豬流行性腹瀉病毒貴州株M全基因遺傳變異分析

田 琴,柳曉飛,張雙翔,胡興義,張 羽,田祥強(qiáng),潘 永,楊蘭蘭,王開(kāi)功,周碧君,文 明,程振濤

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025 ； 2. 貴州省動(dòng)物疫病研究室，貴州貴陽(yáng)550025 ;3.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽(yáng)550001)

豬流行性腹瀉病(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的接觸性腸道傳染病，各日齡的豬群均能感染，主要臨床癥狀表現(xiàn)為嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水，其中對(duì)哺乳仔豬危害最為嚴(yán)重。1978年英國(guó)首次報(bào)道PED后[1]，中國(guó)于1980年首次報(bào)道該病，隨后各省均有PEDV感染報(bào)道。2010年后，豬流行性腹瀉在全球各國(guó)均發(fā)生大面積的流行[2-3]。我國(guó)也不例外，從南到北出現(xiàn)全面暴發(fā)，特別是2013年以來(lái)，該病給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。

PEDV屬單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約28 kb，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白和3種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中，S基因編碼病毒纖突蛋白，該蛋白具有識(shí)別靶細(xì)胞可使病毒和細(xì)胞膜融合的作用，其在免疫反應(yīng)中起重要作用，因此分析當(dāng)?shù)豍EDV毒株的流行和遺傳變異情況具有重要價(jià)值[4]。M基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白是一種跨膜蛋白，在病毒組裝和出芽過(guò)程中起重要作用，保守性強(qiáng)，是作為檢測(cè)PEDV的重要靶基因，在PEDV侵染的早期可妨礙宿主細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄[5]。

目前，貴州省對(duì)PEDV的研究還側(cè)重于病原調(diào)查、抗體水平檢測(cè)等方面。對(duì)PEDV分子研究尚少，本試驗(yàn)對(duì)貴州省當(dāng)前PEDV流行毒株的M全基因進(jìn)行基因克隆和序列分析，為預(yù)防和控制PEDV提供有力的科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 陽(yáng)性樣本來(lái)源 2017年6月貴州省福泉某規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)，1～8日齡仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉、脫水和消瘦，采集腸道及內(nèi)容物進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)。

1.2 主要試劑 RNA及DNA提取試劑盒，購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司；Prime ScriptTMRTMaster Mix,購(gòu)自TaKaRa公司；E.Z.N.A.TMGelExtraction Kit膠回收試劑盒。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank收錄的PEDV M基因(登錄號(hào)：AF-353511)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，上游引物：5′-TACATGCGAATTGACCCCCT-3′，下游引物：5′-ATCCTTGTTA GTGGGTACACCG-3′，大小為681 bp，并送上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 樣本處理及核酸提取 將收集的腸道和內(nèi)容物用其滅菌PBS進(jìn)行研磨，-80 ℃凍融3次，離心取200 μL上清液加入1.5 mL離心管中，加入800 μL TRIZol，充分混勻并讓其靜置10 min，再加入200 μL氯仿，混勻靜置10 min，12 000 r/min離心 8 min，取上清移入2.0 mL吸附柱套中，12 000 r/min 離心1 min，棄掉收集管中液體，加入400 μL RinseA 12 000 r/min離心 1 min，棄掉收集管中液體，加入700 μL RinseB 12 000 r/min離心 1 min(重復(fù)1次)，空柱離心1 min，吸附柱移入1.5 mL離心管中，加入25 μL DEPC處理水，讓其靜置2 min，12 000 r/min離心 1 min，1.5 mL離心管中液體即為總RNA模板。

1.5 反轉(zhuǎn)錄及PEDV M全基因擴(kuò)增 反轉(zhuǎn)錄體系：2 μL Prime Script1step Enzyme Mix，2 μL RNA，6 μL RNase Freed H2O，其條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。PCR擴(kuò)增體系：cDNA 2.0 μL，2×TaqMix 12.5 μL，上游引物(10mol/L)1.0 μL，下游引物(10mol/L)1.0 μL，滅菌ddH2O 8.5 μL補(bǔ)至25 μL，其條件：94 ℃ 3 min，然后94 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min。

1.6 PEDV M基因克隆、測(cè)序和遺傳進(jìn)化樹(shù)分析 將RT- PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，與載體pMD19-T連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5-α感受態(tài)細(xì)胞，取陽(yáng)性菌液送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用DNAStar中的MegAlign對(duì)2株P(guān)EDV貴州流行毒株及國(guó)內(nèi)外登錄的26株參考毒株的M全基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹(shù)和同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV M全基因RT- PCR擴(kuò)增結(jié)果 將其擴(kuò)增產(chǎn)物取8 μL上樣于1.2%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)大小為681 bp的特異性擴(kuò)增片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。

圖1 PEDV M全基因RT- PCR擴(kuò)增結(jié)果

M:DL-2 000 Marker; 1-2:PEDV M全基因RT- PCR產(chǎn)物；

-:陰性對(duì)照

2.2 PEDV M全基因測(cè)序結(jié)果 經(jīng)克隆為陽(yáng)性的菌液送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序拼接，為了便于分析測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的不同地方26株P(guān)EDV流行毒株對(duì)比，證實(shí)獲得了2株P(guān)EDV M全基因序列，將其命名為GZFQ06-2017，M基因全長(zhǎng)為681 bp，編碼226個(gè)氨基酸。

2.3 PEDV M全基因的核苷酸序列的同源性分析 利用DNAStar軟件對(duì)PEDV M全基因的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。由表1可知，GZFQ06-2017 PEDV M基因與GenBank 公布的26株參考序列(除韓國(guó)毒株SM98)的核苷酸相似性為94.0%～95.2%，與中國(guó)福建CH/FJZZ-9/201毒株和中國(guó)海南CH/HNQX-3/14毒株核苷酸相似性最低，為94.0%，與中國(guó)江蘇SQ2014毒株核苷酸相似性最高，為95.2%。表明貴州省2017年6月GZFQ06-2017毒株與過(guò)去的分離毒株存在突變。

表1PEDVM全基因核苷酸序列同源性比較

2.4 PEDV M全基因遺傳進(jìn)化樹(shù)分析 應(yīng)用MegAlign等軟件對(duì)測(cè)序序列與參考序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)繪制，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果(見(jiàn)圖2)。GZFQ06-2017為本試驗(yàn)經(jīng)克隆得到的序列，從遺傳進(jìn)化樹(shù)可以看出，除韓國(guó)毒株SM98外，2017年6月貴州省PEDV流行毒株GZFQ06-2017與韓國(guó)疫苗株Attenuated DR13、中國(guó)江蘇SQ2014、中國(guó)四川SC1402毒株和中國(guó)新疆CH/S在同一分支上，其親緣關(guān)系較近；與中國(guó)湖北CH-hubei-2016、中國(guó)云南CH/YNKM-8/2013親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；而經(jīng)典毒株CV777與1986年中國(guó)新疆CH/S毒株在同一分支上?？梢酝茰y(cè)貴州的PEDV流行毒株M全基因與過(guò)往或者其他國(guó)家(或地區(qū))相比出現(xiàn)一定的變異，但是仍然與經(jīng)典毒株CV777、韓國(guó)疫苗株Attenuated DR13、中國(guó)江蘇SQ2014、中國(guó)四川SC1402和1986年中國(guó)新疆CH/S分支相距將近，推導(dǎo)親緣關(guān)系較近。

3 討論

PEDV是20世紀(jì)70年代報(bào)道以來(lái)，是導(dǎo)致豬病毒性腹瀉的最主要的病原之一，感染后仔豬表現(xiàn)嚴(yán)重嘔吐、水樣腹瀉和脫水直至死亡等臨床癥狀，該病毒的體外繁殖一直困擾著該病的深入研究[6]。過(guò)去，研究人員采用多種方法試圖使病毒適于細(xì)胞培養(yǎng)，先后以PK-15細(xì)胞、BHK細(xì)胞和人肺細(xì)胞等進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，但均沒(méi)有成功，直到1988年 Hofmann 等在培養(yǎng)液中加入胰酶，使PEDV成功地適應(yīng)于Vero傳代細(xì)胞[7]。貴州省2010冬季以來(lái)受到豬病毒性腹瀉的肆虐，其中，PED每年冬春季節(jié)發(fā)病率和病死率都在逐年增加，因此該病的流行一直受到人們的廣泛關(guān)注。

圖2PEDVM全基因核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

雖然PEDV只有一種血清型，但是分子生物學(xué)的分析結(jié)果表明，PEDV的基因組存在基因多樣性[8]。其中，PEDV M基因全長(zhǎng)681 bp，編碼226個(gè)氨基酸，構(gòu)成病毒的表面結(jié)構(gòu)蛋白，分子量為27 kDa～32 kDa，是一種跨膜糖蛋白。M蛋白無(wú)信號(hào)肽，預(yù)測(cè)具有3個(gè)跨膜區(qū)域，包含兩個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分別位于病毒外面的氨基末端結(jié)構(gòu)域和病毒內(nèi)部的羧基結(jié)構(gòu)域，且保守性相對(duì)較高。有研究表明，M蛋白可以與M蛋白自身、N蛋白和S蛋白相互作用，在病毒組裝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道，同屬于冠狀病毒科的SARS病毒其M蛋白具有干擾素拮抗活性。因此M蛋白常被研究者作為檢測(cè)PEDV引物設(shè)計(jì)的首選，同時(shí)M蛋白可以作為PEDV基因工程疫苗的候選抗原[9]。

本研究利用RT -PCR成功檢測(cè)到2017年6月貴州省福泉某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)8日齡左右的哺乳仔豬僅存在PEDV感染，對(duì)其中2份陽(yáng)性樣品的PEDV M基因進(jìn)行克隆和序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2株P(guān)EDV貴州流行毒株M基因與GenBank上公布的26株P(guān)EDV M 基因序列進(jìn)行比對(duì)，GZFQ06-2017 PEDV M基因與參考序列(除韓國(guó)毒株SM98)的核苷酸相似性為94.0%～95.2%，與中國(guó)福建CH/FJZZ-9/201毒株和海南CH/HNQX-3/14毒株核苷酸相似性最低，為94.0%；與中國(guó)江蘇SQ2014毒株核苷酸相似性最高，達(dá)95.2%。推測(cè)貴州省2017年6月GZFQ06-2017毒株與過(guò)去的分離毒株存在較大的基因突變。 M基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果表明，GZFQ06-2017 PEDV流行毒株與韓國(guó)疫苗株Attenuated DR13、中國(guó)江蘇SQ2014和中國(guó)四川SC1402毒株分支相距較近，而與經(jīng)典毒株CV777與1986年中國(guó)新疆CH/S毒株在分支相近，得出其親緣關(guān)系較近；與中國(guó)湖北CH-hubei-2016和中國(guó)云南CH/YNKM- 8/2013親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?？梢酝茖?dǎo)目前貴州的PEDV GZFQ06-2017 M全基因與過(guò)往其他國(guó)家(或地區(qū))相比出現(xiàn)較大的差異。說(shuō)明近年來(lái)貴州省不同地區(qū)的PEDV流行毒株的M基因變異性大，這與過(guò)去的研究結(jié)果類(lèi)似。