遼寧絨山羊副結(jié)核分枝桿菌的分離鑒定及分子生物學(xué)檢測(cè)

宋先忱，李 冰，朱延旭，張興會(huì)，王世泉，郭 伶，徐 鵬，郭維軍，劉孝剛

(1遼寧省畜牧科學(xué)研究院，遼寧遼陽(yáng)111000 ； 2.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001 ；3.錦州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧錦州121002)

副結(jié)核病是由副結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性、消耗性傳染病，以頑固性腹瀉、逐漸消瘦、腸黏膜增厚為特征。主要感染牛、羊、鹿等反芻動(dòng)物。該病1958年在地中海首次發(fā)現(xiàn)，同期我國(guó)內(nèi)蒙古也發(fā)現(xiàn)了1例，隨后該病迅速蔓延至全國(guó)大部分地區(qū)[1-2]，給我國(guó)牛羊飼養(yǎng)業(yè)帶來(lái)了極大損失[3]。

遼寧南部地區(qū)某絨山羊養(yǎng)殖場(chǎng)，有少部分母羊產(chǎn)羔后陸續(xù)出現(xiàn)頑固性腹瀉、逐漸消瘦，后期食欲廢絕而衰竭死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)回腸和結(jié)腸腸黏膜增厚、腸系膜淋巴結(jié)水腫、脾臟明顯萎縮等一系列臨床癥狀和剖檢病變，初步診斷為副結(jié)核病[3]，為了對(duì)本病進(jìn)一步確診，同時(shí)為今后絨山羊副結(jié)核病的診斷與防控工作提供科學(xué)依據(jù)，開(kāi)展了本項(xiàng)試驗(yàn)工作。

1 材料與方法

1.1 病原分離鑒定

1.1.1 材料 病料來(lái)源，遼寧南部地區(qū)某絨山羊養(yǎng)殖場(chǎng)疑似副結(jié)核病羊1只，剖檢后無(wú)菌操作采取心、肺、肝、脾、腎、腸系膜淋巴結(jié)及腸道內(nèi)容物。

Dubods油酸瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自招遠(yuǎn)拓普生物工程有限公司；石炭酸復(fù)紅溶液、3%鹽酸酒精(脫色劑)、堿性美藍(lán)復(fù)染(復(fù)染液)均由本校微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 方法 將心、肺、肝、脾、腎、腸系膜淋巴結(jié)6個(gè)部位的病料先用4%H2SO4處理30 min，經(jīng)中和后再無(wú)菌操作接種到Dubods油酸瓊脂培養(yǎng)基上，腸內(nèi)容物及黏膜用刀片刮取，放入40 mL、0.75%HPC(氯化十六烷基吡啶)塑料管中，于室溫下豎立48 h后以去污染物，再用滴管吸取沉淀物上層液體，接種于培養(yǎng)基中。

在37 ℃條件下培養(yǎng)9～13周，詳細(xì)觀察菌株生長(zhǎng)情況，前8周每2周觀察1次，后5周每2 d觀察1次。出現(xiàn)疑似菌落樣品，挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行抗酸染色鏡檢，觀察是否符合副結(jié)核分支桿菌的形態(tài)特征。

2 分離菌的PCR檢測(cè)

2.1 材料 DL-2 000 Marker，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；2×TaqMaster Mix(含染料)，購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；核酸染料；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自北京天根生物工程技術(shù)有限公司；小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。

2.2 方法

2.2.1 引物的設(shè)計(jì) 選擇王素華[4]設(shè)計(jì)的副結(jié)核分枝桿菌特性引物，預(yù)期產(chǎn)物246 bp，引物由(上海)生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 特異性引物相關(guān)信息

2.2.2 細(xì)菌基因組DNA提取 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)介紹的方法提取基因組。提取的基因組，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 PCR擴(kuò)增 94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min，最終4 ℃保存。PCR反應(yīng)體系30 μL：模板3 μL、2×TaqMaster Mix 15 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 10 μL。

2.2.4 PCR產(chǎn)物電泳：PCR擴(kuò)增后經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，取5 μL DNA Marker和5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加到樣品孔，在1xTAE電泳緩沖液中，120 V 電壓電泳30 min，在凝膠系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

2.2.5 PCR產(chǎn)物序列測(cè)定與分析：將PCR 產(chǎn)物膠回收，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將結(jié)果與GenBank中的基因序列進(jìn)行比較分析。

3 結(jié)果

3.1 病原分離鑒定結(jié)果 經(jīng)過(guò)9～13周培養(yǎng)后，在接種肝臟病料的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出乳白色、光滑、邊緣整齊的菌落，見(jiàn)中插彩版圖1，在接種心、肺、脾、腎、腸系膜淋巴結(jié)及腸內(nèi)容物的6個(gè)培養(yǎng)基上沒(méi)有長(zhǎng)出上述形態(tài)的菌落，只有一些雜菌生長(zhǎng)。挑取疑似單個(gè)菌落進(jìn)行抗酸染色鏡檢后，可見(jiàn)不規(guī)則(單個(gè)、成叢)的紅色短小桿菌，見(jiàn)中插彩版圖2。

3.2 PCR檢測(cè)結(jié)果 提取DNA基因組，對(duì)所分離出來(lái)的疑似羊副結(jié)核分支桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物上樣量每孔5 μL，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以DL-2 000 Plus DNA Marker為標(biāo)準(zhǔn)，可見(jiàn)在246 bp左右有明顯的目的條帶，與預(yù)期的目的條帶大小一致，見(jiàn)圖3。

3.3 測(cè)序分析結(jié)果 目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果為246 bp，見(jiàn)圖4。通過(guò)BLAST在線比對(duì)，同源性在95%以上的有16株，其中與JⅡ-1961(CP022105.1)菌株同源性達(dá)100%，進(jìn)一步證實(shí)了分離菌株為副結(jié)核分支桿菌。

圖3 羊副結(jié)核分支桿菌PCR鑒定結(jié)果注：M∶DL-2 000 Plus DNA Marker ； 1：分離菌株 ； 2：陰性對(duì)照

圖4目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

4 討論

副結(jié)核分枝桿菌主要從感染患病動(dòng)物的糞便或內(nèi)臟組織中分離獲得，由于副結(jié)核病潛伏期長(zhǎng)以及副結(jié)核分枝桿菌對(duì)培養(yǎng)基要求條件苛刻，造成該病原體初代分離非常困難，一般需要6～8周的時(shí)間才能生長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌落，長(zhǎng)者可達(dá)6個(gè)月[5]。所以國(guó)內(nèi)關(guān)于該病的病原分離鑒定方面的研究報(bào)道很少，吳建勇等[6]采集新疆地區(qū)發(fā)病奶牛的糞便病料，在HEYM培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)8～12周時(shí)間成功培養(yǎng)出副結(jié)核分枝桿菌，并經(jīng)PCR檢測(cè)和基因序列比對(duì)分析證實(shí)新疆地區(qū)規(guī)?；膛?chǎng)中存在副結(jié)核分枝桿菌感染。

本試驗(yàn)采集遼寧地區(qū)發(fā)病絨山羊的內(nèi)臟組織和腸內(nèi)容物病料，在Dubods油酸瓊脂培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)37 ℃、9～13周時(shí)間培養(yǎng)，經(jīng)抗酸染色鏡檢結(jié)果表明，從發(fā)病羊的肝臟組織中成功分離出一株副結(jié)核分枝桿菌，并經(jīng)PCR檢測(cè)和基因序列比對(duì)分析進(jìn)一步證實(shí)了分離菌即為副結(jié)核分枝桿菌。從而首次證實(shí)遼寧地區(qū)絨山羊飼養(yǎng)場(chǎng)中存在副結(jié)核分枝桿菌感染。

副結(jié)核分枝桿菌主要存在于感染患病動(dòng)物的糞便或內(nèi)臟組織中，本研究在同一只發(fā)病羊的肝臟中分離出副結(jié)核分枝桿菌，而在心、肺、脾、腎、腸系膜淋巴結(jié)及腸內(nèi)容物6種病料組織中沒(méi)有分離出副結(jié)核分枝桿菌，分析其中原因，可能與不同發(fā)病時(shí)期各內(nèi)臟組織中的帶菌量有關(guān)，具體原因還有待于進(jìn)一步研究探討。

關(guān)于副結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)時(shí)間，各種文獻(xiàn)說(shuō)法不一，有6～8周或6個(gè)月[7]、5～14周[2]、8～12周[6]等，本試驗(yàn)為9～13周。筆者認(rèn)為培養(yǎng)時(shí)間不存在絕對(duì)性，主要與使用的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)基的pH值有關(guān)，目前使用的培養(yǎng)基均不夠理想，建議應(yīng)加強(qiáng)副結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基篩選和優(yōu)化方面的研究，應(yīng)該有很大的提升空間。

遼寧省是遼寧絨山羊的主產(chǎn)區(qū)，飼養(yǎng)規(guī)模已超過(guò)300萬(wàn)只，最新血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，遼寧絨山羊主產(chǎn)區(qū)副結(jié)核病的感染率已超過(guò)10%，本試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了遼寧地區(qū)絨山羊飼養(yǎng)場(chǎng)中副結(jié)核病的存在，建議相關(guān)部門(mén)應(yīng)重視絨山羊副結(jié)核病的防控工作，保障遼寧絨山羊飼養(yǎng)業(yè)的健康發(fā)展。