賽黑樺組織培養(yǎng)技術(shù)研究

蔣祥娥 西川浩已

摘 要： 以賽黑樺休眠枝萌發(fā)的腋芽為外植體，研究了不同種類和不同濃度植物激素對賽黑樺外植體誘導(dǎo)、愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽增殖和生根等環(huán)節(jié)的影響。結(jié)果表明：①外植體芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)以WPM +6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1為最佳培養(yǎng)基； ②愈傷組織誘導(dǎo)以WPM+6-BA1.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1為最佳培養(yǎng)基；③在芽增殖培養(yǎng)中以WPM+6-BA0.1 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1增殖效果最好，增殖系數(shù)達4.0；④生根培養(yǎng)以WPM+NAA0.05 mg·L-1效果最佳，生根率91.7%；⑤生根苗移栽成活率達90%以上。

關(guān)鍵詞： 中圖分類號：S792.189 文獻標識碼：A 文章編號：1004-3020（2018）04-0006-04

Abstract： The axillary buds sprouting from dormant shoots were used as explants to study the effects of plant hormones on explant induction， callus induction， adventitious proliferation and rooting. Results showed that： ①The medium of WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1was the best initiation culture medium： ②The medium of WPM+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1 was the best callus induction medium. ③The medium of WPM+6-BA 0.1 mg·L-1+ NAA0.02 mg·L-1 with propagation coefficient 4.0 was the best proliferation culture medium. ④The medium of WPM+NAA 0.05 mg·L-1 with rooting rate 91.7% was the best rooting culture medium. ⑤The survival rate of transplants was higher than 90%.

Key words： Betula schmidtii； tissue culture； regeneration

賽黑樺（Betula schmidtii）為樺木科（Betulaceae）樺木屬（Betula）的落葉喬木樹種，又名遼東樺、鐵樺木、赤榆，主要分布在中國東北部、日本本州中部以北，朝鮮、俄羅斯等地方。其生長緩慢，材質(zhì)致密，厚重堅硬，被稱為“比鋼鐵還要硬的樹”（世界之最：植物分冊），力學(xué)強度大，氣干密度為0.835～0.996 g·cm-3，適合做家具、地板及諸多特殊構(gòu)件及特殊工藝產(chǎn)品（鐵樺樹樹種與資源分布的考證）。目前有關(guān)賽黑樺的研究以分類學(xué)為主，涉及的內(nèi)容多是對賽黑樺與屬內(nèi)其他種間親緣關(guān)系的探討（樺樹ISSR—PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化、Discussions OU taxonomy of genus Betula in northeast China、利用RAPD標記技術(shù)對樺樹種間親緣關(guān)系的分析、Phylogenetic relationships of Betula species（Betulaceae）based on nuclear ADH and chloroplast matK sequences、Chemical evaluation of Betula species in Japan），其次是其木材構(gòu)造及物理力學(xué)性質(zhì)方面的研究（賽黑樺的構(gòu)造特征和物理力學(xué)性質(zhì)）。有關(guān)賽黑樺生長、良種選育、繁殖及其與環(huán)境關(guān)系的系統(tǒng)研究應(yīng)是今后研究的主要方向，本文首次揭示了植物激素對賽黑樺組織培養(yǎng)效果的影響，以期為賽黑樺的良種無性繁殖做些基礎(chǔ)工作。

1 材料與方法

1.1 材料的處理

供試品種為日本山梨縣賽黑樺優(yōu)良無性系，剪取長有飽滿腋芽及頂芽的休眠枝，用清水反復(fù)沖洗后，枝條上端要用錫紙包住，以防水分散失，放在恒溫室里進行水培。水培期間，每天換水1次并進行清洗，適時將水培枝條基部減掉一點，以免枝條分泌物將導(dǎo)管堵塞，導(dǎo)致枝條因缺水干枯。約2周左右，腋芽萌發(fā)出嫩枝。

1.2 試驗方法

（1）培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。以WPM為基本培養(yǎng)基，蔗糖濃度為25%，瓊脂為7 g·L-1，pH值5.7。培養(yǎng)基在121 ℃、131 kPa的條件下滅菌15 min。培養(yǎng)室溫度25±1 ℃，光照強度5 000 Lx，光周期16 h光照/8 h黑暗。

（2）無菌材料獲得。當腋芽長到3～4 cm時，在清水中滴入1～2滴洗滌劑，將芽放入清洗約5 min，再用清水反復(fù)漂洗干凈。在超凈工作臺內(nèi)，先用75%酒精浸泡30 s，然后在用3%的次氯酸鈉溶液消毒15 min，再用無菌水清洗3次，放在無菌濾紙上吸干水分，將兩頭切去1～2 mm后接入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

（3）芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)。將處理好的外植體接種于添加6-BA0.1、0.5、1.0 mg·L-1和NAA0.02、0.1、0.2 mg·L-1組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（表1），每瓶接一個外植體，每個處理重復(fù)15次，將接種好的培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)室里培養(yǎng)，每隔一周觀察生長情況，四周后統(tǒng)計芽誘導(dǎo)和愈傷組織產(chǎn)生情況。

（4）莖段愈傷組織誘導(dǎo)。將6-BA0、0.1、1 mg·L-1和NAA 0、0.02、0.2 mg·L-1及2，4-D 0.2、2.0 mg·L-1三種激素組合的15種處理的培養(yǎng)基中（表2）每個處理接種12個莖段，放培養(yǎng)室培養(yǎng)，20 d后調(diào)查愈傷組織生長情況，然后將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織接種到愈傷組織分化的培養(yǎng)基里。

（5）芽增殖培養(yǎng)。

將誘導(dǎo)的無菌苗切下，切成1.5 cm左右莖段，每段至少一個腋芽，轉(zhuǎn)接到添加6-BA0、0.1、1.0 mg·L-1和NAA0、0.02、0.2 mg·L-1、GA3 0、0.5、1.0 mg·L-1組合的15種處理的增殖培養(yǎng)基中（表3），5周后觀察試管苗生長情況。

（6）生根培養(yǎng)。

選取2 cm左右長、長勢好的無菌苗，接種到添加NAA0.05、0.1、0.2 mg·L-1和IBA0.1、0.5、1.0 mg·L-1的生根培養(yǎng)基中（表4），2周后可誘導(dǎo)出不定根，4周后開始觀察根的生長情況，統(tǒng)計生根率。

（7）煉苗移栽。

當幼苗在培養(yǎng)瓶中生根后，即可進行煉苗移栽。先將生根瓶苗連瓶拿到溫室內(nèi)煉苗1周，煉苗后將健壯的生根苗取出，用清水洗去根上附著的培養(yǎng)基，移栽到消毒準備好的蛭石∶珍珠巖=3∶1基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，淋透水，蓋上薄膜，置于溫室，注意遮蔭保濕，濕度控制在90%左右。10 d后逐漸揭開薄膜至完全過渡到自然條件。移栽后1周用消毒液進行1次殺菌，2周噴1次營養(yǎng)液。1 d噴2～3次水。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度植物激素對芽誘導(dǎo)的影響

由表1可見，在所設(shè)9個處理組合中，處理5培養(yǎng)條件為WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1時，芽的誘導(dǎo)率最高為86.7%，其次是處理4和7處理，誘導(dǎo)率達80.0%，但芽苗葉色發(fā)黃，從芽苗生長情況來看，處理5的芽苗長勢最好，苗高色綠。萌芽率最低的是處理9，僅為40.0%。在不同濃度激素配比的培養(yǎng)基中出現(xiàn)了不同程度的愈傷組織，除9號處理愈傷組織量少顏色是棕褐色外，其它處理顏色淺綠或深綠色、松散。由此得出適合賽黑樺芽的誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)條件為WPM+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。

2.2 不同濃度植物激素對莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表2可見，在培養(yǎng)基中不添加植物激素，不能誘導(dǎo)出愈傷組織；在所有添加植物激素的處理中均能誘導(dǎo)出愈傷組織，誘導(dǎo)率最低為50%，最高為100%。隨著激素6-BA濃度的升高，愈傷組織誘導(dǎo)率也隨之升高。6-BA+NAA與6-BA+2，4-D對賽黑樺莖段愈傷組織的誘導(dǎo)效果基本相同，因此適合賽黑樺愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為WPM+6-BA1.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1。

2.3 不同濃度植物激素對芽增殖的影響

由表3可見，不添加任何植物激素的WPM培養(yǎng)基中其基部不產(chǎn)生不定芽。添加一定濃度6-BA、NAA和GA3的培養(yǎng)基均有不同程度的不定芽產(chǎn)生，增殖系數(shù)最低為1.2，最高為4.0。隨著6-BA激素濃度增加，芽增殖系數(shù)呈上升趨勢；當添加NAA后，芽長勢情況較好，莖桿壯實，但隨著NAA濃度的增加，增殖系數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢，說明6-BA、NAA的配比濃度對芽增殖及長勢影響較大。在6-BA、GA3配比中，芽生長情況一般，植株偏矮，莖稈偏細，不利于煉苗移栽。綜合考慮，賽黑樺在增殖過程中的最佳培養(yǎng)條件為WPM+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1，增殖系數(shù)4.0，瓶苗長勢情況好，生長健壯，有利于后續(xù)煉苗移栽。

當最佳增殖培養(yǎng)基篩選出來后，根據(jù)多年經(jīng)驗，直接將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織接種到最佳增殖培養(yǎng)基中進行愈傷組織分化培養(yǎng)，沒有進行不同植物激素配比對愈傷組織分化的影響進行對比試驗。培養(yǎng)15 d后，脫分化產(chǎn)生綠色芽點，進一步分化產(chǎn)生不定芽。顏色淺的愈傷組織生長快、芽數(shù)多，而顏色深的愈傷組織生長緩慢，芽的誘導(dǎo)率低。棕褐色的愈傷組織芽的誘導(dǎo)率最低，有的根本就沒芽誘導(dǎo)出來，甚至最后褐化死亡。

2.4 不同植物激素對生根的影響

由表4可見，隨著NAA濃度的增加，生根率出現(xiàn)下降的趨勢，當NAA的濃度為0.05 mg·L-1時，生根率為91.7%，根粗壯且長勢較強，NAA為0.20 mg·L-1時，生根率為66.7%，且根細弱，表明較高濃度的NAA不利于根的生長。IBA的作用效果與NAA相似，也是隨著濃度的增加生根率呈下降趨勢，IBA濃度降為0.1 mg·L-1時，生根率最高為 83.3 %；IBA濃度增加至1.0 mg·L-1時，生根率僅為58.3%，且莖段切口有愈傷組織產(chǎn)生。綜合判斷，賽黑樺的最佳生根培養(yǎng)基為WPM+ NAA0.05 mg·L-1。

2.5 煉苗移栽

瓶苗生根后，煉苗1周，洗凈培養(yǎng)基，移栽在準備好的育苗基質(zhì)中進行煉苗，結(jié)果表明只要在前期對水分和溫度管理好，其成活率可以達到90%以上，并且后期長勢旺盛。

3 結(jié)論與討論

通過對賽黑樺腋芽的培養(yǎng)，探索出適宜腋芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為 WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，在培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生了愈傷組織，愈傷組織的產(chǎn)生在一定程度上影響了誘導(dǎo)系數(shù)，應(yīng)注意植物激素的濃度配比。芽增殖最適培養(yǎng)基為WPM+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1，增殖系數(shù)為4.0，莖段愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為WPM+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1，顏色淺的愈傷組織質(zhì)地較疏軟、突起較明顯，生長快、芽數(shù)多。在生根培養(yǎng)中，NAA比IBA對生根更有利，最佳生根培養(yǎng)基為WPM+ NAA0.05 mg·L-1，生根率達91.7%。在生根培養(yǎng)中，為了提高煉苗成活率，在可能的情況下生根培養(yǎng)盡可能放到溫度與外界一樣的環(huán)境中，這樣瓶苗逐步適應(yīng)了外界環(huán)境溫度變化，有利于葉表面蠟質(zhì)層的恢復(fù)。移栽時采用蛭石∶珍珠巖=3∶1為煉苗基質(zhì)，并在前期注意保持煉苗濕度，可以獲得賽黑樺組培苗90%以上的成活率。

參 考 文 獻

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（責(zé)任編輯：夏劍萍）