三葉白術湯口服液的遺傳毒性試驗

鄧利斌，景俊年，趙勝軍，肖希龍

(1.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京海淀100193 ； 2.武漢輕工大學動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室，湖北武漢430023)

紫蘇葉、藿香、淡竹葉、白術均為容易栽培、資源豐富、價格低廉的天然植物藥物。此四味草藥組成方劑三葉白術湯具有芳香解表，健脾化濕的功效。此研究對三葉白術湯的遺傳毒性進行研究，為其作為新獸藥的臨床安全性評價提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物 三葉白術湯口服液由武漢輕工大學動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室自制，批號為160315，為綜紅色澄明液體，由紫蘇、藿香、淡竹葉、白術等成分組成水煎濃縮而成，每毫升含生藥量1 g。豬的臨床推薦量為0.1 mL/kg·bw，每日口服1次。

1.2 試驗系統(tǒng) 三項遺傳毒理試驗所用菌株、細胞和實驗動物均符合《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》[1]推薦的試驗系統(tǒng)。Ames試驗所用試驗菌株為組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535，染色體畸變試驗所用試驗細胞為中國倉鼠肺成纖維細胞株(CHL)，兩個試驗所需的S9肝微粒體酶，均購自美國MOLTOX公司；經(jīng)生物特性鑒定合格后用于試驗。小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗使用SPF級昆明系雄性小鼠30只，7～8周齡[1-2]，體重28～30 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號為：SCXK(京)2011-0012。

1.3 試驗儀器和試劑 試驗儀器：BX51光學顯微鏡(Olympus)，XSP-17CZ倒置顯微鏡(上海長方光學儀器有限公司)；L535R臺式超低溫高速離心機(湘儀離心機儀器有限公司)；AC2-4S1生物安全柜(ESCO新加坡藝思潔凈設備有限公司)；2306-2二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(美國SHELLAB)；DH6000II電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司)等。

試驗試劑：瓊脂粉(SIGMA)，氧化型輔酶Ⅱ(Roche)，葡萄糖-6-磷酸(Sigma公司)；DMEM/HIGH GLUCOSE (Hyclone公司)；Giemsa染液(Solorbio公司)；環(huán)磷酰胺(SIGMA-ALDRICH公司)；秋水仙堿(Sigma公司)；絲裂霉素C(Biotopped公司)；敵克松，2-氨基蒽(Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)；疊氮鈉(Sigma公司)；2-氨基芴(Sigma公司)/1,8-二羥基蒽醌(Merck公司)等。

1.4 試驗方法

1.4.1 Ames試驗[1～4]將受試物在無菌條件下加無菌蒸餾水先20倍稀釋后再5倍倍比稀釋4次，獲得濃度為50 000、10 000、2 000、400、80 μg/mL共5個濃度，同時設陰性對照組(無菌蒸餾水)及陽性對照組敵克松500 μg/mL，疊氮鈉15 μg/mL，二氨基蒽200 μg/mL，1，8-二羥基蒽醌100 μg/mL，2-氨基蒽200 μg/mL。所有的受試物組均需在加入和不加入S9的條件下進行。陽性組設計為：在+S9條件下TA97a，TA98和TA100的陽性對照品為2-氨基芴，TA102的陽性對照品為1,8-二羥基蒽醌，TA1535的陽性對照品為2-氨基蒽；在-S9條件下TA97a，TA98和TA102的陽性對照品為敵克松，TA100和TA1535的陽性對照品為疊氮鈉。試驗采用平板摻入法，每皿加入0.1 mL受試物/對照品，0.1 mL菌液和0.5 mL S9混合液(+S9)。將所有平皿培養(yǎng)48 h進行菌落計數(shù)。根據(jù)指導原則要求，Ames試驗至少重復一次進行驗證。

1.4.2 中國倉鼠肺成纖維細胞(CHL)染色體畸變試驗[1,5-6]將受試物在無菌條件下用無菌蒸餾水稀釋至濃度為50、16.67、5.56 mg/mL共3個濃度。同時設陰性對照為無菌蒸餾水，設陽性對照為環(huán)磷酰胺(80 μg/mL，+S9))和絲裂霉素C(4 μg/mL，-S9)。試驗需在±S9的條件下進行。試驗步驟和方法參考《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》和“GB 15193.23-2014”等指導原則進行，將CHL細胞用藥物進行6 h，24 h，48 h處理，然后制成玻片標本。并顯微鏡下閱片。根據(jù)閱片記錄計算畸變率：畸變率(%)=(染色體發(fā)生結構畸變的細胞數(shù)/觀察細胞總數(shù))×100%。

1.4.3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗[1-2,7]30只雄性小鼠分為5組，每組6只，采用灌胃給藥。分別設2 000、1 000、500 mg/kg劑量組，陰性對照組給予稀釋藥物用的蒸餾水，陽性組給予環(huán)磷酰胺40 mg/kg。陽性組給藥1次后22～24 h，其他組給藥2次后22～24 h，采用頸椎脫臼法處死動物，取骨髓涂片、固定、Giemsa染色并于顯微鏡下閱片。每只動物計數(shù)2 000個嗜多染紅細胞中出現(xiàn)微核的細胞數(shù)，計算微核率，以千分率表示。另外，計數(shù)每只動物200個紅細胞中嗜多染紅細胞與總紅細胞(嗜多染紅細胞和正染紅細胞)的比值。

1.5 統(tǒng)計學分析與結果判定標準

1.5.1 Ames試驗 根據(jù)每個平皿的回復突變菌落數(shù)，統(tǒng)計平均回復突變菌落數(shù)和標準差。受試物組的菌株回變菌落數(shù)應等于或大于未處理陰性對照組的2倍以上，且具有劑量-反應關系或某一測試點具有可重復增加則判定陽性結果[4,6]，否則為陰性。

1.5.2 中國倉鼠肺成纖維細胞(CHL)染色體畸變試驗 經(jīng)方差分析(χ2檢驗)，受試物所誘發(fā)的染色體畸變率與陰性對照組相比，出現(xiàn)濃度依賴性的增加，或出現(xiàn)可重復性的增加，并且與陰性對照組相比，差異顯著(P≤0.05)，可判定為陽性結果，否則為陰性。

1.5.3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗 經(jīng)方差分析。當受試物組微核率出現(xiàn)劑量依賴性升高，并且與對照組微核率比較有顯著差異時(P<0.05)，判定為陽性反應，否則為陰性。

2 試驗結果

2.1 Ames試驗 Ames試驗結果見表1和表2。兩次Ames試驗三葉白術湯口服液各劑量組菌落數(shù)均未超過陰性對照組的2倍。說明三葉白術湯口服液沒有誘發(fā)TA97a，TA98，TA100，TA102和TA1535五種菌株產生回復突變的作用，試驗結果為陰性。

2.2 中國倉鼠肺成纖維細胞(CHL)染色體畸變試驗 CHL染色體畸變試驗結果見表3。試驗結果顯示，在此研究試驗條件下，三葉白術湯口服液5、1.67 mg/mL和0.56 mg/mL三濃度均沒有致CHL細胞染色體畸變率升高，試驗結果陰性。

2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗 微核試驗結果見表4。

三葉白術湯口服液低、中、高劑量組小鼠微核發(fā)生率均低于4‰，均不超過微核自然發(fā)生率[7]，組間相互比較無顯著性差異(P>0.05)，證明三葉白術湯口服液低、中、高劑量組小鼠微核發(fā)生率未出現(xiàn)劑量依賴性升高；三葉白術湯口服液低、中、高劑量組與陰性對照組比較，也無顯著性差異(P>0.05)，可以判定試驗結果陰性。“嗜多染紅細胞數(shù)/總紅細胞數(shù)”作為毒性指標，各受試物組與陰性對照組比較，差異均不顯著(P>0.05)，表明在此研究試驗條件下，三葉白術湯口服液低、中、高劑量均沒有明顯骨髓紅細胞毒性。

組別劑量(μg/皿)TA97aTA98TA100TA102TA1535-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9三葉白術湯口服液898.00±12.17138.33±32.1547.00±17.0948.00±11.36177.00±12.12133.00±4.36251.00±51.10359.33±16.078.33±4.049.67±0.5840109.67±9.02148.67±11.5941.00±2.6550.67±3.06172.67±16.04145.33±12.50279.67±7.64379.67±16.296.67±3.066.67±1.5320089.00±8.19161.00±10.4451.33±12.2245.67±4.62186.33±8.33136.00±32.08300.33±45.00388.67±12.507.33±3.219.33±2.31100098.67±1.53172.67±14.1542.33±6.4347.33±3.06123.33±9.02147.67±15.18279.67±38.18370.00±14.935.67±2.527.67±3.06500078.33±10.50175.67±8.9640.00±24.5249.33±2.89114.00±23.81140.00±8.66259.33±46.69370.67±26.272.00±2.653.00±1.00陰性對照組89.00±10.54151.33±27.0643.67±3.2146.33±5.13146.33±9.07164.33±6.11253.33±8.14403.00±9.857.33±3.2111.33±7.57陽性對照組1092.00±156.18971.00±123.841030.33±157.071116.00±142.03889.33±104.64964.33±137.501235.33±103.50866.33±5.51236.00±3.46232.33±19.40

組別劑量(μg/皿)TA97aTA98TA100TA102TA1535-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9三葉白術湯口服液898.67±11.55108.33±7.6438.00±16.7034.67±3.21109.67±3.51145.67±4.04228.00±18.52289.00±61.4916.67±15.3110.33±6.6640105.00±14.42112.00±12.1243.33±1.5344.33±8.96140.00±4.36127.00±42.58271.00±8.72253.00±8.896.67±3.798.67±5.51200122.00±20.78143.33±35.8142.67±1.1539.33±2.08136.33±11.72102.33±5.86277.67±45.72286.33±30.9212.00±3.4622.33±14.571000124.67±8.14127.67±25.8136.33±5.5136.00±3.46116.67±16.77132.67±13.05260.33±25.54307.00±6.0810.33±4.0413.33±4.1615000106.00±8.72113.67±31.5042.67±6.8133.67±6.03143.00±11.00155.00±59.91309.33±11.06297.67±13.3216.00±18.5211.67±5.86陰性對照組100.67±5.0396.33±5.5147.00±1.7335.00±14.11144.00±11.27183.33±25.17311.00±10.00316.33±62.1716.33±17.2116.33±3.21陽性對照組932.67±231.73959.33±139.43974.67±125.87914.00±60.511329.00±13.00889.67±100.502545.67±288.27915.67±62.58360.67±86.64226.33±12.34

表3 三葉白術湯口服液致CHL染色體畸變試驗結果

注：一個細胞中出現(xiàn)2個或2個以上畸變類型，畸變細胞數(shù)計為1個；為了便于統(tǒng)計分析將空白對照組的劑量計為0 μg/mL。

*：與空白對照組相比，差異極顯著(P<0.01)

組別微核率(‰)嗜多染紅細胞數(shù)/總紅細胞數(shù)陰性對照組1.58±1.320.60±0.10陽性對照組16.25±5.16**0.59±0.11藥物低劑量組1.50±1.050.59±0.09藥物中劑量組1.83±0.520.51±0.05藥物高劑量組1.58±1.280.56±0.07

**：與陰性對照組比較，P<0.01

3 討論

三葉白術湯口服液組方中的紫蘇、藿香、淡竹葉及白術四種植物“藥食兩用”已久，可見安全性。但三葉白術湯口服液需經(jīng)過毒性試驗對其安全性進行驗證。Ames試驗作為細菌回復突變試驗已被證明能檢出相關的遺傳學改變(移碼突變和堿基置換)和大部分嚙齒類動物遺傳毒性致癌劑[1]。因細菌作為原核生物不能完全檢測DNA損傷，所以又進行了哺乳動物細胞-中國倉鼠肺成纖維細胞株(CHL)染色體結構和數(shù)目畸變的體外試驗。小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗作為遺傳損傷體內試驗可提供一個包括影響受試物遺傳毒性作用的其他相關因素(吸收、分布、代謝、排泄)的試驗模型，可以另外檢出某些遺傳毒性物質。此研究的三項遺傳毒性試驗是藥物遺傳毒性研究技術指導原則推薦的標準組合：包括體內和體外試驗，從原核到真核細胞，可以全面的檢測三葉白術湯口服液是否具有潛在的遺傳毒性。此研究的三項遺傳毒性試驗均為陰性，表明在此研究試驗條件下，三葉白術湯口服液無遺傳毒性。