氨芐青霉素殘留免疫學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展

張巖蔚，張冬昊，李佳儀，何 擴(kuò)，魏 東

(1. 河北北方學(xué)院食品安全研究中心，河北張家口075000 ； 2. 河北省農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北張家口075000)

隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和食品貿(mào)易國(guó)際化，食品安全問題已成為關(guān)乎人類身體健康和社會(huì)和諧的重要問題。由于抗生素的大量使用，動(dòng)物源性食品中的獸藥殘留問題已經(jīng)引起了全社會(huì)的關(guān)注。

青霉素(Penicillin)類藥物是歷史最悠久的抗菌素，是由青霉菌中提煉出的抗生素，其分子中含有青霉烷，能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁，并在細(xì)菌的繁殖期間有著殺菌的作用。青霉素屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，因其效率高、毒性低等特點(diǎn)[1]，被廣泛應(yīng)用，其中氨芐青霉素是畜牧養(yǎng)殖過程中常用的青霉素類藥物之一，它是在青霉素G側(cè)鏈羧基的α位引入氨基(圖1)，改變其極性，是半合成的青霉素，對(duì)革蘭陰性菌和陽(yáng)性菌均能產(chǎn)生不同程度的抑制作用[2]。由于氨芐青霉素耐酸不耐酶的特性，避免了天然青霉素不宜內(nèi)服的缺點(diǎn)，在臨床中得到了廣泛的應(yīng)用[3]，主要被用于治療鏈球菌和金黃色葡萄球菌感染的如乳腺炎、膿腫、敗血癥，以及其他細(xì)菌、真菌感染的如炭疽、破傷風(fēng)、關(guān)節(jié)炎、放線菌病等畜禽常見疾病。

圖1氨芐青霉素分子結(jié)構(gòu)

氨芐青霉素注射后吸收迅速，血藥濃度較高，但下降也快。就注射的起始濃度而言，皮下注射或肌肉注射均較低，即使增加注射量也達(dá)不到靜脈注射所產(chǎn)生高的血藥濃度。氨芐青霉素吸收后分布均勻，用藥之后在有炎癥的腦脊液、胸腹水等均可達(dá)到有效的藥濃度[4-5]，其中膽汁中藥物濃度遠(yuǎn)比血藥濃度高。

然而隨著氨芐青霉素的大量使用，使得動(dòng)物體內(nèi)的耐藥致病菌很容易感染人類，人們長(zhǎng)期食用含氨芐青霉素殘留的動(dòng)物源性食品后，可造成藥物蓄積，當(dāng)達(dá)到一定濃度后便會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒性作用，如過敏、“三致”(致畸、致癌、致突變)作用等。2006年，高建新[6]等人對(duì)江西省市售的進(jìn)口、國(guó)產(chǎn)的嬰幼兒奶粉以及液態(tài)奶中的抗生素殘留進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：國(guó)產(chǎn)的和進(jìn)口的嬰幼兒奶粉抗生素檢出率分別為34.40%和0.00%，液態(tài)奶的檢出率為15.27%。2015年，Attaie R[7]等發(fā)現(xiàn)牛奶中含有多種抗生素等。氨芐青霉素殘留影響著動(dòng)物源性食品的安全以及畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，直接或間接危害了人類的身體健康和生命安全，對(duì)人類的危害極其之大。因此，檢測(cè)氨芐青霉素殘留是當(dāng)前檢測(cè)動(dòng)物性食品安全的重要指標(biāo)之一，而準(zhǔn)確、快速、大批量的檢測(cè)方法便成為現(xiàn)在最受歡迎的檢測(cè)方法。

目前，國(guó)內(nèi)外用于檢測(cè)氨芐青霉素殘留的方法有很多，主要有理化檢測(cè)法、微生物檢測(cè)法和免疫分析法[8]。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是一項(xiàng)高效、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)技術(shù)，可用于分離高沸點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量大、熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化合物，也用于各種離子的分離分析，從而進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析或者精確的定量分析，適用于殘留藥物的確證；微生物檢測(cè)法是檢測(cè)抗生素殘留較為傳統(tǒng)的一種方法，主要是根據(jù)抗微生物藥對(duì)特異性微生物的生理功能以及代謝過程的抑制作用來定量或定性檢測(cè)樣品中殘留的抗微生物藥類[9]；免疫分析法是根據(jù)抗原或半抗原與相應(yīng)抗體可發(fā)生特異性結(jié)合的性質(zhì)，利用酶或其他有色、發(fā)光物質(zhì)對(duì)特定抗體(或抗原)標(biāo)記使其作為選擇性試劑對(duì)相應(yīng)待測(cè)抗原(或抗體)進(jìn)行定性或定量分析的一種方法。

由于HPLC-MS法前處理較復(fù)雜，所用儀器也較昂貴，并且需要專業(yè)的檢測(cè)人員進(jìn)行操作，難以實(shí)現(xiàn)大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，因此不易進(jìn)行普及；微生物檢測(cè)法雖然原理和操作過程較簡(jiǎn)單，適合于藥物的快速篩選，但是由于其時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)限過高、靈敏度過低、特異性差，因此也不能大量的推廣；而免疫分析法中，由于抗原與抗體分子間具有高度互補(bǔ)的立體化學(xué)、氫鍵、范德華力和疏水區(qū)域的綜合作用，因此具備了任何單獨(dú)的一種理化分析技術(shù)都難以達(dá)到的高選擇性、高特異性和高靈敏度，并且檢測(cè)過程中特別是前處理階段十分簡(jiǎn)單，在大批量、復(fù)雜的介質(zhì)中依舊能進(jìn)行微量痕量組分的檢測(cè)，檢測(cè)速度快，是一種檢測(cè)成本低且相對(duì)獨(dú)立的快速檢測(cè)方法[10]，適合于現(xiàn)場(chǎng)大量樣品的快速篩選，因此被廣泛應(yīng)用。

本文主要對(duì)氨芐青霉素殘留檢測(cè)的必要性和對(duì)氨芐青霉素的免疫學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行了分析。

1 氨芐青霉素殘留的危害及檢測(cè)的必要性

1.1 氨芐青霉素殘留的危害 氨芐青霉素解決了人類的許多問題，如治療消化道、呼吸道感染等，同時(shí)也在治療動(dòng)物疾病、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)以及畜產(chǎn)品質(zhì)量等方面起到了重要作用。但是，隨著氨芐青霉素的廣泛應(yīng)用，總有部分人為了追求更好的治療效果，常出現(xiàn)藥物濫用或超劑量使用的現(xiàn)象，最終導(dǎo)致動(dòng)物源性食品中出現(xiàn)嚴(yán)重的藥物殘留[11]，人長(zhǎng)期食用含氨芐青霉素殘留的動(dòng)物性食品后，可造成藥物蓄積，當(dāng)達(dá)到一定濃度后便會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒性作用，同時(shí)還會(huì)對(duì)畜牧的發(fā)展產(chǎn)生一定的影響，主要有以下幾種：

1.1.1 細(xì)菌耐藥性增強(qiáng) 動(dòng)物機(jī)體長(zhǎng)期反復(fù)食用含有某種抗菌藥物的飼料后，其體內(nèi)敏感菌株受到選擇性的抑制，使機(jī)體內(nèi)的耐藥菌株大量繁殖。而這些含有抗生素殘留的動(dòng)物源性食品被人食用后，人體也會(huì)產(chǎn)生耐藥性菌株，同時(shí)動(dòng)物體內(nèi)的耐藥菌株的耐藥性也有可能轉(zhuǎn)移到人體中，使得一些常用藥物的療效下降甚至失去療效，治愈難度大大增加[12]。以前機(jī)體感染某種病菌，只要服用針對(duì)這種病菌的抗生素便可治愈，而現(xiàn)在這種病菌具有多種抗藥性基因，一種抗生素已經(jīng)起不到作用，必須多種抗生素同時(shí)使用才能治愈[13]。

1.1.2 過敏反應(yīng) 長(zhǎng)期食用抗生素超標(biāo)的動(dòng)物源性食品，會(huì)使部分人群發(fā)生過敏反應(yīng)，輕者出現(xiàn)惡心、嘔吐、皮疹、血壓下降、呼吸困難等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致過敏性休克甚至危及生命。青霉素類藥物引起的過敏性反應(yīng)主要有接觸性皮炎和皮膚反應(yīng)、胃腸道紊亂引起的惡心、嘔吐等。氨芐青霉素屬于半抗原，不能使機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，但它進(jìn)入體內(nèi)后很容易發(fā)生降解或者與蛋白發(fā)生反應(yīng)生成完全抗原，進(jìn)而使機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體[14]。當(dāng)這些被致敏的人長(zhǎng)時(shí)間使用氨芐青霉素超標(biāo)的動(dòng)物源性食品后，機(jī)體中的抗體便會(huì)和氨芐青霉素結(jié)合生成抗原抗體復(fù)合物，從而致使人發(fā)生過敏反應(yīng)，過敏性反應(yīng)一般發(fā)生在用藥后20 min內(nèi)。

1.1.3 腸道菌群失調(diào) 人體內(nèi)正常會(huì)寄生著大量的菌群，主要分為敏感菌和不敏感菌兩種，它們的存在對(duì)身體的健康起著重要的作用[15]。一旦機(jī)體長(zhǎng)期與動(dòng)物源性食品中殘留抗生素接觸，就會(huì)使一些敏感性非致病菌被抑制或死亡，不敏感的耐藥菌或條件性致病菌大量生長(zhǎng)繁殖導(dǎo)致雙重感染，擾亂腸道微生物平衡，從而導(dǎo)致長(zhǎng)期的腹瀉或引起維生素的缺乏等反應(yīng)，同時(shí)還容易造成病原菌的交替感染，使得具有選擇性作用的抗生素及其他化學(xué)藥物失去療效。

1.1.4 影響乳制品的發(fā)酵 氨芐青霉素對(duì)熱的穩(wěn)定性比其他常用的抗生素都好，一般的加熱殺菌根本起不到破壞作用[28]。從乳品加工的角度來看，原料乳中抗生素殘留嚴(yán)重干擾發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)，可嚴(yán)重影響干酪、黃油、發(fā)酵乳的起酵和后期風(fēng)味的形成[16]。酸牛乳生產(chǎn)過程中所用的發(fā)酵劑嗜熱鏈球菌是一種乳酸菌，青霉素對(duì)其的抑制最為強(qiáng)烈，一般情況下，當(dāng)青霉素含量達(dá)到0.05 IU/mL～0.10 IU/mL時(shí)便會(huì)影響乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，而含量達(dá)到1 IU/mL時(shí)乳酸菌的生長(zhǎng)會(huì)被完全抑制[17]，牛乳酸化凝結(jié)進(jìn)程明顯變慢。

1.1.5 影響畜牧的正常發(fā)展 長(zhǎng)期濫用抗生素嚴(yán)重制約著畜牧業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，如長(zhǎng)期使用抗生素容易造成畜禽機(jī)體免疫力下降，影響疫苗的接種效果；還可引起畜禽內(nèi)源性感染和二重感染；使得以往較少發(fā)生的細(xì)菌病(大腸埃希菌、葡萄球菌、沙門菌)轉(zhuǎn)變成為家禽的主要傳染病。此外，耐藥菌株的增加，使有效控制細(xì)菌疫病變得越來越困難。

1.2 氨芐青霉素殘留檢測(cè)的必要性 氨芐青霉素殘留影響著動(dòng)物源性食品的安全以及畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，直接或間接危害了人類的身體健康和生命安全，對(duì)人類的危害極其之大，最后的結(jié)果也是十分嚴(yán)重。因此，想要讓人們放心的食用動(dòng)物源性食品，必須完善畜產(chǎn)品安全質(zhì)量的保障措施，對(duì)動(dòng)物源性食品的獸藥殘留進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)管，進(jìn)而對(duì)有害的動(dòng)物性食品進(jìn)行處理，防止其流入市場(chǎng)。加強(qiáng)氨芐青霉素藥物的監(jiān)控，重點(diǎn)搞好藥物的殘留檢測(cè)及分析方法，對(duì)保障畜產(chǎn)品質(zhì)量、維護(hù)人體健康、保護(hù)人類賴以生存的生態(tài)環(huán)境具有重要意義[18]。世界各國(guó)對(duì)氨芐青霉素在動(dòng)物源性食品中制定了最高殘留限量(MRL)。歐盟藥典規(guī)定的氨芐青霉素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)4 μg/kg，1997年日本制定了抗生素在牛奶中的MRL為0.1 mg/kg，我國(guó)農(nóng)業(yè)部2002年也規(guī)定了氨芐青霉素在牛奶中的MRL是10 μg/kg，在可食組織中的MRL為50 μg/kg[19]。雖然我國(guó)制定了《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》以及《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》，但是抗生素殘留現(xiàn)象依舊十分嚴(yán)重，建立一種準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的氨芐青霉素殘留免疫檢測(cè)方法是十分必要的。

2 氨芐青霉素殘留的免疫檢測(cè)技術(shù)

免疫反應(yīng)即是抗原-抗體反應(yīng)，其最大特點(diǎn)是具有高靈敏度和強(qiáng)特異性，抗原抗體復(fù)合物的親和指數(shù)通常為109或者更高。免疫檢測(cè)技術(shù)主要是以抗原與抗體的特異可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)。

氨芐青霉素是一種小分子的半抗原，雖然能夠與抗體結(jié)合，但是不能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，必須和一種載體蛋白結(jié)合，偶聯(lián)成為全抗原后才能作為免疫原免疫小鼠。載體蛋白物質(zhì)由于分子量較大，并且有較好的異源性，與獸藥偶聯(lián)后可使動(dòng)物的免疫系統(tǒng)發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)，其主要有牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、人血清蛋白(HAS)等。然而在選擇載體蛋白時(shí)，應(yīng)盡量減少蛋白造成的背景干擾[20]。為了防止蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，應(yīng)在條件溫和的水溶液中進(jìn)行小分子物質(zhì)與載體蛋白的偶聯(lián)反應(yīng)，盡量避免高溫、強(qiáng)酸堿等極端環(huán)境。

氨芐青霉素和大分子蛋白質(zhì)偶聯(lián)主要有兩種方式：第一種是利用待測(cè)獸藥上已有的活性基團(tuán)(-COOH、-NH2、-OH、-SH、鹵素等)，通過雙功能試劑，如NH2(CH2)nC(x)H、戊二醛、琥珀酸酐等，引入連接臂和活性基團(tuán)，使之與載體蛋白偶聯(lián)，此方法比較容易實(shí)施，但是如果這些活性基團(tuán)代表著其特征結(jié)構(gòu)或偶聯(lián)后改變了分子的電子分布，便會(huì)影響抗體對(duì)待測(cè)獸藥的識(shí)別；第二種方法是直接合成帶有-(CH)nCOOH、-(CH)nNH2等結(jié)構(gòu)的待測(cè)獸藥的衍生物，這種方法有利于保護(hù)待測(cè)獸藥的特征結(jié)構(gòu)，使分子的電子分布不受影響，但是合成過程較復(fù)雜，一般需要多步反應(yīng)才能合成[21]。偶聯(lián)的方法一般由半抗原上的活性基團(tuán)所決定，主要有碳二亞胺法、戊二醛法、琥珀酸酐法、混合酸酐法、重氮化法等，其中碳二亞胺法、混合酸酐法用于羧基半抗原與載體的偶聯(lián)，戊二醛法、重氮化法用于氨基半抗原與載體的偶聯(lián)，琥珀酸酐法用于帶有羥基的半抗原與載體的偶聯(lián)。

目前常用的免疫分析方法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、熒光免疫檢測(cè)方法(FIA)、膠體金免疫層析法(CGIA)、免疫傳感器分析法(ISA)等。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 酶聯(lián)免疫吸附法是酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)，主要是以固相材料為載體來吸附抗原或抗體的一種免疫分析方法，最早在1971年由Weemen和Perlmann分別提出，該方法具有靈敏度高、特異性好、檢測(cè)成本低、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、生物、化學(xué)等方面。該方法主要是將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體的表面，使其保持免疫活性，然后將抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既有酶的活性又具有與固相載體表面抗體或抗原特異性結(jié)合的活性，最后加入酶的底物，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與樣品中被檢物質(zhì)的量具有直接的關(guān)系，所以可以根據(jù)顏色的深淺來進(jìn)行定性或定量分析。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的機(jī)理不同，ELISA可分為直接法、間接法、雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法4種，其中雙抗體夾心法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原；競(jìng)爭(zhēng)法可用于抗原和半抗原的測(cè)定，也可用于抗體的測(cè)定，其測(cè)抗體有多種模式，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)。

陸彥[10]采用碳二亞胺法將氨芐青霉素與匙孔嘁血藍(lán)蛋白(mc KLH)偶聯(lián)制備免疫抗原，與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)制備包被抗原，利用間接酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)Amp-KLH 偶聯(lián)物免疫小鼠產(chǎn)生的抗體進(jìn)行檢測(cè)，建立了對(duì)氨芐青霉素的ELISA檢測(cè)方法。采用間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA 方法建立檢測(cè) Amp 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.5 ng/mL～100 ng/mL 范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，回歸方程為 y=0.0569x+0.1308，R2=0.9948。

張正挺等[22]利用競(jìng)爭(zhēng)法將青霉素酶包被在酶標(biāo)板上，通過氨芐青霉素與辣根過氧化物酶的連接制備了酶結(jié)合物，經(jīng)過配方的優(yōu)化開發(fā)出檢測(cè)牛乳中氨芐青霉素含量的檢測(cè)試劑盒，其靈敏度達(dá)到了4 μg/kg。

2.2 熒光免疫檢測(cè)方法(FIA) 熒光免疫檢測(cè)方法作為免疫分析法的一種，由于熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測(cè)或定位各種抗原，也可與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測(cè)或定位抗體，但在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)應(yīng)用很少，因此，也被稱為熒光抗體技術(shù)?？贵w與熒光素結(jié)合后并不影響其與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，用熒光素標(biāo)記的抗體與切片中組織細(xì)胞中的抗原相結(jié)合，若熒光標(biāo)記抗體與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，則洗滌分離后不會(huì)被緩沖液沖掉，然后用熒光檢測(cè)儀觀察抗原抗體復(fù)合物的特異性熒光強(qiáng)度，進(jìn)而對(duì)樣品中微量或超微量物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定。FIA操作簡(jiǎn)單，現(xiàn)象直觀，可進(jìn)行示蹤觀察，具有專一性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，被用于測(cè)量含量較低的生物活性化合物。熒光免疫檢測(cè)方法主要分為非均相熒光免疫測(cè)定和均相熒光免疫測(cè)定，其中非均相熒光免疫測(cè)定又包括時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定(TRFIA)和熒光酶免疫測(cè)定，均相熒光免疫測(cè)定包括熒光偏振免疫測(cè)定(FPIA)等。由于熒光免疫分析法背景熒光干擾較大，因此需選擇合適的熒光試劑以及合適的樣品處理方法以減少非特異性吸附蛋白的影響。

王云云[23]選擇熒光發(fā)射波長(zhǎng)分別為520 nm、565 nm和610 nm的3種量子點(diǎn)通過共價(jià)鍵偶聯(lián)作用分別標(biāo)記鏈霉素、四環(huán)素和青霉素G的抗體，從而獲得3種量子點(diǎn)抗體探針,即OD520-抗鏈霉素抗體、OD565-抗四環(huán)素抗體和OD610-抗青霉素G抗體，以3種量子點(diǎn)抗體探針為基礎(chǔ)建立了直接競(jìng)爭(zhēng)熒光免疫分析法，通過對(duì)免疫條件的分析得到最佳條件，采用陣列分析模式實(shí)現(xiàn)了對(duì)鏈霉素、四環(huán)素和青霉素G的同時(shí)靈敏的可視化檢測(cè)，研究出3種抗生素檢測(cè)的線性范圍分別為0.01～25 ng/mL、0.01～25 ng/mL和0.01～10 ng/mL，檢測(cè)限均達(dá)到了0.005 ng/mL。本研究建立的方法比其他分析牛奶中相應(yīng)3種抗生素的方法具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確度。

2.3 膠體金免疫層析法(GICA) 膠體金免疫標(biāo)記技術(shù)創(chuàng)于20世紀(jì)70年代，主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處可在顯微鏡下看到黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)可肉眼看見紅色或粉紅色斑點(diǎn)。由于膠體金具有肉眼可觀測(cè)的紅色，便以膠體金作為示蹤標(biāo)志物或顯色劑，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金免疫層析法是膠體金標(biāo)記技術(shù)和蛋白質(zhì)層析技術(shù)的結(jié)合，是以條狀纖維層析材料為固相，將各種反應(yīng)試劑分點(diǎn)固定在測(cè)試板上，通過毛細(xì)管作用使樣品溶液在層析條上移動(dòng)，使樣品中的待測(cè)物與層析材料上針對(duì)待測(cè)物的受體發(fā)生高特異性和高親和性的免疫反應(yīng)，形成的復(fù)合物被富集或固定在層析條上的特定區(qū)域(檢測(cè)線)，通過酶反應(yīng)或直接形成肉眼可見的標(biāo)記物膠體金，一般只需幾分鐘就能得到準(zhǔn)確結(jié)果。膠體金免疫層析檢測(cè)技術(shù)具有使用方便、檢測(cè)時(shí)間短、穩(wěn)定性好以及生產(chǎn)成本和檢測(cè)成本均較低等優(yōu)點(diǎn)，在臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)、激素檢測(cè)、食品安全檢測(cè)、藥物殘留和毒品快速檢測(cè)以及抗原抗體分析等諸多領(lǐng)域有著迅速的發(fā)展。

張鴻等[24]利用鞣酸還原法制得的膠體金標(biāo)記氨芐青霉素單克隆抗體，對(duì)建立膠體金免疫層析快速檢測(cè)氨芐青霉素殘留方法進(jìn)行研究。成品試紙條PBS中氨芐青霉素的檢測(cè)限為50 ng/mL，牛奶加標(biāo)樣品中氨芐青霉素的檢測(cè)限為100 ng/mL，檢測(cè)范圍在0～1 000 ng/mL。

孫志文等[25]應(yīng)用膠體金免疫層析法對(duì)牛奶中的β-內(nèi)酰胺類抗生素和三聚氰胺殘留進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，其檢測(cè)限分別為青霉素G 2 μg/L、氨芐青霉素3 μg/L、阿莫西林4 μg/L、鄰氯青霉素6 μg/L、雙氯青霉素6 μg/L、三聚氰胺50 μg/L，假陽(yáng)性率不大于5%，假陰性率為0，特異性好，與牛奶中其他抗生素?zé)o交叉反應(yīng)。

2.4 免疫傳感器分析法(ISA) 免疫傳感器作為一種新興的生物傳感器，主要以鑒定物質(zhì)的高度特異性、敏感性和穩(wěn)定性的特點(diǎn)受到人們廣泛的青睞。它是將傳統(tǒng)胡免疫測(cè)試和生物傳感技術(shù)結(jié)合起來，將兩者的優(yōu)點(diǎn)采納，不僅減少了分析時(shí)間、提高了靈敏度和測(cè)試準(zhǔn)確度，也使得測(cè)定過程變得簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，減少了對(duì)使用者及環(huán)境技術(shù)條件的依賴，在現(xiàn)場(chǎng)或野外進(jìn)行快速篩選測(cè)定有著廣闊的應(yīng)用前景。傳感器的生物敏感層與復(fù)雜樣品中待測(cè)的目標(biāo)分析物之間通過抗體與抗原之間的識(shí)別功能，產(chǎn)生一些物理化學(xué)信號(hào)，如顏色、光、熱、電化學(xué)等變化，通過不同原理的傳感器，如光敏管、熱敏電阻、壓電裝置、光極、離子選擇性電極等將其轉(zhuǎn)換成第二信號(hào)，經(jīng)放大后顯示結(jié)果或記錄。利用氨芐青霉素與特異性抗體結(jié)合反應(yīng)的特性研制出的免疫傳感器，可用于氨芐青霉素藥物殘留進(jìn)行快速定量定性檢測(cè)[3]。

王明華等[26]針對(duì)動(dòng)物性食品安全問題中的青霉素獸藥殘留快速檢測(cè)的免疫傳感器分析法進(jìn)行研究，主要關(guān)注直接固定抗體、直接檢測(cè)方法的性能穩(wěn)定性。通過采用分子模擬的研究方法對(duì)其可能的影響操作步驟和檢測(cè)條件-牛血清白蛋白封閉的過程進(jìn)行深入探索，以固定抗體的活性，改進(jìn)免疫傳感器的構(gòu)建方式，獲得較穩(wěn)定的性能。免疫傳感器采用硫辛酸自組裝單分子層膜將氨芐青霉素抗體固定于壓電金電極上作為生物識(shí)別元件、以石英晶體微天平作為檢測(cè)器構(gòu)建，對(duì)不同封閉過程產(chǎn)生的影響進(jìn)行研究，比較免疫傳感器實(shí)物試驗(yàn)與分子模擬的研究結(jié)果。

張婉潔等[27]提出了一種新的利用基于表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)的生物光學(xué)傳感器檢測(cè)多種殘留物的方法。通過引入分子標(biāo)記技術(shù)，在修飾有羧甲基葡聚糖的芯片表面固定一層抗分子標(biāo)記物BSA的抗體，通過對(duì)待測(cè)樣品的孵育，使其對(duì)多種殘留物的檢測(cè)轉(zhuǎn)化為對(duì)同一標(biāo)記物的檢測(cè)。使用分子標(biāo)記物BSA對(duì)卡那霉素、三聚氰胺、氨芐青霉素和鏈霉素進(jìn)行標(biāo)記，并對(duì)其水溶液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限分別為50 μg/L，10 μg/L、1.25 μg/L 和10 μg/L，均低于各自的最大殘留檢測(cè)限(MRL)。該檢測(cè)方法解決了競(jìng)爭(zhēng)抑制法在檢測(cè)時(shí)傳感器專一性的問題，實(shí)現(xiàn)了傳感器的通用性，同時(shí)也可以推廣到其他免疫法檢測(cè)的領(lǐng)域，使免疫傳感器、免疫試紙等通用性增強(qiáng)。

3 展望

氨芐青霉素是治療動(dòng)物疾病的常用β-內(nèi)酰胺類抗生素類藥物之一，在動(dòng)物源性食品中的殘留對(duì)人類有著嚴(yán)重的危害，因此AMP殘留的檢測(cè)越來越受到重視，選擇特異性強(qiáng)、靈敏度高、高效快速的檢測(cè)方法尤其重要。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法樣品前處理較復(fù)雜，并且需要大型儀器，而免疫分析技術(shù)的引用解決了這些問題，實(shí)現(xiàn)了在線、實(shí)時(shí)、檢出限低、靈敏度高、選擇性好、可大批量制備的快速檢測(cè)。例如ELISA法的取樣量小、前處理簡(jiǎn)單，不需要大型儀器，檢出限與HPLC-MS不相上下，而分析效率則是HPLC-MS的幾十倍以上。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有許多商品化的試劑盒，取得了巨大的成就，但是還存在難以實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的問題。隨著科學(xué)技術(shù)的日益進(jìn)步，試驗(yàn)儀器的便捷化、微型化成了檢測(cè)方法的發(fā)展趨勢(shì)，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)在氨芐青霉素藥物殘留檢測(cè)方面必然會(huì)有更廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。