豬偽狂犬病病毒的檢測及主要毒力基因的分子特征分析

何小莉，梁海英，曾智勇，湯德元，王 彬，黃 濤，張愛瓊，咸 文

(貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025)

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病病毒引起的一種高度接觸性傳染病，主要以新生仔豬的急性死亡以及4周齡以上仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，妊娠母豬繁殖障礙、流產(chǎn)、死胎及呼吸道癥狀為特征[1]。自1902年匈牙利首次發(fā)現(xiàn)該病以來已廣泛分布于世界各地，1974年傳入我國，至今全國已有 30多個省份發(fā)生流行，是嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一[2]。偽狂犬病病毒(Pseudorabiesviurs，PRV)屬皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科，水痘病毒屬，雙鏈DNA病毒，全長約150 kb，基因組GC含量最高達(dá)73%，基因組編碼約100種蛋白質(zhì)，成熟的病毒粒子約含有50種蛋白質(zhì)[3]。gE和TK基因是PRV主要毒力基因，但不是病毒增殖所必需的。gE基因在促進(jìn)感染細(xì)胞向鄰近非感染細(xì)胞融合，介導(dǎo)病毒在細(xì)胞間擴散起作用，TK基因所編碼的胸苷激酶與病毒在神經(jīng)組織中增殖有關(guān)[4]。自2011年以來，由于變異毒株的出現(xiàn)導(dǎo)致豬偽狂犬病發(fā)生率逐漸上升，也給本省養(yǎng)豬業(yè)造成了一定的經(jīng)濟損失。本試驗通過對貴州省某規(guī)模化豬場疑似豬偽狂犬病發(fā)病豬進(jìn)行病理剖檢病變觀察及PCR檢測，并對其主要毒力基因(gE、TK基因)進(jìn)行克隆測序及遺傳進(jìn)化分析，旨在為豬偽狂犬病的檢測及相關(guān)基因遺傳變異狀況提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 貴州省丹寨地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)殖場送檢的疑似PRV感染后發(fā)病死亡豬1頭。

1.2 試驗主要材料 大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司； pMD19-T載體、DL-2 000 Marker、DNA抽提試劑盒及LATaqDNA聚合酶，購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒，購自O(shè)MEGA公司。

1.3 引物 根據(jù)在GenBank中已發(fā)表的豬偽狂犬病毒PRV Fa株(KM189913.1)gE和TK基因序列，利用Oligo 5.0設(shè)計2對引物并委托TaKaRa公司合成，引物序列分別為gE-F1：5′-GGGGTACCATGCGGCCCTTTCTGCT-3′；gE-R1：5′-CCGGAATTCTTAAGCGGGGCGGGACAT-3′；TK-F2：5′-TTTGAATTCGCGGCACGTCTTGAGCTCGA-3′；TK-R2：5′-TTTAAGCTTCGCCGACCAGGACGAACAGG-3′。

1.4 病豬剖檢及病原檢測 無菌剖檢發(fā)病死豬，觀察其組織病理病變，適量取其心、肝、脾、肺、腎、腦等組織混合研磨，反復(fù)凍融3次后，取上清，用DNA抽提試劑盒提取核酸，用PRVgE特異性引物進(jìn)行PCR檢測，反應(yīng)結(jié)束后，分別取7 μL擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，并記錄結(jié)果。

1.5 PRV GZDZ2016株gE和TK基因的克隆及序列分析 以組織核酸為模板進(jìn)行PRVgE及TK基因的PCR擴增，分別將PCR產(chǎn)物純化回收后連接于pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，將重組質(zhì)粒送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。用DNAStar軟件對PRV GZDZ2016株的測序結(jié)果與參考毒株的gE、TK基因的序列分別進(jìn)行基因分子特征分析及核苷酸、氨基酸同源性分析，并用MEGA7.0繪制遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 剖檢病理變化及病原檢測結(jié)果 剖檢病死豬可見皮膚散布出血點(見中插彩版圖1)，脾臟表面有許多散在大小不一顆粒狀的白色壞死點(見中插彩版圖2)，肝臟出現(xiàn)大面積瘀斑、且表面有白色壞死灶(見中插彩版圖3)，肺臟有瘀斑且間質(zhì)增寬(見中插彩版圖4)。將各組織器官經(jīng)過處理后，提取核酸用PRVgE特異性引物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，病料中檢出PRVgE特異性核酸陽性條帶，且與預(yù)期大小相符。

2.2gE、TK全基因PCR擴增及鑒定gE、TK全基因PCR擴增結(jié)果顯示擴增片段大小與預(yù)期條帶相符，分別得到約1 800 bp和1 500 bp大小的目的條帶(圖5)?？寺≠|(zhì)粒經(jīng)雙酶切和PCR鑒定后，并將陽性重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

2.3gE和TK基因序列分析

2.3.1gE基因分子特征分析gE基因的核苷酸序列分析結(jié)果顯示，PRV GZDZ2016株的gE基因序列與參考毒株核苷酸序列同源性在97.6%～99.9%，其中與HN1201、HXN、JX-2012、GA株的同源性最高；PRV GZDZ2016株的gE基因序列與參考毒株氨基酸序列同源性在95.7%～99.8%，氨基酸序列分析結(jié)果表明，PRV GZDZ2016株gE基因所編碼的氨基酸與PRV Fa標(biāo)準(zhǔn)株氨基酸序列相比，48位和496位均各有一個天冬氨酸(D)的插入，第236位由亮氨酸(L)變?yōu)楦彼?P)。

圖5 PRV GZDZ 2016株 gE、TK全基因序列的PCR擴增

遺傳進(jìn)化樹結(jié)果顯示，gE基因的遺傳樹明顯分為2個大群。其中PRV GZDZ2016株與文獻(xiàn)報道的變異代表株處在于同一分支上，與國內(nèi)早期的分離株共同構(gòu)成一個亞群；國外的毒株形成另外一個大的分支，與國內(nèi)的經(jīng)典毒株相距較遠(yuǎn)(圖6)，進(jìn)一步說明了該毒株具有變異毒株特征，且與國外流行毒株和國內(nèi)經(jīng)典毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖6 PRV GZDZ2016株gE基因遺傳進(jìn)化樹

2.3.2TK基因分子特征分析TK基因的核苷酸序列分析結(jié)果顯示，PRV GZDZ2016株TK基因與疫苗株Bartha株的核苷酸相似性和氨基酸同源性分別為99.4%、98.8%；與國外的Becker、Kaplan、NIA3等株之間的核苷酸相似性和氨基酸同源性分別為99.4%～99.6%和98.8%～99.4%；與國內(nèi)近幾年分離毒株JS-2012、HeN1、TJ等株之間的核苷酸相似性和氨基酸同源性分別為99.5%～99.8%和98.8%～99.4%；其中與HN1201、HeN1、JS-2012、TJ、HBCL-2012、BJ/YT株的同源性最高。氨基酸序列分析結(jié)果表明，TK基因所編碼的氨基酸則第6位氨基酸由異亮氨酸(I)變?yōu)楸彼?A)，第157位氨基酸由天冬氨酸(D)變?yōu)楦拾彼?G)。

遺傳進(jìn)化樹結(jié)果顯示，TK基因可分為4個基因群，本研究的PRV GZDZ2016株與國內(nèi)分離的大多數(shù)毒株構(gòu)成基因1群，國內(nèi)部分毒株與國外分離株構(gòu)成另外3個基因群(圖7)。

圖7 PRV GZDZ2016株TK基因遺傳進(jìn)化樹

3 討論

目前，豬偽狂犬病疫情形勢嚴(yán)峻，2012年以來在中國多個省份許多使用PRV基因缺失活疫苗進(jìn)行免疫的規(guī)?；i場出現(xiàn)了豬狂犬病的流行，并從已免疫過疫苗的豬群分離到PRV變異毒株。gE和TK基因是PRV主要毒力基因，gE基因在促進(jìn)感染細(xì)胞向鄰近非感染細(xì)胞融合，介導(dǎo)病毒在細(xì)胞間擴散起作用[5]；TK基因失活，則PRV對宿主的毒力喪失或顯著下降[6]。因此，對貴州省PRV臨床流行毒株的gE、TK基因的克隆分析，將有利于掌握貴州省PRV流行株的遺傳變異情況。

本研究通過病理剖檢、PCR鑒定及序列分析等方法，證實送檢發(fā)病豬由于感染PRV致死，并將該感染毒株命名為PRV GZDZ2016株。對該毒株gE全序列分析結(jié)果顯示，gE基因氨基酸的第48位和第496位各存在1個天冬氨酸(D)的插入，這兩個位點的變化與此前報道的HN1201[7]、TJ[8]等變異毒株具有相同的變異模式，表明 PRV GZDZ2016株為PRV變異毒株，同時第236位點出現(xiàn)L→P的突變，這個氨基酸位點位于gE抗原表位E區(qū)，該突變是否會對PRV的毒力或gE抗原性發(fā)生漂移尚需進(jìn)一步研究。對該毒株TK基因的序列分析結(jié)果表明，最具特征性的是PRV GZDZ2016株TK基因核苷酸序列第17位和470位出現(xiàn)了獨特性的堿基突變，第17位由T→C，第470位由 A→G，并造成第6位氨基酸由 I→A 和第157位氨基酸由D→G。Darb等研究認(rèn)為5-18aa區(qū)間為ATP結(jié)合位點，該區(qū)域?qū)K蛋白的催化功能十分重要[9]，上述PRV GZDZ2016株TK基因氨基酸序列第6 位氨基酸由I→A，因此，TK基因在該位點的突變可能會對 PRV 的毒力產(chǎn)生一定的影響。

基于PRV GZDZ2016株gE、TK基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，PRV GZDZ2016株與2012年以來國內(nèi)分離的PRV變異毒株及國內(nèi)經(jīng)典毒株的親緣關(guān)系較近，而與國外毒株的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，綜上所述，本研究的PRV GZDZ2016株具有一定的當(dāng)前PRV流行株的代表性，屬于PRV變異毒株。PRV GZDZ2016株的分子特征將對變異株的分子流行病學(xué)調(diào)查提供重要的參考，以更好地對豬偽狂犬病的診斷和防控提供科學(xué)依據(jù)。