表明,內(nèi)生真菌在棘豆屬有毒植物中分布廣泛,路浩等[12]從急彎棘豆中分離到鐮刀菌屬、裸胞殼菌屬和曲霉菌屬;陳基萍等[13]從黃花棘豆、蘭花棘豆、變異黃芪等中分離到毛殼菌屬、梭孢殼屬、足孢子菌屬等內(nèi)生真菌;而后周啟武等[14]從小花棘豆中分離到鏈格孢屬、鐮刀菌屬和埃里磚格孢屬;路浩等[15]從甘肅棘豆中分離到鏈格孢屬、附球菌屬、鐮刀菌屬等內(nèi)生真菌。

    毛序棘豆(Oxytropistrichophora)屬于豆科棘豆屬的多年生灌木,根粗壯,莖短被白色硬毛,適應(yīng)性強,分布于塔什庫爾干西部邊境,高山帶石質(zhì)山坡[16],在河北、北京、山西陽高縣、陜西延安和綏德及甘肅定西等地均有分布[17]。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn),動物一般不主動采食毛序棘豆,且它與其他有毒棘豆的外形相似,因此懷疑該植物屬于瘋草的一種。但目前有關(guān)毛序棘豆的研究較少,特別是尚未見有毛序棘豆內(nèi)生真菌種類與種群分布特點的報道,因此,本試

    驗采用表面消毒法分離毛序棘豆內(nèi)生真菌,運用形態(tài)學(xué)和ITS序列分析技術(shù)進行內(nèi)生真菌種屬鑒定,闡明毛序棘豆內(nèi)生真菌的種類及種群分布特點,研究結(jié)果可進一步豐富棘豆屬有毒植物內(nèi)生真菌多樣性,也為毛序棘豆內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 植物材料 實驗所用毛序棘豆植物樣本于2016年5月采自甘肅省通渭縣,對剛采集的新鮮植物樣本作干燥處理后帶回實驗室保存?zhèn)溆?,該植物樣品包含根、莖、葉和種子。

    1.1.2 主要儀器、設(shè)備與試劑 霉菌培養(yǎng)箱(中儀國科)、XP基因擴增儀(杭州博日)、TG16A臺式高速離心機(上海盧湘)、冰箱、光學(xué)顯微鏡(廈門麥克奧迪)、凝膠成像分析系統(tǒng)(SYNGENE)、無水乙醇、2%次氯酸鈉、2% CTAB分離緩沖液、氯仿、異戊醇、3 mol·L-1NaAc、真菌通用引物ITS1和ITS4、2×EsTaqMAsterMix(Dye)、1×TBE緩沖液、DNA Marker(2 000 bp)、核酸染料(StarGreen)、中性樹膠等。

    1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar,PDA):馬鈴薯200 g·L-1,20 g·L-1瓊脂粉,20 g·L-1葡萄糖。

    1.2 毛序棘豆內(nèi)生真菌的分離

    1.2.1 植物樣品的表面消毒 將毛序棘豆植物樣品的根、莖、葉、種子用去離子水洗去表面泥沙和塵土,用無菌鑷子將植物的根、莖、葉分離后用去離子水浸泡2~3 h,然后在無菌實驗操作臺對植物組織進行表面消毒。表面消毒的程序:75%酒精漂洗30 s;無菌水漂洗1 min;2%次氯酸鈉漂洗2 min;無菌水漂洗1 min,重復(fù)4次;由于次氯酸鈉消毒作用較強,因此將2%次氯酸鈉的消毒時間作適量調(diào)整,如表1所示。將最后一次清洗所得滅菌去離子水滴入PDA培養(yǎng)基的表面,做組織印記檢測,培養(yǎng)一周后觀察該培養(yǎng)基表面是否有其他微生物生長,以此驗證表面消毒效果。

    表1植物組織表面消毒時間選擇

    Table1Thesurfacedisinfectionscheduleofplanttissues

    min

    1.2.2 毛序棘豆內(nèi)生真菌的分離 將漂洗完的植物的根、莖、葉和種子用已高壓過的濾紙包裹,盡可能將水分吸干,然后用手術(shù)剪將根、莖剪成2~5 mm,葉剪成3 mm×3 mm的小塊,由于毛序棘豆的種子較小,將其剪開,留有創(chuàng)面即可,注意在剪不同植物組織時要用酒精棉球消毒,防止不同組織內(nèi)的真菌交叉,而后將已剪好的植物組織用無菌鑷子分別接種于PDA平板上,每個次氯酸鈉時間梯度接兩個PDA平板,接種時注意將切口接入培養(yǎng)基內(nèi),然后放置于真菌恒溫培育箱內(nèi),25 ℃培養(yǎng)一周后將具有明顯菌落差異的真菌挑取頂端菌絲重新接種到新的PDA平板上,重復(fù)該操作直至得到純化菌株,將其作分離率(isolation rate,IR)分析,來衡量毛序棘豆每個組織部位受內(nèi)生真菌浸染的程度,而后將純化菌株接種至PDA斜面培養(yǎng)基上,25 ℃培養(yǎng)一段時間后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 毛序棘豆內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

    根據(jù)真菌在PDA培養(yǎng)基上的生長狀況,將純化菌株接種在固體培養(yǎng)基上,每天固定時間記錄菌落的生長狀況,包括菌落顏色、形態(tài)、大小等,在菌落生長到一定階段,采用菌絲插片的方法制作菌絲玻片,用顯微鏡觀察菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、產(chǎn)孢子梗著生情況、孢子形態(tài)等微觀特征,將所觀察記錄的結(jié)果參考《真菌鑒定手冊》[18]對其進行初步種屬鑒定。

    1.4 5.8S rDNA-ITS序列分析

    1.4.1 內(nèi)生真菌基因組DNA的提取 采用改良CTAB法提取純化菌株DNA[19]:刮取菌絲置于研缽中,分兩次加液氮20 mL,快速研磨成粉末狀,稱取50 mg于1.5 mL的離心管內(nèi),加入600 μL2% CTAB 緩沖液(65 ℃預(yù)熱),振蕩混勻后置于65 ℃水浴鍋中45~60 min,期間顛倒混勻3次;加入600 μL混合液(氯仿∶異戊醇=24∶1,-20 ℃預(yù)冷),室溫孵育3~5 min后,4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min,吸取上清液于新的1.5 mL的離心管,重復(fù)三次;將最后一次離心所得上清液吸至2.0 mL的離心管內(nèi),加60 μL 3 mol·L-1NaAc溶液(pH 6.0)和900 μL無水乙醇(-20 ℃預(yù)冷)輕輕顛倒混勻后,置于-20 ℃的冰箱中1 h以上或過夜;4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min后,棄去上清液,75%的乙醇溶液(-20 ℃預(yù)冷)清洗沉淀3次,揮干乙醇;加入30~50 μL ddH2O溶解DNA,而后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4.2 5.8S rDNA-ITS片段的擴增與核苷酸序列的測定 5.8S rDNA-ITS片段擴增采用50 μL的PCR體系,該反應(yīng)體系:真菌通用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)各2 μL,DNA模板3 μL,2×EsTaqMaster Mix 23 μL,ddH2O 20 μL;PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30個循環(huán);72 ℃終延伸2 min,4 ℃保溫10 min。

    將PCR產(chǎn)物用移液槍吸取6 μL點樣,并吸取同樣體積的DNA marker(2 000 bp),倒入電泳液(1×TAE緩沖液)至剛剛沒過電泳膠,連接電泳儀正負極開通電源,電泳條件:電壓90 V、電流500 A、40 min;電泳結(jié)束后,用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。若觀察到明顯的電泳條帶,則將PCR產(chǎn)物吸取20 μL至0.5 mL離心管中,標記后送往測序公司進行檢測。

    1.4.3 毛序棘豆內(nèi)生真菌的系統(tǒng)進化分析 將測序結(jié)果序列與NCBI的DNA數(shù)據(jù)庫進行比對,選出比對結(jié)果中相似度較高并且種屬關(guān)系較近的序列,結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察確定菌株種屬,將所得菌株種屬作相對分離頻率(relative frequency,RF)分析,來衡量某個屬的內(nèi)生真菌的優(yōu)勢度;然后將測序結(jié)果導(dǎo)入到MEGA 5.05軟件中采用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20],自展次數(shù)為1 000次,根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹判斷其親緣關(guān)系,并進行系統(tǒng)進化分析。

    2 結(jié) 果

    2.1 毛序棘豆內(nèi)生真菌的分離

    在對毛序棘豆植物組織進行表面消毒時,將2%次氯酸鈉消毒時間作以梯度,接種后觀察發(fā)現(xiàn),1和 1.5 min消毒時間下的印記對照平板均被除內(nèi)生真菌外的其他微生物污染,且在1 min 45 s和2 min 消毒時間下分離所得的內(nèi)生真菌種類最多,因此次氯酸鈉的消毒時間選定為2 min,將在此消毒時間分離并純化所得菌株,根據(jù)其形態(tài)合并為29株,將所得數(shù)據(jù)作分離率分析,可知莖的分離率最高,根和葉次之,而種子中未分離出(表2)。

    2.2 毛序棘豆內(nèi)生真菌的形態(tài)特征

    采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)純化后的菌株,在培養(yǎng)過程中記錄菌落及菌絲的主要特征,結(jié)果如表3所示。

    2.3 毛序棘豆內(nèi)生真菌的5.8S rDNA-ITS序列分析

    將PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果在NCBI上比對,比對結(jié)果如表4所示,相似度都高達96%以上,得到分屬于4綱,5目,6科,10屬,共29種內(nèi)生真菌,其中有6種未命名,Paraphomasp.(P1235)未見相對應(yīng)的中文屬名(表4),從毛序棘豆不同組織內(nèi)生真菌的菌屬相對分離頻率(表5)來看,毛序棘豆內(nèi)生真菌總相對分離頻率為79.31%,其中莖的內(nèi)生真菌相對分離頻率最高,為48.28%,根和葉次之分別為31.03%和20.69%,就分離到的菌屬而言,鐮刀菌屬(Fusariumsp.)分別以17.24%和13.79%的相對分離頻率成為根和葉的優(yōu)勢菌屬;鏈格孢菌屬(Alternariasp.)以27.59%的相對分離頻率成為莖的優(yōu)勢菌屬;木霉菌屬(Trichodermasp.)的Trichodermaviride(wxm58)廣泛存在于根、莖、葉三種組織,部分優(yōu)勢菌屬的菌落和菌絲形態(tài)如圖1所示。

    表2毛序棘豆內(nèi)生真菌分離結(jié)果

    Table2IsolationresultsofendophyticfungifromOxytropistrichophora

    組織部分Tissues2%NaClO滅菌時間/minSterilization time組織塊數(shù)Tissues number菌落總數(shù)Colony number分離率/%Isolation rate葉Leaf254611.11莖Stem2461839.13根Root2461123.91種子Seed25400

    表3毛序棘豆內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)特征

    Table3MorphologicalcharacteristicsofendophyticfungiformOxytropistrichophora

    菌株編號Strains No.分離部位Tissues菌落特征Colony characteristics菌絲特征Hyphae characteristics生長速度/(mm·d-1)Growth rateY3葉Leaf菌絲氣生生長,菌落白色,質(zhì)密,隆起呈丘狀,形狀不規(guī)則,絮狀邊緣,背面中間為黑色,邊緣無色菌絲彎曲,有橫隔,分支,頂端鈍圓2.5G1根Root菌絲氣生生長,菌落同心圓狀,中間橘黃色,四周玫紅色,疏松,圓形,中心凸起,纖毛狀邊緣,背面中間為黃色,四周為橘紅色菌絲玫紅色,有橫隔,分支7.5G2根Root菌絲氣生生長,粗壯,菌落土黃色,疏松,形狀不規(guī)則,表面有水滴,背面無色菌絲透明,無橫隔9.5G6根Root菌絲匍匐生長,菌落深灰色,疏松,扁平,全圓,纖毛狀邊緣,背面為灰色菌絲彎曲,暗棕色,有橫隔,分支3.0

    (轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

    (轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

    表4毛序棘豆內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果

    Table4IdentificationresultsofendophyticfungifromOxytropistrichophora

    菌株編號Strains No.屬Genus種SpeciesY3殼多隔孢屬(Stagonospora)Stagonosporopsis astragali (AS1S2-1)G1鐮刀菌屬(Fusarium)Fusarium tricinctum(WBS014) G2毛霉屬(Mucor)Mucor hiemalis(WBS012) G6殼多隔孢屬(Stagonospora)Stagonosporopsis cucurbitacearum(JH3J1-4)G7未定屬Fungal sp.(YWZKDF2-1) G8漆斑菌屬(Myrothecium)Myrothecium verrucaria(E21) G10-Paraphoma sp.(P1235) GY1鐮刀菌屬(Fusarium)Fusarium tricinctum(WBS031)GY2鐮刀菌屬(Fusarium)Fusarium tricinctum(QL1-1)GY3鐮刀菌屬(Fusarium)Fusarium tricinctum(Z5)GY4鐮刀菌屬(Fusarium)Fusarium lateritium(MAFF 235344) J1小雙胞腔菌屬(Didymella)Didymellaceae sp.(sib5-1-2)J2莖點霉屬(Phoma)Phoma fungicola (H11_H10_1104035152Q)J5莖點霉屬(Phoma)Phoma medicaginis(1-00219-2)

    (轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

    A. GJY4的菌落;B. GJY4的菌絲10×100;C. JVI的菌落;D. JVI的菌絲10×100;E. J17的菌落;F. J17的菌絲10×100;G. G1的菌落;H.G1的菌絲10×100A. The colony of GJY4; B. The hyphae of GJY4, 10×100; C. The colony of JVI; D. The hyphae of JVI, 10×100; E. The colony of J17; F. The hyphae of J17, 10×100; G. The colony of G1; H. The hyphae of G1, 10×100圖1 毛序棘豆內(nèi)生真菌菌落及菌絲形態(tài)Fig.1 Morphology of colonies and hyphae of endophytic fungi from Oxytropis trichophora

    將所得菌株采用MEGA軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),由親緣關(guān)系的遠近可以將除去族外菌株Mucorhiemalis(WBS012)的其余菌株分為種群Ⅰ和種群Ⅱ,自檢支持率分別為89%和99%;根據(jù)親緣關(guān)系遠近,種群Ⅰ又可分為種群A和種群B,且自檢支持率均為99%。種群Ⅱ又可進一步分為種群C和種群D,自檢支持率分別為93%和92%,種群A可分為兩個種群,自檢支持率分別為60%和62%,種群B內(nèi)有自檢支持率分別為96%、92%的兩個種群,而種群C和種群D則無下屬的分支。

    圖2 基于5.8S rDNA-ITS序列由鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed with the program Neighbor-joining (NJ) based on 5.8S rDNA-ITS sequences

    3 討 論

    采用表面消毒法將植物組織樣本進行消毒,而消毒劑消毒時,通常是由表面緩慢往里滲透的,因此作用時間越長,植物內(nèi)生真菌被殺滅的可能性越大,被分離出的越少,但是,作用時間太短又不足以殺滅組織表面的微生物,達不到滅菌的效果,因此需要找出植物組織的最佳消毒時間,由于本試驗中2%次氯酸鈉的消毒作用較強,因此僅將其作用時間作濃度梯度,而后觀察到2 min為根、莖、葉的最佳消毒時間。路浩等[12]在急彎棘豆內(nèi)生真菌的分離鑒定中觀察到根、莖、葉、花和種子的最佳消毒時間也是2 min;而曹丹丹等[21-22]在分離變異黃芪和莖直黃芪植株中的內(nèi)生真菌時發(fā)現(xiàn)莖的最佳消毒時間分別為2和3 min,葉和花的最佳消毒時間為3 min;表明同屬植物的最佳表面消毒時間有相同的可能,而不同屬植物的消毒時間有差異。另外,在培養(yǎng)過程中還發(fā)現(xiàn)菌落的生長速率一般在6 d以后有明顯或不明顯的下降,可見這些菌株的生長周期較短,為快生型菌類。由表2可以看出,莖的分離率最高,為39.13%;根次之,為23.91%;葉為11.11%;而種子中未分離到內(nèi)生真菌,可能毛序棘豆內(nèi)生真菌的傳播方式為水平傳播。此外,路浩等[12]發(fā)現(xiàn)急彎棘豆植物樣本中,莖和葉中分離到的內(nèi)生真菌最多,根、花和種子分離到的較少。周啟武等[14]發(fā)現(xiàn)小花棘豆植株中葉的內(nèi)生真菌分離率為56.82%,為最高;種子的分離率為42.37%,次之;莖和葉柄的內(nèi)生真菌分離率在30.00%左右,為最少。隨后,路浩等[15]發(fā)現(xiàn)甘肅棘豆植株中莖內(nèi)生真菌的分離率(83.03%)高于葉(57.67%);曹丹丹等[21-22]發(fā)現(xiàn)變異黃芪植株中葉的內(nèi)生真菌分離率最高,為100.00%;花次之,為45.00%;而莖直黃芪根、莖的內(nèi)生真菌分離率均在80.00%左右。由此可見,內(nèi)生真菌侵染有毒植物的組織部位較為廣泛。

    將所得的毛序棘豆內(nèi)生真菌鑒定后的結(jié)果進行分析后,可知(表5)莖的相對分離頻率最高,根和葉次之,且遠低于莖的相對分離頻率,就分離到的菌屬而言,鐮刀菌屬(Fusariumsp.)分別以17.24%和13.79%的相對分離頻率成為根和葉的優(yōu)勢菌屬,鏈格孢菌屬(Alternariasp.)以27.59%的分離率成為莖的優(yōu)勢菌屬,而木霉菌屬(Trichodermasp.)在毛序棘豆植物組織內(nèi)的分布最為廣泛,在根、莖、葉中均有分布;路浩等[12]發(fā)現(xiàn)在急彎棘豆植株中,分離到鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、裸胞殼菌屬(Emericellasp.)、曲霉菌屬(Aspergillussp.)的內(nèi)生真菌;周啟明等[14]發(fā)現(xiàn)小花棘豆中的優(yōu)勢菌屬為鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、埃里磚格孢屬(Embellisiasp.)和Undifilumsp.;路浩等[15]發(fā)現(xiàn)甘肅棘豆中的優(yōu)勢菌屬為Undifilumsp.,曹丹丹等[21-22]發(fā)現(xiàn)變異黃芪中優(yōu)勢菌屬為炭角菌屬和Undifilumsp.,莖直黃芪中的優(yōu)勢菌屬為鏈格孢屬(Alternariasp.)和Undifilumsp.,而這五種有毒植物中都分離到鐮刀菌屬(Fusariumsp.)的內(nèi)生真菌[12,14-15,21-22],由于鐮刀菌屬(Fusariumsp.)下屬的菌株種類繁多,且一般可通過土壤侵入植物組織,而且鐮刀菌能夠在土壤中營腐生生活,所以根和土壤中的莖一般較易感染,因此,這也是其分布廣泛的原因之一,另外鐮刀菌屬的變異性較大,有出現(xiàn)高致病性菌株的可能,且危害嚴重[23];小花棘豆、甘肅棘豆和莖直黃芪中均分離到鏈格孢菌屬(Alternariasp.)的內(nèi)生真菌[21-22],鏈格孢菌屬(Alternariasp.)分布廣泛,種類多樣,變異性較大,不但能夠感染植物,給農(nóng)林業(yè)造成經(jīng)濟損失,而且其中有些種類甚至可以感染人或動物,危害人畜健康[24]。

    4 結(jié) 論

    通過對毛序棘豆各組織內(nèi)生真菌的分離與鑒定,共獲得10屬29種內(nèi)生真菌;在毛序棘豆各組織中,內(nèi)生真菌對莖的侵染頻率最高,根次之,葉最少;鏈格孢菌屬(Alternariasp.)是毛序棘豆植株莖中的優(yōu)勢菌屬,鐮刀菌屬(Fusariumsp.)是毛序棘豆植株根和葉中的優(yōu)勢菌屬。

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