八味中藥及其復(fù)方對雞大腸桿菌的體外抑制試驗(yàn)

鹿 意，梁 曉，秦志華，張啟迪

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東青島266109)

大腸桿菌屬于革蘭陰性菌，是寄生在腸道內(nèi)的正常菌群。在一定條件下，一些血清型的大腸桿菌能引起一系列的感染，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失[1-2]。雞大腸桿菌病在國內(nèi)中小規(guī)模養(yǎng)殖場普遍存在，發(fā)病率較高，已成為高危害疾病之一[3]。獸醫(yī)臨床上主要應(yīng)用喹諾酮類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類等藥物預(yù)防和治療大腸桿菌病[4]。在防治過程中，抗生素的大量使用，使新的耐藥菌株不斷出現(xiàn)，導(dǎo)致耐藥譜不斷擴(kuò)大，甚至研制出的新型抗生素對于一些菌株也表現(xiàn)出極強(qiáng)的耐藥性，導(dǎo)致在養(yǎng)殖業(yè)中形成了惡性循環(huán)[5]。國內(nèi)外對大腸桿菌的耐藥性均有過報道，不僅威脅家畜，就連野生動物也幸免不了，因此，世界各國均十分重視大腸桿菌的耐藥性問題[6]。

中藥與化藥相比，純天然且易于獲取，毒副作用較小，耐藥性相對較低，能增強(qiáng)動物機(jī)體的抵抗力，從而獲得越來越多的研究者們的青睞。因此，本試驗(yàn)選用金銀花、黃連、五味子、連翹、大黃、黃芩、黃柏、白頭翁等中藥，通過一系列試驗(yàn)來進(jìn)一步研究其對抗大腸桿菌的效果，為臨床研發(fā)新的高效、低毒的中藥復(fù)方制劑來有效的防治大腸桿菌病提供參考[1]。對克服抗生素帶來的大腸桿菌的耐藥性、提高我國畜產(chǎn)品在國際上的競爭力具有十分重要的意義[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 金銀花、黃連、五味子、連翹、大黃、黃芩、黃柏、白頭翁，所有藥材，均購自國風(fēng)大藥房城陽藥店。

1.1.2 培養(yǎng)基 普通營養(yǎng)肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂，均購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 菌株 雞大腸桿菌菌株來自本研究室從患病畜禽病料中分離、鑒定和保存的優(yōu)勢菌株。

1.2 方法

1.2.1 中藥的制備 中藥各稱取50 g放入燒杯中加600 mL蒸餾水，武火加熱至沸騰然后文火加熱，時間持續(xù)1 h并用玻璃棒不斷攪拌，加熱完成后用8層紗布過濾；取藥渣，再倒入500 mL蒸餾水，步驟同上。過濾合并濾液，并加熱濃縮至1 g/mL，室溫放置24 h，10 000 r/min離心5 min，取上清液，高壓滅菌，置4 ℃中保存。1.2.2 培養(yǎng)基的制備 普通LB肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基均按常規(guī)方法配制，4 ℃保存待用。

1.2.2 單味中藥的抑菌試驗(yàn) 打孔法：取100 μL供試菌均勻的涂布于營養(yǎng)瓊脂上，放置15 min后在營養(yǎng)瓊脂上用直徑6 mm的打孔器均勻打孔，除去瓊脂塊，加入的藥液以滿而不溢為原則，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑，設(shè)置LB肉湯為陰性對照。

藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)抑菌圈直徑大于15 mm時為高敏；介于10～15 mm間時為中敏；小于 10 mm 時為低敏[8]。

1.2.3 中藥復(fù)方的篩選及抑菌試驗(yàn) 制備中藥復(fù)方水提液：把黃連、黃芩、五味子、金銀花提取液按1∶1∶1∶1、1∶2∶2∶1、1∶1∶3∶1、2∶1∶2∶1、1∶2∶2∶1、1∶1∶2∶1、3∶1∶3∶1、3∶1∶1∶1的不同比例配伍，依次命名為復(fù)方Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ，此試驗(yàn)制得的藥物的濃度為1 g/mL，10 000 r/min離心5 min后過濾，高壓滅菌后4 ℃保存。復(fù)方中藥的抑菌試驗(yàn)與1.2.3同。

1.2.4 MIC和MBC的測定 選用二倍稀釋法，具體步驟見表1。取0.1 mL稀釋好的菌液(2×109CFU/mL )加入上述1～7號及9號試管中，恒溫培養(yǎng)24 h。取MIC的平均值作為試驗(yàn)數(shù)據(jù)來判定復(fù)方中藥的體外抑菌效果。無細(xì)菌生長的最低藥物濃度管即為最小抑菌濃度(MIC)[9]。測最小殺菌濃度(MBC)值時，選取沒有細(xì)菌生長的培養(yǎng)物，接種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)(37 ℃)18 h。培養(yǎng)基內(nèi)生長的菌落數(shù)≤ 5的最小藥物濃度，即為藥物的MBC[10]。

2 結(jié)果

2.1 單味中藥抑菌結(jié)果 八味中藥對大腸桿菌均表現(xiàn)出不同程度的抑菌效果，其中五味子的抑菌效果最佳，抑菌直徑為25.1 mm±2.06 mm，屬高度敏感；黃連、金銀花、連翹為中敏；抑菌直徑分別為12.9 mm±0.59 mm、11.3 mm±0.35 mm、10 mm±0.74 mm，其余均為低度敏感，具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 單味中藥抑菌結(jié)果

2.2 復(fù)方中藥抑菌結(jié)果 所有的復(fù)方制劑在體外均表現(xiàn)出了一定的抑菌效果，復(fù)方Ⅵ效果最明顯，其抑菌直徑為28.5 mm±1.02 mm，具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 復(fù)方中藥抑菌結(jié)果

2.3 中藥MIC、MBC測定結(jié)果 各單味中藥和復(fù)方中藥的MIC和MBC值見表4，其中五味子的MIC值為7.812 mg/mL，MBC值為7.812 mg/mL，抑菌效果較強(qiáng)，明顯高于其他中藥，其次是黃連和連翹，也表現(xiàn)出了較好的抑菌效果。復(fù)方Ⅵ的抑菌效果強(qiáng)于其他復(fù)方，MIC為15.625 mg/mL，MBC為31.25 mg/mL。

表4 中藥MIC、MBC測定結(jié)果 (mg/mL)

3 討論

本試驗(yàn)中所得的中藥抑菌直徑與相關(guān)文獻(xiàn)[11-13]有一定差異，原因可能有以下幾個方面：一是所用大腸桿菌來源不同，如向雙云等所用大腸桿菌K88來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，趙恒章等所用大腸桿菌是直接從病(死)豬分離，王鐵良所用大腸桿菌是從臨近雞場病料中分離得到； 二是中藥的提取方法不同致使抑菌結(jié)果有所差異；三是所用的菌液的濃度也會對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，上述因素均可能導(dǎo)致抑菌直徑偏大或偏小，為減少試驗(yàn)中不確定因素對試驗(yàn)結(jié)果造成的影響，應(yīng)對中藥的提取方法進(jìn)行完善，并設(shè)置平行試驗(yàn)。

本試驗(yàn)通過肉湯稀釋法對中藥的MIC值進(jìn)行測定，由于中藥成分復(fù)雜，可能是組方中單味中藥發(fā)揮了抑菌作用，也可能是多為中藥共同發(fā)揮作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方制劑Ⅵ對大腸桿菌體外抑菌作用最好，MIC為15.625 mg/mL；復(fù)方制劑Ⅰ和Ⅷ 對大腸桿菌的體外抑菌作用最低，MIC 均為62.5 mg/mL。本試驗(yàn)通過配制八組中藥復(fù)方制劑水提物，根據(jù)藥敏試驗(yàn)、MIC及MBC測定結(jié)果得出，中藥復(fù)方制劑的抑菌作用均優(yōu)于單味中藥，可為臨床上研發(fā)抗大腸桿菌病的中藥復(fù)方制劑提供參考。