犬臍帶間充質(zhì)干細胞抗關(guān)節(jié)炎炎癥反應的研究

張貝瑩，王丙云，羅冬章，詹小舒，陳勝鋒，陳志勝，計慧琴，白銀山

(佛山科學技術(shù)學院生命科學與工程學院，廣東佛山528231)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是犬最常見的關(guān)節(jié)病之一。近年來該病呈持續(xù)增加的趨勢，對寵物犬的健康與福利造成了嚴重的損害，引起了全世界獸醫(yī)界的關(guān)注。骨關(guān)節(jié)炎實際上并非簡單的炎癥，而是一種由多種因素導致，以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞與骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病。相關(guān)研究表明，大量OA患者存在滑膜炎，且患者關(guān)節(jié)的炎癥和OA的進展有直接關(guān)系，促炎細胞因子、活性氧(ROS)、一氧化氮、基質(zhì)降解酶和生物力學應激是導致OA形成的主要因素[1]。大量炎癥細胞因子參與了軟骨新陳代謝活動，可在相互作用下，對軟骨細胞造成破壞，如白細胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、血管內(nèi)皮細胞因子(VEGF)等[2-3]。

由于目前缺乏有效治療OA的方法，因此更好地了解OA中的炎性病理生理學，可在OA早期識別其慢性低度炎癥從而改善患者炎癥和疼痛的等癥狀，同時有助于發(fā)現(xiàn)有效減少關(guān)節(jié)破壞性變化并預防永久性功能障礙的新方法[4]。目前基于細胞治療的新型OA療法已成為新興的研究和開發(fā)領(lǐng)域，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可促進組織的修復或再生，具有抗炎的潛能[5]。其中，臍帶來源的間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs)具有獲取容易、擴增能力強、歸巢性良好、免疫原性低、分化為軟骨細胞的潛能和無致瘤性等諸多優(yōu)點，具有巨大的應用前景[6]。

本試驗通過手術(shù)打磨膝關(guān)節(jié)軟骨建立犬關(guān)節(jié)炎模型，將異體UC-MSCs懸液注入試驗犬膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，通過測定試驗犬的體溫、血常規(guī)與生化指標以及炎性因子等指標，對比研究UC-MSCs對犬膝關(guān)節(jié)炎的抗炎效果，為探討一種安全、經(jīng)濟、簡便并易于向臨床推廣的治療關(guān)節(jié)炎的細胞療法提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 5-6月齡健康中華田園犬8只(體重約7 kg/只、雌雄各半)，隨機分為模型組和治療組，每組4只。

1.2 主要試劑 臍帶間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基(Cyagen公司)；IL-6、IL-7和TNF-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；ALP、TP、ALB、BUN、CREA、Pi和Ca2+檢測試劑盒(上海科華生物工程股份有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 犬UC-MSCs的制備 取犬的臍帶華通膠，0.1%Ⅰ型膠原酶消化分離獲得UC-MSCs后，過濾、離心，重懸細胞后移至35 mm培養(yǎng)皿中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2 d后PBS洗滌換液。待細胞鋪滿細胞培養(yǎng)板80%～90%時，0.25%胰酶消化進行傳代培養(yǎng)，取第3代UC-MSCs作為治療細胞。

1.3.2 犬OA模型的建立 試驗犬采用丙泊酚及異氟烷配合麻醉，取犬左側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)在無菌條件下進行手術(shù)。打開膝關(guān)節(jié)通路，暴露滑車關(guān)節(jié)面，將髕骨推出膝關(guān)節(jié)，使用關(guān)節(jié)打磨鉆，高速檔、夾持刷鉆鉆頭對膝關(guān)節(jié)軟骨面進行打磨，直至將滑車脊和滑車槽軟骨面全部打磨掉為止，然后縫合膝關(guān)節(jié)，并調(diào)整好髕骨位置。

1.3.3 UC-MSCs注射治療OA方法 患肢膝關(guān)節(jié)局部剪毛消毒，采用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射UC-MSCs治療方法。將針頭沿髕骨下緣刺入皮膚，借助B超觀察患犬膝關(guān)節(jié)外側(cè)，當針尖到達低回聲區(qū)域(含關(guān)節(jié)液的關(guān)節(jié)腔)時，將1 mL注射液注入關(guān)節(jié)腔。即術(shù)后第1天和第3天模型組每只犬注射1 mL生理鹽水，治療組每只犬注射1 mL含1×106個UC-MSCs的細胞懸液。

實驗犬術(shù)后7 d內(nèi)正常使用抗菌消炎和鎮(zhèn)痛藥物(氨芐西林1.5 mL/只4 d，頭孢1.5 mL/只3 d)，每天對傷口進行清潔消毒。

1.3.4 采血 干細胞治療后第3、7、14、28天時在每只實驗犬后肢外側(cè)小隱靜脈或前肢內(nèi)側(cè)頭靜脈采血5 mL，置于抗凝管。取1 mL血液按全國臨床檢驗操作規(guī)程(第四版)進行血常規(guī)檢測；取4 mL血液 2 500 r/min離心10 min制備血漿，-80 ℃超低溫保存?zhèn)溆谩Ｓ迷噭┖袡z測犬血液中ALP、TP、ALB、BUN、CREA、Pi、Ca2+等血生化指標，測定方法按照說明書進行；用ELISA試劑盒檢測犬血液中IL-6、IL-7和TNF-α三種炎性因子。

2 結(jié)果

2.1 飲食及運動情況 手術(shù)造模后，實驗犬的左側(cè)后肢疼痛腫脹、跛行，但飲食正常、精神狀況良好，傷口恢復良好。

2.2 體溫變化情況 實驗犬治療后，模型組體溫迅速升高并持續(xù)在39 ℃以上，治療后10 d內(nèi)體溫平均值高于治療組體溫平均值，第3周模型組體溫小幅度上升后恢復正常；治療組體溫于治療后體溫均低于39 ℃，在第11天有小幅度升高，持續(xù)3 d后恢復正常(見圖1)；其中治療后5 d時模型組犬的體溫極顯著高于治療組(P<0.01)；治療后6 d和10 d時模型組與治療組實驗犬體溫有顯著性差異(P<0.05)(見圖1和表1)。

2.3 血常規(guī)檢測結(jié)果 由表2可見：(1)UC-MSCs能抑制WBC的滲出和嗜中性粒細胞的產(chǎn)生：模型組的實驗犬WBC和嗜中性粒細胞的數(shù)量在治療3 d后平均值分別為21.66×109/L和11.91×109/L，均高于正常范圍，而治療組的WBC和嗜中性粒細胞數(shù)值均在正常范圍內(nèi)，模型組和治療組的WBC數(shù)量有極顯著差異(P<0.01)；治療14 d后，模型組的嗜中性粒細胞顯著高于治療組(P<0.05)；模型組的淋巴細胞在治療3 d時開始低于治療組，直至28 d時有顯著性差異；兩組的淋巴細胞百分比值在造模治療后均增加，但模型組的淋巴細胞百分比值低于治療組，在3 d時有顯著差異(P<0.05)；模型組的嗜酸性粒細胞及其百分比在治療3 d時顯著低于治療組(P<0.05)。

圖1試驗犬體溫變化

表1 試驗犬經(jīng)UC-MSCs治療后體溫的變化 ℃)

*：組間差異顯著；**：組間差異極顯著。下表同

檢測指標單位組別治療3 d治療7 d治療14 d治療28 d白細胞數(shù) 109/L模型組治療組21.66±2.8412.35±2.77**9.17±3.6410.12±1.4512.67±1.8711.83±1.149.99±0.459.78±2.52嗜中性粒細胞數(shù)109/L模型組治療組11.91±5.024.46±1.39*2.89±1.602.81±0.535.06±1.083.54±0.45*3.41±0.344.02±1.58嗜酸性粒細胞數(shù)109/L模型組治療組0.03±0.020.02±0.010.01±0.010.03±0.02*0.10±0.160.07±0.080.02±0.010.03±0.03淋巴細胞數(shù)109/L模型組治療組2.91±0.653.47±0.773.43±0.734.28±0.284.61±0.994.36±0.953.21±0.123.71±0.31*嗜酸性粒細胞百分比(Eos% )%模型組治療組0.13±0.100.10±0.080.05±0.060.30±0.14*0.90±1.530.53±0.600.15±0.060.35±0.26淋巴細胞百分比(%) %模型組治療組13.98±5.4028.90±8.79*40.35±11.1443.00±6.9336.18±2.9436.68±5.1332.15±1.7539.30±8.23紅細胞數(shù) 1012/L模型組治療組5.42±0.065.42±0.384.68±0.395.42±0.36*5.27±0.155.72±0.555.53±0.335.17±0.58血紅蛋白g/dL模型組治療組112.00±3.56117.00±8.1696.50±8.35116.50±5.20**109.00±1.41119.00±12.30115.25±5.56114.50±9.95平均紅細胞血紅蛋白含量 pg模型組治療組20.68±0.6321.58±0.4320.63±0.5021.53±0.46*20.68±0.3420.80±0.5620.85±0.3122.23±0.63**平均紅細胞血紅蛋白濃度 g/L模型組治療組315.00±6.98326.00±0.82*319.25±13.40325.50±4.12317.75±4.65314.75±7.04317.50±1.29327.50±2.89**紅細胞分布寬度變異系數(shù)%模型組治療組15.50±1.1515.55±0.1915.75±1.5915.43±0.1715.45±1.0715.18±0.4216.20±0.8115.93±0.33血小板數(shù)目(PLT)109/L模型組治療組26.00±18.0271.25±61.9244.75±52.2058.50±14.6249.00±12.52150.50±65.96*269.50±258.7187.50±55.08血小板壓積(PCT)%模型組治療組0.03±0.020.08±0.080.05±0.060.07±0.020.05±0.010.15±0.05**0.21±0.190.09±0.07

(2)UC-MSCs促進機體淋巴細胞、RBC的產(chǎn)生：治療3 d后，模型組的平均紅細胞血紅蛋白濃度顯著低于治療組(P<0.05)，且在治療28 d后有極顯著差異(P<0.01)；治療7 d后，模型組的RBC、MCH、HCT顯著低于治療組(P<0.05)，且模型組的HGB極顯著低于治療組(P<0.01)，治療28 d后，模型組的MCH和MCHC均極顯著地低于治療組(P<0.01)。

(3)UC-MSCs促進PLT的產(chǎn)生：治療14 d后，模型組犬的PLT顯著低于治療組(P<0.05)，PCT極顯著低于治療組(P<0.01)。

(4)其余檢測指標情況：模型組的嗜中性粒細胞百分比(Neu%)高于治療組，平均紅細胞體積(MCV)則低于治療組；模型組的平均血小板體積(MPV)低于治療組而血小板分布寬度(PDW)高于治療組；但與嗜堿性粒細胞數(shù)(Bas#)、單核細胞數(shù)(Mon#)、嗜堿性粒細胞百分比(Bas%)、單核細胞百分比(Mon%)、紅細胞分布寬度變異系數(shù)(RDW-CV)、紅細胞分布寬度標準差(RDW-SD)等指標一樣，兩組間對比無顯著差異。

2.4 血生化指標檢測結(jié)果 由表3可見，在治療7 d時治療組的ALP極顯著低于模型組(P<0.01)，其他血生化指標無顯著差異。

檢測指標單位組別治療3 d治療7 d治療14 d治療28 d堿性磷酸酶U/L模型組治療組154.00±43.00108.50±9.26116.00±5.0091.00±6.05**101.00±20.00102.75±8.8599.00±14.0097.5±17.29總蛋白g/L模型組治療組52.00±3.0052.68±2.5451.00±3.0050.48±0.4047.00±3.0046.68±0.5146.00±2.0045.00±4.50球蛋白g/L模型組治療組23.00±2.0022.93±1.0721.00±3.0022.20±1.2221.00±2.0022.03±0.9123.00±1.0022.18±1.37白蛋白g/L模型組治療組29.00±2.0029.75±1.9230.00±3.0028.28±1.0226.00±4.0024.65±0.9124.00±2.0022.83±3.13尿素氮mmol/L模型組治療組6.00±1.005.65±1.006.00±3.007.98±0.746.00±1.006.87±0.676.00±1.006.53±1.25肌酐μmol/L模型組治療組47.00±1.0046.68±4.5748.00±8.0049.75±8.1844.00±3.0048.60±7.3748.00±4.0048.88±4.70磷mmol/L模型組治療組2.00±02.31±0.042.00±02.39±0.022.00±02.16±0.062.00±02.23±0.13鈣mmol/L模型組治療組3.00±03.18±0.063.00±03.21±0.063.00±02.90±0.043.00±02.95±0.16

2.5 炎性因子檢測結(jié)果 由表3可見，治療3 d和28 d時，模型組和治療組的IL-6、IL-7和TNF-α無明顯差異；治療7 d時，模型組的IL-6和TNF-α均顯著高于治療組(P<0.05)；治療14 d時，模型組與治療組的IL-6有極顯著差異(P<0.01)，同時IL-7和TNF-α均有顯著差異(P<0.05)。

檢測指標單位組別治療3 d治療7 d治療14 d治療28 d白介素-6(IL-6)pg/mL模型組治療組55.25±14.1848.95±4.7357.42±7.8840.29±6.56*56.76±4.0145.24±4.62**57.02±7.7554.14±5.35白介素-7(IL-7)pg/mL模型組治療組18.71±6.4716.39±2.2020.17±5.3213.34±1.9021.03±4.6713.66±3.03*22.23±3.4818.62±2.66腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ng/L模型組治療組107.95±29.9891.32±8.08112.02±20.2772.15±24.10*108.97±9.9966.99±26.38*107.58±5.7185.15±25.07

3 討論

目前的研究發(fā)現(xiàn)，OA的病理機制十分復雜，其中，炎癥介質(zhì)由軟骨、骨和滑膜釋放，低度炎癥由代謝引起，先天性免疫和炎癥反應促使OA的形成[7]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，疾病初期的炎癥機制主要是由于對關(guān)節(jié)機械刺激引起的損傷，細胞因子如IL-1，IL-4，IL-9，IL-13和TNF-α的釋放等原因可觸發(fā)OA的形成[8-9]。此外，炎癥在OA的疾病中的作用已通過關(guān)節(jié)積液與關(guān)節(jié)疼痛的關(guān)聯(lián)來識別，但是什么程度的炎癥反應會引起關(guān)節(jié)損傷尚不清楚[4]。

針對這一疾病特點，許多研究發(fā)現(xiàn)，MSC能通過分泌抗炎細胞因子和生長因子減緩OA的惡化，減輕OA的炎癥反應和患者的疼痛。MSC來源于中胚層，具有自我更新和多向分化潛能，可從多種組織器官(如骨髓、脂肪、胎盤和臍帶)中分離獲得。并具有歸巢性，能遷移到身體損傷部位分化成各種細胞系，如骨、脂肪、軟骨、肌肉和骨骼等[10-11]。而臍帶MSC因具有易于獲取、免疫原性低、無倫理性爭議等優(yōu)勢被廣泛應用于再生醫(yī)學當中[12-13]。

本試驗通過對OA模型進行對比治療，對比體溫結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射UC-MSCs的治療組實驗犬的體溫在前11 d均低于模型組，說明UC-MSCs能減輕機體發(fā)熱；血常規(guī)檢測指標結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療組的WBC和嗜中性粒細胞的數(shù)量于治療OA模型3 d時顯著低于模型組，而治療組的RBC、HGB和HCT在7 d時顯著高于模型組，說明UC-MSCs能有效抑制炎癥細胞產(chǎn)生，促進淋巴細胞和RBC的生成；PLT在治療14 d時顯著高于模型組，此外，治療組的MPV高于模型組，PDW則低于模型組但無顯著性差異，說明UC-MSCs可能有助于PLT更集中于損傷處；血生化指標結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在治療7 d時治療組的ALP極顯著低于模型組而其他指標無差異，臨床上測定ALP主要用于骨骼、肝膽系統(tǒng)疾病的診斷和鑒別診斷，治療組的ALP水平低于模型組，說明UC-MSCs對OA的修復有促進作用，而ALP亦有助于OA的檢測診斷。治療組的炎性因子IL-6、IL-7和TNF-α的水平在7～14 d顯著降低，但在3 d和28 d時，治療組的炎性因子水平與模型組無顯著差異，說明在OA模型早期，實驗犬體內(nèi)的炎性因子無顯著差異，但在7～14 d時，UC-MSCs能抑制炎性因子的產(chǎn)生，但抑制作用會隨著時間而降低；這些結(jié)果說明，UC-MSCs對關(guān)節(jié)炎的炎癥反應具有顯著的抑制作用，其機制可能是通過抑制白細胞和嗜中性粒細胞的產(chǎn)生來減輕機體發(fā)熱和炎癥反應，并通過抑制炎性因子的產(chǎn)生來減緩炎癥反應，同時通過促進機體淋巴細胞和紅細胞的產(chǎn)生來增強機體免疫能力和抗感染的能力，并通過增加血小板的產(chǎn)生促進血液凝固和傷口愈合。