鄭州市奶牛場奶牛子宮內膜炎病原菌分離和鑒定

王 軍，宋予震，皇甫和平，石冬梅

(河南牧業(yè)經濟學院動物醫(yī)學院，河南鄭州450046)

近幾年，隨著我國貯運加工技術的提高和市場經濟的帶動，乳業(yè)的發(fā)展越來越快，繼而奶牛養(yǎng)殖業(yè)也加快了發(fā)展的步伐，奶牛養(yǎng)殖數(shù)量與日俱增，養(yǎng)殖場的規(guī)模逐漸增大，隨之而來出現(xiàn)了不同規(guī)模的養(yǎng)殖場，但是，隨著養(yǎng)殖數(shù)量和養(yǎng)殖場規(guī)模的改變，奶牛疾病也越來越趨于復雜化，繁殖障礙性疾病也越來越多，奶牛子宮內膜炎就是其中之一。奶牛子宮內膜炎是主要的產科疾病，大多數(shù)是由于圍產期奶牛病原微生物感染所引起的一種繁殖障礙性疾病，主要導致產犢間期延長、產奶量降低、牛奶質量降低，進而影響奶牛的繁殖性能，也是奶牛不孕不育的主要原因之一，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的后果，經濟損失嚴重。由于子宮內膜炎不出現(xiàn)全身性的發(fā)熱、炎癥、采食量下降和疼痛等臨床癥狀，特別是隱性子宮內膜炎，易被飼養(yǎng)者忽視，造成奶牛產奶量降低，淘汰率升高的主要原因[1]。為了解和掌握該病的發(fā)生、流行現(xiàn)狀和致病因素，有效的防治子宮內膜炎的發(fā)生和保障乳業(yè)的健康發(fā)展[2]。因此，本課題組于2016年5月至2017年4月期間，抽取鄭州市區(qū)不同養(yǎng)殖場圍產期陽性奶牛奶樣88份進行了細菌學分析，以期望為奶牛子宮內膜炎病的防控提供理論依據(jù)，引導人們科學健康地養(yǎng)殖奶牛。

1 材料與方法

1.1 試驗被檢牛 2016年5月至2017年4月期間，對鄭州市8個奶牛場確診患有子宮內膜炎的奶牛共88頭子宮內容物進行了取樣，用于奶牛子宮內膜炎細菌分離和鑒定，同時隨機抽取圍產期奶牛進行流行病學調查。

1.2 試驗器材 德國Eppendorf移液器系列，海爾超低溫冰箱，上海精宏全溫振蕩培養(yǎng)箱(HZP-250)，上海精宏電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9140A)，無菌操作臺一架，奧林巴斯CKX41-A32RC型顯微鏡，載玻片，蓋玻片，血瓊脂培養(yǎng)基，改良沙氏瓊脂培養(yǎng)基，普通瓊脂培養(yǎng)基，普通肉湯培養(yǎng)基，雙抗巧克力瓊脂培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基等，培養(yǎng)皿，無菌試管若干，酒精燈，接種環(huán)，壓力鍋，恒溫培養(yǎng)箱，電冰箱和染色液等。

1.3 統(tǒng)計學方法 資料輸入計算機，經核對后用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用t檢驗，以P<0.05時差異顯著，P<0.01差異極顯著。

2 方法

2.1 病原菌分離方法

2.1.1 樣品的采集 將確診子宮內膜炎的患牛進行保定，消毒液清洗外陰部，然后采集子宮內容物。抽取的內容物迅速放入滅菌低溫肉湯A培養(yǎng)基中帶回實驗室做病原菌的分離和鑒定，同時采集沒有患子宮內膜炎的奶牛樣品進行對照。

2.1.2 細菌分離培養(yǎng) 將采集到的樣品接種于肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，取一部分分別接種到血液瓊脂平板等，進行有氧和厭氧等篩選鑒定培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)物生長情況和菌落形態(tài)特征，并進行記錄，同時，挑取生長狀態(tài)不同的菌落，進行革蘭染色和鏡檢，根據(jù)菌落的染色特性并結合菌落形態(tài)和生長特征，進行涂片、火焰固定、革蘭染色后鏡檢，根據(jù)培養(yǎng)物鏡檢結果，選擇特征性菌落接種血瓊脂培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基，置恒溫箱72 h重新培養(yǎng)，供細菌鑒定使用。

2.1.3 細菌涂片、革蘭染色和鏡檢 火焰灼燒接種環(huán)，取少量蒸餾水于載玻片，然后取少量菌落在水中混合后涂勻，干燥后進行火焰固定，抹片上滴加草酸銨結晶紫溶液1 min水洗，加革蘭碘液媒染1 min水洗，加95%酒精10～30 s水洗脫色，再滴加石碳酸復紅復染30 s水洗，自然干燥鏡檢。

2.2 細菌鑒定方法

2.2.1 細菌培養(yǎng)特性鑒定 將細菌接種培養(yǎng)基培養(yǎng)后，觀察有無菌落生長，菌落形態(tài)、大小、特征、顏色等。鏈球菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長不良或不生長，在血瓊脂上生長為細小光滑、扁平或突起、邊緣整齊白色菌落，進行記錄。肉湯接種培養(yǎng)后，觀察肉湯透明度、渾濁程度、是否管底有沉淀物、沉淀物特征、管壁是否有附著物，是否出現(xiàn)菌臘膜、菌環(huán)等。

2.2.2 細菌染色鏡檢和生化鑒定 細菌涂片后，使用革蘭染色法染色，將染色后的涂片鏡檢，革蘭陽性菌呈紫色，革蘭陰性菌呈紅色，用以區(qū)分細菌類別。染色后進行病原體鏡檢，主要觀察細菌形態(tài)特征，根據(jù)病原菌大小、形態(tài)、有無莢膜、芽孢等特征進行細菌鑒定。對經培養(yǎng)特性、形態(tài)學檢查初步鑒定的菌株進行進一步的生化鑒定。

3 結果

3.1 不同奶牛場奶牛子宮內膜炎流行病學調查結果 在做細菌分離鑒定的同時，隨機對所在8個奶牛場圍產期奶牛子宮內膜炎進行了流行病學調查，結果見表1，從表1可知，在不同的規(guī)模的8個奶牛場檢測出奶牛子宮內膜炎平均陽性率為20.26%。其中陽性率最低的是規(guī)?；B(yǎng)殖場，平均陽性率為8.76%，養(yǎng)殖小區(qū)牛場陽性率最高，達到34.57%，普通養(yǎng)殖場奶牛子宮內膜炎的平均陽性率為28.57%。檢測結果表明，鄭州市奶牛場奶牛子宮內膜炎感染較為普遍，不同奶牛場子宮內膜炎陽性率差異極顯著(P<0.01)，尤其以養(yǎng)殖小區(qū)最為嚴重，結果如圖1所示。

表1 不同奶牛場奶牛子宮內膜炎流行病學調查結果

圖1不同規(guī)模養(yǎng)殖場奶牛子宮內膜炎陽性率

3.2 細菌鑒定結果 本次試驗對88份奶牛子宮內膜炎樣品進行細菌分離鑒定，結果如表1所示，此次試驗共檢出細菌56株，革蘭陰性菌24株，革蘭陽性菌32株，結果如表3所示。檢出菌中，金黃色葡萄球菌7株，占7.95%；大腸埃希菌12株，占細菌總數(shù)的13.64%；產吲哚金黃桿菌、停乳鏈球菌和蘇云金芽孢桿菌各4珠，占細菌總數(shù)的4.55%；蠟樣芽孢桿菌、表皮葡萄球菌和乳房鏈球菌各5株，占細菌總數(shù)的5.68%；淺黃金色單胞菌3株，占細菌總數(shù)的3.41%；奧斯陸莫拉菌、成團泛菌和產堿假單胞菌各2珠，占細菌總數(shù)的2.27%；棒狀桿菌屬檢出1株，占檢出細菌總數(shù)的1.14%；其中，在分離出細菌的88份樣品中，大部分為混合感染。通過以上數(shù)據(jù)分析顯示，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、奧斯陸莫拉菌和蠟樣芽孢桿菌為鄭州市被檢測奶牛場奶牛子宮內膜炎的主要致病菌。

表1 細菌分離鑒定結果

3.3 不同奶牛場子宮內膜炎感染細菌的優(yōu)勢菌群 在8個不同的奶牛場奶牛子宮內膜炎檢測樣品中，養(yǎng)殖小區(qū)牛場檢出菌30株，金黃色葡萄球菌7株，大腸埃希菌4株，表皮葡萄球菌和蘇云金芽孢桿菌各3珠，產吲哚金黃桿菌、淺黃金色單胞菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和成團泛菌各2株，蠟樣芽孢桿菌、棒狀桿菌屬和產堿假單胞菌各1珠，細菌種類較雜，其優(yōu)勢菌群為金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌；普通養(yǎng)殖場檢出菌共16株，其中金黃色葡萄球菌、淺黃金色單胞菌、停乳鏈球菌、表皮葡萄球菌和蘇云金芽孢桿菌各1珠，產吲哚金黃桿菌、奧斯陸莫拉菌和乳房鏈球菌各2株，大腸埃希菌和蠟樣芽孢桿菌各3株，其優(yōu)勢菌群為大腸埃希菌和蠟樣芽孢桿菌；規(guī)?；B(yǎng)殖場共檢出菌10株，金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌各2株，淺黃金色單胞菌、蠟樣芽孢桿菌、停乳鏈球菌、表皮葡萄球菌、乳房鏈球菌和產堿假單胞菌各1珠，其優(yōu)勢菌群為金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌，結果見表2。

4 討論

4.1 奶牛子宮內膜炎是導致奶牛被淘汰的主要疾病之一，主要原因是由病原微生物感染所引起的[3]，所以本試驗的主要目的是進行病原菌的分離鑒定，同時，進行了奶牛子宮內膜炎的流行病學調查，在不同規(guī)模的8個奶牛場檢測奶牛459頭，檢出子宮內膜炎陽性奶牛93頭，平均頭數(shù)陽性率為20.26%。其中陽性率最低的規(guī)?；B(yǎng)殖場，平均陽性率為8.76%，養(yǎng)殖小區(qū)牛場陽性率最高，平均陽性率達到34.57%，說明奶牛子宮內膜炎的發(fā)生率與飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生條件差密切相關，飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生差的養(yǎng)殖小區(qū)要比規(guī)?；B(yǎng)殖場子宮內膜炎感染率高，且差異極顯著(P<0.01)，說明較好的飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生是預防奶牛子宮內膜炎的必要條件。

4.2 本試驗通過對子宮內膜炎陽性奶牛進行病原菌分離和鑒定檢測，在被確定為子宮內膜炎患牛的陽性樣本88份，經細菌學分離培養(yǎng)，共檢出細菌56株，革蘭陰性菌24株，革蘭陽性菌32株，從試驗結果分析可知，奶牛子宮內膜炎的發(fā)生主要是由病原微生物引起，應加強平時對病原微生物的監(jiān)測，切斷奶牛子宮內膜炎傳染源的傳播。

4.3 本試驗細菌學鑒定，因受各種因素的影響，只能采用綜合判定方法，本次試驗采用南京農業(yè)大學陸承平編寫的獸醫(yī)微生物學和伯杰氏細菌鑒定手冊(第八版)資料中方法進行試驗，試驗結果表明，對88份乳樣進行細菌分離鑒定，共檢出細菌56株，其中有12株為金黃色葡萄球菌、7株為大腸埃希菌，說明這兩種細菌為鄭州市奶牛場奶牛子宮內膜炎的主要致病菌，這為以后子宮內膜炎的預防提供了有力的科學依據(jù)。

表2 不同奶牛場細菌感染優(yōu)勢菌群檢測結果

4.4 奶牛子宮內膜炎病原微生物的傳播方式可分為傳染性和環(huán)境性兩大類，圍產期奶牛的發(fā)病率較高，可能的原因是由于奶牛分娩過程中子宮口打開，病原微生物容易進入子宮，同時子宮內此時有充足的血液供應、子宮內適宜的pH值、水分和合適的溫度[4]，為進入子宮內的細菌繁殖提供了條件，所以奶牛子宮內膜炎的發(fā)病率較高，應加強圍產期奶牛的環(huán)境衛(wèi)生管理，降低病原在奶牛養(yǎng)殖間的相互傳播機率。